Tài liệu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen α globin gây bệnh hemoglobin h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ------------------***------------------- NGÔ THỊ TUYẾT NHUNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN α GLOBIN GÂY BỆNH HEMOGLOBIN H Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến trên gen α globin gây bệnh Hemoglobin H” là công trình nghiên cứu của tôi cùng nhóm nghiên cứu tại khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Trung Ương do BS Ngô Diễm Ngọc là trưởng nhóm. Tôi đã nhận được sự đồng ý của trưởng nhóm và tất cả các thành viên trong nhóm nghiên cứu về việc công bố các nội dung thực hiện và kết quả thu được. Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và rõ ràng. Xác nhận của trưởng nhóm nghiên cứu Học viên Ngô Thị Tuyết Nhung i LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS. Trương Quốc Phong, trưởng phòng thí nghiệm Proteomics- Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học- Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn BS. Ngô Diễm Ngọc, trưởng khoa Di truyền và Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung Ương đã tạo đạo điều kiện cho em hoàn thành nghiên cứu này. Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quá trình học tập và rèn luyện. Trong thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình đầy động viên khích lệ của tập thể cán bộ nhân viên khoa Di truyền và Sinh học phân tử, tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con đường học tập và nghiên cứu. Hà Nội, tháng 09 Năm 2017 Học viên Ngô Thị Tuyết Nhung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii MỤC LỤC .................................................................................................................. 1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................... 4 DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... 6 DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. 6 MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 11 1.1.Lịch sử nghiên cứu bệnh Alpha Thalassemia .................................................... 11 1.1.1. Thế giới ....................................................................................................... 11 1.1.2.Việt Nam ...................................................................................................... 13 1.2.Cấu trúc phân tử Hemoglobin ở người bình thường ........................................... 14 1.2.1.Cấu trúc phân tử Hemoglobin ...................................................................... 14 1.2.2.Các dạng Hemoglobin trong cơ thể ............................................................. 15 1.3.Bệnh Alpha Thalassemia..................................................................................... 17 1.3.1. Khái niệm chung về bệnh Alpha Thalassemia. .......................................... 17 1.3.2.Dịch tễ học bệnh α Thalassemia .................................................................. 17 1.3.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh α thalassemia. ..................................................... 18 1.3.3.1. Người mang gen α thalassemia. ....................................................... 19 1.3.3.2. α thalassemia thể nhẹ. ...................................................................... 19 1.3.3.3. Bệnh Hemoglobin H (HbH). ............................................................ 19 1.3.3.4. Hội chứng phù thai Hemoglobin Bart’s (Hb Bart’s). ...................... 19 1.4.Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen α globin. .................................................. 20 1.4.1. Cụm gen α globin........................................................................................ 20 1.4.2. Gen α globin. .............................................................................................. 21 1.5. Chẩn đoán bệnh Alpha Thalassemia .................................................................. 22 1.5.1. Xét nghiệm huyết đồ cơ bản ....................................................................... 22 1.5.1.1. Xét nghiệm công thức máu .............................................................. 22 1.5.1.2. Điện di Hemoglobin ......................................................................... 22 1 1.5.2.Chẩn đoán bằng sinh học phân tử ................................................................ 23 1.5.2.1. Kỹ thuật lai đặc hiệu ........................................................................ 24 1.5.2.2. Kỹ thuât khuếch đại alen đặc hiệu (Amplification refractory mutation system- ARMS PCR) .................................................................................... 24 1.5.2.3.Kỹ thuật xử lý enzym cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism analysis- RFLP PCR) ........................................................... 25 1.5.2.4. Kỹ thuật GAP-PCR .......................................................................... 25 1.5.2.5. Kỹ thuật giải trình tự gen ................................................................. 25 1.5.2.6. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification - MLPA) ......................................... 26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 28 2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 28 2.2.Hoá chất sử dụng ................................................................................................. 28 2.3.Trang thiết bị ....................................................................................................... 28 2.4.Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 29 2.4.1. Tách chiết ADN .......................................................................................... 29 2.4.1.1. Tách chiết ADN từ máu ngoại vi[54] .............................................. 29 2.4.1.2.Tách chiết ADN từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy ....................... 30 2.4.1.3. Xác định nồng độ ADN tổng số ....................................................... 30 2.4.2. Phương pháp PCR sàng lọc 5 đột biến thường gặp trên gene HBA ........... 31 2.4.2.1.Phản ứng Mutiplex Gap PCR sàng lọc đột biến SEA, α3.7, α4.2 .... 31 2.4.2.2.Phản ứng C-ARMS PCR sàng lọc đột biến HbCS, HbQS ............... 33 2.4.3. Phương pháp điện di trên Agarose ............................................................. 34 2.4.3.1. Nguyên tắc ....................................................................................... 34 2.4.3.2. Quy trình .......................................................................................... 34 2.4.4. Phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ gene HBA1, HBA2 ............................. 36 2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................................ 37 2.4.6. PCR mồi đơn............................................................................................... 37 2.4.7.Tinh sạch bằng BigDye X ............................................................................ 39 2.4.8. Phân tích trình tự gene ................................................................................ 39 2.4.9. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật Multiplex Gap- PCR và ........ 39 2 2.5.Vấn đề đạo đức nghề nghiệp………………………………………........42 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 41 3.1. Đánh giá quy trình kỹ thuật sử dụng để phát hiện đột biến gen  globin.......... 41 3.2. Kết quả xác định đột biến gen  globin trên 47 bệnh nhân HbH ...................... 44 3.2.1. Kết quả xác định 5 đột biến mất đoạn thường gặp bằng kỹ thuật Multiplex Gap- PCR và C-ARMS PCR ................................................................................ 44 3.2.2. Kết quả xác định đột biến điểm hiếm gặp dạng mất đoạn bằng kỹ thuật giải trình tự gen trên bệnh nhân HbH .......................................................................... 47 3.2.2.1. Đột biến điểm c.2delT (p.Met1Argfs) trên gen 2 .......................... 47 3.2.2.2. Đột biến điểm c.92 GA (p.Arg31Lys) trên gen 2 ...................... 48 3.2.2.3.Đột biến điểm c.426 AT(p.Ter142Tyr)- Hb Pakse trên gen 2 ... 50 3.2.2.4. Đột biến điểm c.81GT(p.Glu27Asp)- Hb Hekinan trên gen 1 .. 51 3.2.3. Tổng hợp kết quả về tỷ lệ các đột biến trên gen α globin của bệnh nhân HbH ............................................................................................................................... 52 3.3. Kết quả chẩn đoán trước sinh ............................................................................. 54 3.4. Đối chiếu kết quả chẩn đoán trước sinh ............................................................. 56 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 58 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 60 3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ý nghĩa Viết tắt / -/ 4 gen hoạt động, người bình thường Dị hợp tử +-thal, người mang gen α+-thalassemia (Silent Carrier) --/ Dị hợp tử 0-thal, người mang gen α0-thalassemia (Cis) ( thalassemia trait) -/- Đồng hợp tử +-thal, người mang gen α0-thalassemia (Trans)( thalassemia trait) -3.7 Đột biến mất đoạn 1 gen lệch phải 3.7kb -4.2 Đột biến mất đoạn 1 gen lệch trái 4.2kb --SEA Đột biến mất đoạn 2 gen dạng South East Asia -HbCS Đột biến điểm Hb Constant Spring (TAA>CAA) -HbQS Đột biến điểm Hb Quong Sze (CTG>CCG) -c.2delT Đột biến điểm ATG>A-G codon ATG gen 2 -c.92 G>A Đột biến điểm AGG>AAG codon 31 gen 2 -c.426 A>T Đột biến điểm TAA>TAT, Hb Pakse -c.81G>T Đột biến điểm GAG>GAT codon 27 gen 1, Hb Hekinan (2β2) Hemoglobin A (2δ2) Hemoglobin A2 (ζ2ε2) Hemoglobin Gower1 (2ε2) Hemoglobin Gower2 (ζ2γ2) Hemoglobin Porland (2γ2) Hemoglobin F β4 Hemoglobin H γ4 Hemoglobin Bart’s C-ARMS-PCR Combine-Amplification Refractory Mutation SystemPolymerase Chain Reaction 4 CO2 Carbon dioxide CO Carbon monoxide GAP-PCR GAP Polymerase Chain Reaction (PCR khoảng cách) Hb Hemoglobin HGB (g/dL) Khối lượng hemoglobin (g/dL) HCT (%) Hematocrit (%) HPFH Hereditary persistence of fetal hemoglobin, Hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai di truyền HPLC High Performance Liquid Chromatography MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification MCV (fL) Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu MCH (pg) Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung bình hồng cầu (pg) O2 Oxygen PCR Polymerase Chain Reaction RBC (1012/L) Red Blood Cells, số lượng hồng cầu TIF Thalassemia International Foundation, Hiệp hội Thalassemia quốc tế WHO World Health Organization, Tổ chức y tế thế giới 5 DANH MỤC HÌNH Hình1.1: Sơ đồ cấu tạo phân tử Hemoglobin . ..........................................................14 Hình 1.2: Chức năng vận chuyển oxy của phân tử Hemoglobin. .............................15 Hình 1.3: Các chuỗi globin ở giai đoạn trước sinh, và sau sinh. ..............................16 Hình 1.4: Hội chứng phù thai do Hb Bart’s . ............................................................20 Hình 1.5: Cấu trúc cụm gen α globin ........................................................................20 Hình 1.6: Cấu trúc vùng MCS-R trong cụm gen α globin .......................................21 Hình 1.7: Cấu trúc gen α globin ................................................................................22 Hình 1.8: Điện di Hemoglobin bằng kỹ thuật HPLC ................................................23 Hình 2.1: Sơ đồ qui trình xác định đột biến  globin gây bệnh Hemoblobin H.......29 Hình 2.2: Nguyên lý của kỹ thuật GAP-PCR ..........................................................31 Hình 2.3: Nguyên lý của kỹ thuật C- ARMS-PCR ..................................................33 Hình 3.1: (A) Điện di sản phẩm Multiplex GAP-PCR, (B) Điện di sản phẩm CARMS-PCR cho 20 mẫu không có đột biến gen  globin .......................................41 Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR của:(A) Kỹ thuật Mutiplex GAP-PCR, (B) Kỹ thuật C-ARMS-PCR của 20 mẫu có đột biến gen  globin. ..............................................42 Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR của 3 đột biến mất đoạn thường gặp trên gen  globin của các bệnh nhân HbH bằng kỹ thuật Multiplex GAP PCR .......................44 Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 đột biến -HbCS và -HbQS bằng kỹ thuật C-ARMS- PCR.................................................................................................45 Hình 3.5. Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.2delT (p.Met1Argfs)............................................................................................................48 Hình 3.6: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.92G>A (p.Arg31Lys) .............................................................................................................49 Hình 3.7: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.426A>T (p.Term142Tyr) .........................................................................................................50 Hình 3.8: Kết quả giải trình tự gen  globin phát hiện đột biến điểm c.81G>T (p.Glu27Asp) .............................................................................................................52 6 Hình 3.9: Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s bằng kỹ thuật Multiplex GAP PCR .................................................................................................54 Hình 3.10. Hình ảnh điện di chẩn đoán trước sinh bệnh Hb Bart’s bằng kỹ thuật CARMS PCR ...............................................................................................................55 Hình 3.11. Hình ảnh điện di Hemglobin máu cuống rốn thu thập từ thai bị phù mắc Hb Bart’s ...................................................................................................................57 7 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần Hb ở các giai đoạn phát triển của người bình thường ..........15 Bảng 1.2: Các thể bệnh α thalassemia và các biểu hiện lâm sàng ............................18 Bảng 3.1: Bảng tổng kết về độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR ....................43 Bảng 3.2: Kết quả xác định 5 đột biến mất đoạn thường gặp bằng kỹ thuật Multiplex Gap- PCR C-ARMS PCR .........................................................................................46 Bảng 3.4: Kiểu gen của 47 bệnh nhân HbH ..............................................................53 Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ...................56 8 MỞ ĐẦU Alpha thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin trong phân tử Hemoglobin. Bệnh thuộc nhóm bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới, là nguyên nhân gây tan máu hàng đầu ở trẻ em. Bệnh α thalassemia xuất hiện ở tất cả các chủng tộc trên thế giới, đặc biệt ở khu vực nhiệt đới, trong đó có khu vực Đông Nam Á. Hiện nay, có khoảng 5% dân số thế giới là người mang gen bệnh α thalassemia, phân bố khác nhau ở từng quốc gia, chủng tộc [37]. Trung Quốc, người mang gen α thalassmia chiếm 5-15% dân số [2], Hong Kong 4% [3], Thailand 15-30% [13], Lào 43% [5], Việt Nam 5% [63]. Người bình thường có hai gen α globin nằm trên mỗi NST 16, và có tổng số bốn gen α globin trên hai NST 16 tương đồng (αα/αα). Tùy theo số lượng gen α bị đột biến, gây ra các biểu hiện lâm sàng ở nhiều mức độ khác nhau. Bệnh Hemoglobin H (HbH) là một trong các thể bệnh của bệnh Alpha Thalassemia với ba trên bốn gen α globin của cơ thể bị đột biến. Trẻ mắc bệnh HbH thường có thiếu máu, tan máu, có thể phải phụ thuộc truyền máu, gây hậu quả nghiêm trọng cho hàng loạt các cơ quan trong cơ thể. Nếu không được điều trị, trẻ mắc HbH thể nặng thường tử vong sớm, hoặc muộn hơn vì các biến chứng của bệnh. Tại bệnh viện Nhi Trung Ương, mỗi năm tiếp nhận khoảng 50 trường hợp trẻ bị HbH mắc mới. Các xét nghiệm công thức máu và phân tích thành phần Hemoglobin góp phần đáng kể trong việc hỗ trợ chẩn đoán ban đầu. Tuy nhiên, các xét nghiệm này không chỉ ra chính xác kiểu gen đột biến và không thể chẩn đoán trước sinh cho thai nhi. Do đó, việc xác định loại đột biến gây bệnh HbH bằng các kỹ thuật phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc xác định thể bệnh, là cơ sở thiết yếu cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh bệnh α thalassemia. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến trên gen α globin gây bệnh Hemoglobin H” 9 Mục tiêu của đề tài: - Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện các đột biến trên gen α globin gây bệnh Hemoglobin H và chẩn đoán trước sinh bệnh α Thalassemia 10 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1.Lịch sử nghiên cứu bệnh Alpha Thalassemia 1.1.1. Thế giới Năm 1954 Minnich lần đầu tiên mô tả một bệnh nhân thiếu máu người Thái Lan với một đặc điểm là có nhiều thể vùi trong hồng cầu. Lúc đó ông gọi loại thiếu máu này là thiếu máu có thể vùi trong hồng cầu. Ngoài đặc điểm trên, Minnich còn thấy ở bệnh nhân này có hồng cầu biến dạng kiểu thalassemia, nhiều hồng cầu hình bia và một số hồng cầu mảnh [22]. Năm 1955 Rigarass [38], và năm 1956 Goutass [15] đều độc lập công bố tìm được HbH trong thành phần Hb của một số bệnh nhi. Tuy nhiên, các tác giả khi đó gọi bệnh HbH như một bệnh Hb riêng biệt, chưa tìm thấy mối liên hệ giữa bệnh HbH và bệnh α thalassemia. Năm 1959 Ramot [10] đã tách được thành phần Hb Bart’s trong máu của bệnh nhân HbH. Những phát hiện này giúp các nhà nghiên cứu hướng tới mối liên hệ giữa bệnh HbH và các thể của bệnh α thalassemia. Điều này được di truyền phân tử xác minh vào những năm sau này. Năm 1963 Dance đã phát hiện ra cơ chế tạo thành HbH nhờ phát hiện được phần globin của HbH gồm 4 chuỗi β. Do khi chuỗi α bị giảm, các chuỗi β tăng tổng hợp tạo các chuỗi β thừa dư. Các chuỗi này kết hợp với nhau tạo thành phân tử β4, là phần globin của HbH [65]. Tương tự cơ chế như vậy, trong thời kỳ bào thai, các chuỗi “không α” lúc đó chủ yếu là chuỗi γ. Khi chuỗi α giảm hoạt động, các chuỗi γ tăng tổng hợp, tạo các chuỗi γ thừa dư. Các chuỗi này sẽ kết hợp tạo thành phân tử Hb Bart’s γ4. Nhờ sự phát hiện này bản chất globin của HbH và Hb Bart’s đã được phát hiện, và từ đó các nhà nghiên cứu đã đi sâu vào bản chất của bệnh. Đầu những năm 60, ngoài việc nghiên cứu những biểu hiện đa dạng của bệnh HbH, các tác giả bắt đầu đi vào nghiên cứu lĩnh vực gen di truyền của bệnh α thalassemia nói chung và các thể bệnh α thalassemia nói riêng [18]. 11 Năm 1964, Wealtherall lần đầu tiên đưa ra giả thuyết có 2 cặp gen α globin. Mô hình này đã giải thích được các biểu hiện phong phú của các thể bệnh α thalassemia, cũng như các biểu hiện lâm sàng đa dạng của bệnh HbH ở các dân tộc khác nhau [19]. Trong cùng năm 1964, Wasi đã đưa ra bằng chứng chứng minh cho giả thuyết có 2 gen α globin. Ông đã quan sát tỷ lệ mắc bệnh HbH trong gia đình mắc bệnh là 1/4. Từ đó tác giả cho rằng ngoài gen kinh điển ở 1 trong 2 người bố và mẹ gây bệnh thì còn có 1 gen nhẹ hơn nằm ở người còn lại, có tác dụng tương hỗ với gen kinh điển tạo nên bệnh HbH [32]. Cùng thời gian này, Wasi và cộng sự cũng tiến hành một nghiên cứu trên các bệnh nhân mắc HbH tại Thái Lan, kết quả cho thấy: Điện di máu cuống rốn của 30 trẻ sơ sinh được sinh ra từ các cha mẹ mắc bệnh HbH, đã phát hiện 29/30 trường hợp có Hb Bart’s. Điều đó chứng tỏ hầu như tất cả các trẻ sơ sinh sinh ra từ các cha mẹ mắc bệnh HbH đều là người mang gen α thalassemia [32] . Những trẻ này được phân làm 2 nhóm dựa vào những đặc điểm máu ngoại vi: Nhóm thứ nhất gồm 14 trẻ có biến đổi hình thái hồng cầu ngoại vi theo kiểu thalassemia, hồng cầu nhỏ, nhược sắc, to nhỏ không đều. Tăng sức bền thẩm thấu hồng cầu. Lượng Hb Bart’s trong máu cuống rốn chiếm 5-6% trong thành phần Hb của cơ thể. Nhưng biểu hiện lâm sàng và huyết học trên cho phép xếp nhóm trẻ này vào nhóm α1- thalassemia. Nhóm thứ hai: gồm những trẻ còn lại không có biến đổi về hình dáng hồng cầu ngoại vi, hoặc có biến đổi rất ít, không đáng kể. Sức bền thẩm thấu hồng cầu đạt mức bình thường. Lượng Hb Bart’s trong máu cuống rốn chiêm 1-2% trong thành phần Hb. Những biểu hiện trên cho phép xếp nhóm trẻ này vào nhóm α2-thalassemia. Như vậy, quan sát trên cho phép tác giả nhận định rằng bệnh HbH bao gồm cả 2 gen α1 và α2 thalassemia. Về mặt di truyền có thể coi bệnh HbH là thể dị hợp tử kép của α1/α2 thalassemia. Năm 1965, Nannakorn đã có một nghiên cứu trên 138 bệnh nhân HbH ở Thailand với những mô tả về đặc điểm huyết học khá đầy đủ. Ngoải ra, tác giả còn 12 đề cập đến vấn đề cắt lách đối với những bệnh nhân HbH có thể cái thiện tốt tình trạng của bệnh [26]. Cho đến năm 1980, sinh học phân tử trong bệnh α thalassemia mới được hoàn toàn hiểu rõ, được công bố rộng rãi với các nghiên cứu của Higgs [71] 1.1.2.Việt Nam Tại Việt Nam, bệnh lý về huyết sắc tố được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, tuy nhiên hầu hết đều tập trung vào β Thalassemia và HbE [3]. Đối với bệnh α Thalassemia, từ trước năm 1985, bệnh này chưa được phát hiện ở Việt Nam do chưa áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán. Dựa vào điều kiện địa lý ở vùng Đông Nam Á, một số nhà nghiên cứu về huyết học ở nước ta lúc đó dự đoán có thể có bệnh α thalassemia tại Việt Nam. Đến năm 1985, dự đoán ấy mới được chứng minh nhờ sự phát hiện bệnh HbH, là một thể bệnh của α thalassemia. Năm 1996, Dương Bá Trực tiến hành nghiên cứu: “Đặc điểm lâm sàng và huyết học bệnh HbH ở trẻ em Việt Nam. Bước đầu tìm hiểu tần suất bệnh Alpha Thalassemia ở Hà Nội”. Đây là nghiên cứu đầu tiên trên đối tượng bệnh nhân HbH. Tuy nhiên, tại thời điểm nghiên cứu, chưa có sự ứng dụng của sinh học phân tử để xác định kiểu gen của bệnh [9]. Năm 2005, Trần Thuỳ Ngân đã ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định kiểu gen thalassemia trong vùng dịch tễ sốt rét của tỉnh Bình Phước [5]. Từ năm 2008 đến 2013, Nguyễn Khắc Hân Hoan đã tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh  và  thalassemia”. Nghiên cứu tiến hành trên đối tượng là các phụ nữ mang thai. Khi người vợ và người chồng có kết quả tầm soát huyết đồ nghi ngờ là người mang gen bệnh thalassemia, được thực hiện xét nghiệm di truyền phân tử để khẳng định, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh [1]. Từ năm 2013 đến 2015, Ngô Diễm Ngọc và cộng sự đã nghiên cứu về mối liên hệ giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Alpha Thalassemia trên các bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện Nhi Trung Ương và tiến tới sàng lọc người mang gen, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh[6], [7]. 13 Năm 2015, Ngô Thị Tuyết Nhung và cộng sự đã ứng dụng các kỹ thuật phân tử để chẩn đoán bệnh HbH trên đối trượng bệnh nhi tại bệnh viện Nhi Trung Ương [8]. 1.2.Cấu trúc phân tử Hemoglobin ở người bình thường 1.2.1.Cấu trúc phân tử Hemoglobin Phân tử Hemoglobin (Hb) ở người là một phân tử protein được cấu tạo từ hai cặp chuỗi dimer polypeptide, α và β globin, tạo thành cấu trúc tetramere. Phân tử α2β2 là cấu trúc của phân tử Hb ở người trưởng thành. Chức năng chính của phân tử này là vận chuyển oxygen (O2) từ phổi đến các tổ chức, và vận chuyển carbon dioxide (CO2), carbon monoxide (CO), nirtric oxide (NO) theo chiều ngược lại [2333]. Chức năng của phân tử Hb được hình thành dựa trên đặc điểm cấu tạo các chuỗi amino acid của chuỗi globin, bao gồm 7 vòng xoắn của chuỗi α và 8 vòng xoắn của chuỗi β globin. Các vòng xoắn này lần lượt gấp lại tạo thành các phân tử dimer và sau đó tạo thành cấu trúc tetramere. 4 chuỗi polypeptide của phân tử Hb khi kết hợp với nhau thì mỗi chuỗi tạo ra ở phần trung tâm một vị trí để gắn phần nhân Hem, là phân tử sắt-protoporphyrin IX, mang liên kết hóa trị mạnh, do đó phân tử này được bảo vệ khỏi sự xâm nhập của môi trường xung quanh. Do đó, cấu trúc phân tử Hb gồm hai phần: phần globin và phần HEM [33]. Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo phân tử Hemoglobin [33]. Phần HEM là phần tạo nên màu đỏ của chất Hb, có cấu trúc chung cho nhiều loài. Phần này là một vòng protoporphyrin và một nguyên tử sắt hóa trị II (Hình1.1). Nhân Protoporphyrin gồm 4 vòng pyrol, gắn với nhau qua các cầu nối methan (-CH=) và một số mạch thẳng gồm methy (- CH3 =), vinyl (- CH = CH2) và propionate (- CH2 14 - CH2 - COOH). Nguyên tử sắt nằm ở trung tâm, có hai mối liên kết chặt chẽ với hai nguyên tử nito và hai mối liên kết giả với hai nguyên tử nito khác, do quá tình chuyển và nhận điện tích. Ở người những rối loạn bệnh lý trong phần HEM ít xảy ra hơn hẳn so với những rối loạn bệnh lý trong phần globin [33]. Phần globin có bản chất là protein. Phần này đặc hiệu cho từng loài. Ở người, phần globin được cấu tạo bởi 4 chuỗi polypeptide giống nhau từng đôi một, gắn với nhau. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Do đó, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển 4 phân tử oxy [33]. Hình 1.2: Chức năng vận chuyển oxy của phân tử Hemoglobin [33]. 1.2.2.Các dạng Hemoglobin trong cơ thể Trong quá trình phát triển cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống. Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả chia chuỗi polypeptide thành các loại như sau: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (γ), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε), chuỗi zeta (ζ) [12]. Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin. Các loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Trong hồng cầu của người bình thường trưởng thành, hemoglobin A (α2β2) chiếm khoảng 97% trong tổng số Hb của cơ thể, hemoglobin A2 (α2δ2) chiếm ~2% và hemoglobin F (hemoglobin bào thai) (α2γ2) chiếm ~ 1% [12]. Bảng 1.1: Thành phần Hb ở các giai đoạn phát triển của người bình thường 15 Thai < 8 tuần Hb Gower HbF HbA1 HbA2 (ζ2ε2; α2ε2) ( α 2 γ2 ) (α2β2) (α2δ2) Nhiều Ít Thai > 8 tuần 90-99% 1-10% Sơ sinh 60-90% 10-40% <1% <2% 96% ~3% Trẻ > 1 tuổi và người trưởng thành 2 gen ζ và ε chỉ biểu hiện trong giai đoạn sớm của phôi, sau đó giảm dần và thay bằng sự biểu hiện của 2 gen α và 2 gen γ, hình thành nên Hemoglobin Gower1 (ζ2ε2), Gower2 (α2ε2) và Porland (ζ2γ2). 2 gen α và γ dần dần biểu hiện tạo thành HbF (α2γ2), là loại Hb chiếm ưu thế ở 3 tháng giữa của thai kỳ và có ái lực với oxy tăng nhẹ so với Hb ở người trưởng thành (Hình 1.3). Tại thời điểm sinh, gen α globin đã đạt đến mức độ hoạt động đầy đủ, gen γ giảm hoạt động, nhóm gen β (δ và β) dần dần tăng hoạt động. Do đó ở người bình thường, khi được 1 tuổi, loại hemoglobin chiếm ưu thế là Hb của người trưởng thành HbA và HbA2.Tuy nhiên trong một vài trường hợp, gen γ globin vẫn tiếp tục được biểu hiện trong tế bào hồng cầu trưởng thành, gây hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai có tính chất di truyền (HPFH) [12]. Hình 1.3: Các chuỗi globin ở giai đoạn trước sinh, và sau sinh [12]. 16 1.3.Bệnh Alpha Thalassemia 1.3.1. Khái niệm chung về bệnh Alpha Thalassemia. Thalassemia là một nhóm bệnh di truyền lặn trên NST thường có biểu hiện lâm sàng là tình trạng thiếu máu ở các mức độ khác nhau. Thuật ngữ “Thalassemia” có nguồn gốc từ Hy Lạp, “thalassa” nghĩa là biển, “heama” nghĩa là máu, hay còn gọi là “bệnh máu vùng biển”, được phát hiện đầu tiên và gặp phổ biến ở các nước thuộc vùng biển Địa Trung Hải [34]. Bệnh thalassemia được phân loại dựa trên loại chuỗi globin nào trong phân tử hemoglobin bị đột biến. Chuỗi β globin được mã hóa bởi gen β globin trên NST 11 và chuỗi α globin được mã hóa bởi gen α globin trên NST 16. Ở người bình thường, có 4 locus gen mã hóa cho chuỗi α globin và 2 locus gen mã hóa cho chuỗi β globin. Hai loại chuỗi này tạo nên phân tử α2β2 là hemoglobin A (HbA), chiếm 95% thành phần Hb ở người trưởng thành [26]. Bệnh α thalassemia là bệnh thiếu máu tan máu di truyền gây ra do giảm hoặc mất hẳn sự tổng hợp của chuỗi α globin trong phân tử Hb. Sự suy giảm tổng hợp này dẫn đến sự dư thừa của chuỗi β globin tạo phân tử γ4, gọi là Hb Bart’s (thời kỳ bào thai), và β4, và HbH (thời kỳ trưởng thành) [49]. 1.3.2.Dịch tễ học bệnh α Thalassemia Như hầu hết các bệnh về rối loạn gen globin nói chung, bệnh α thalassemia xảy ra ở tất cả các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với tần số cao. Ở một số vùng, tần số người mang gen α thalassemia có thể chiếm 80-90% dân số [28]. Các bằng chứng về dịch tễ học đã chứng minh rằng các rối loạn về gen globin nói chung và bệnh α thalassemia nói riêng có liên quan đến các khu vực lưu hành bệnh sốt rét, mặc dù cơ chế về vấn đề này tuy đã được nghiên cứu rộng rãi nhưng vẫn chưa được sáng tỏ [71]. Trong tất cả các bệnh về rối loạn gen globin, bệnh α thalassemia là bệnh có sự phân bố rộng rãi nhất. Do đó, với sự kết hợp giữa các dạng allen đột biến khác nhau của bệnh α thalassemia, cũng như giữa bệnh α và β thalassemia, đã tạo ra nhiều kiểu hình phong phú của bệnh. Và cũng vì thế, bệnh HbH, là α thalassemia thể trung gian được tìm thấy chủ yếu ở Đông Nam Á, Trung Đông và Địa Trung Hải. 17