Tài liệu Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy trong phòng

  • Số trang: 25 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 257 |
  • Lượt tải: 0
trancongdua

Đã đăng 1751 tài liệu

Mô tả:

2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Tác Giả : Lê Hoàng Duy Danh mục : Chương 1 : Sơ chế các chất cần thiết cho nuôi cấy. Chương 2 : Hướng dẫn nuôi cấy Vi khuẩn. Chương 3 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào thực vật. Chương 4 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào động vật và động vật hữu nhũ. Lời Ngỏ : Tài liệu tham khảo từ 1 cuốn sách chuyên nghành sinh học xuất bản năm 1972, tài liệu để tham khảo thêm cho sinh viên chuyên nghành công nghệ sinh học. Tài liệu này không phải tài liệu xét nghiệm chỉ tập trung vào kiến thức nuôi cấy tế vào và vi sinh vật, kiến thức cơ bản cho công nghệ tế bào gốc sau này, nhìn chung công nghệ hiện nay sử dụng máy móc để giảm gánh nặng cho các nhà nghiện cứu nhưng cách thức nuôi cấy vẫn không khác gì những năm đầu của công nghệ sinh học. Chương 1 : Sơ chế các chất cần thiết cho nuôi cấy. Dung dịch Hanks Đậm gấp 10 lần. Cách pha : Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 1 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Pha 2 dung dịch riêng A và B riêng rẽ sau đó kết hợp lại : Dung dịch A : NaCl : 80g. KCl : 40g. 7H2O + MgSO4 : 1g. MaCl2. .6H2O : 1g. CaCl2 : 1,4g Nước cất 2 lần 500ml. Dung dịch B : Na2HPO4.2H2O : 0,75g Na2HPO4.12H2O : 1,5g. KH2PO4 : 0,6g. Glucozơ : 10g Nước cất 2 lần 480 ml. ** Pha 2 dung dịch muối như trên sau đó đổ dung dịch A vào dung dịch B một cách từ từ vừa đổ vừa khuấy. Cuối cùng cứ mỗi lít dung dịch cho thêm 20 ml dung dịch 1% đỏ phenol. Lọc qua lọc giấy, để làm tiệt trùng thì có 2 cách : + Cách thứ 1 là cách tốt nhất là lọc qua Seitz (lọc ngăn vi khuẩn). + Cách 2 sấy ước ở 100 độ C trong 20 phút, sấy 3 lần trong 3 ngày liên tiếp. Nhưng trong trường hợp này CaCl2 phải pha riêng vào cho thêm sau khi sấy, trước khi dùng.  Tiệt trùng xong thì đóng vào lọ 500-1000 ml đậy kín bằng nút cao su. Thử vô trùng bằng cách cấy 0,5 ml dung dịch vào môi trường canh thang thịt – pepton và thách Sabouraud.  Bảo quản dung dịch mẹ trong tủ lạnh có thể bảo quản được đến 6 tháng. Trước khi dùng đem pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần vô trùng. Dung dịch làm việc đem sấy 100 độ C, 10 phút với áp suất 0,7 at , điều chỉnh PH bằngng dung dịch bica 1,4% có PH = 7,2 – 7,4.  Cứ 100 ml dung dịch cho 2,5 – 3 ml. Chú ý : + Dung dịch làm việc trong phòng không quá 1 tháng. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 2 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào + Chưa pha bica có thể sử dụng 6 tháng. Bica là tên viết tắt : Bicacbonat Na, Bicacbonat Ca, Bicacbonat Mg.... Dung dịch Earle Thành phần dung dịch chuẩn đặc 10 lần trong 1 lít như sau : NaCl : 68g. KCl : 4g. CaCl2 : 2g. MgSO4.7H2O : 2g. NaH2PO4.7H2O : 1,25g. Glucozơ : 10g. Đỏ Phenol : 0,2g. Hòa tan các thành phần mưới theo trật tự kể trên trong nước cất 2 lần. Riêng CaCl2 thì phải pha riêng và cho vào sau vừa cho vừa trộn lọc qua lọc Seitz. Khử vô trùng đậy nút cao su. Bảo quản ở buồng lạnh. Trước khi pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần. Lọc lại lần thứ 2. Điều chỉnh PH để có PH = 7,4 – 7,5 bằng cách cho thêm vào 4 – 4,4 ml dung dịch 5% Bica vào 100 ml dung dịch muối. Nếu cần thì cho giảm PH thì cho luồn khí CO2 đi qua sau khi khí này đã được đi qua bình chứa axit H2SO4 hay đi qua lọc bông. Dung dịch đệm FotFat Tùy theo yêu cầu cụ thể của công tác có thể cần cụ thể của công tác có thể cần đến dung dịch đệm Fotfat chứa các ion Ca và Mg. Cách pha 1 lít dung dịch này đặc 10 lần như sau : Dung dịch A : NaCl : 80g KCl : 2g CaCl2 : 80g. KCl : 2g CaCl2 : 1g MgCl2.6H2O : 1g Nước cất 2 lần 1000 ml. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 3 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Dung dịch B : Na2HPO4.12H2O : 28,98g KH2PO4 : 2g Nước cất 2 lần : 10 ml Trước khi dùng cứ 100ml dung dịch A cho thêm 800 ml nước cất 2 lần sau đó cho thêm 100 ml dung dịch B. Lọc qua lọc Seitz và giữ ở tủ lạnh. Nếu trong dung dịch đệm Fotfat không cần các Ion Ca và Mg thì cách pha như sau : NaCl : 8g. KCl : 0,2g Na2HPO4.12H2O : 2,9g KH2PO4 : 0,2g Nước cất 2 lần cho đầy 1 lít sấy vô trùng 110 độ trong 30 phút có thể giữ được ở nhiệt độ phòng. Dung dịch Trypsin Hòa tan 1g Trypsin Difco trong 100ml dung dịch đệp Fotfat. Lọc qua lọc giấy hay lọc bông sau đó lọc qua lọc Seitz thử vô trùng bằng các cấy vào canh thang thịt Pepton và thạch Sabouraud. Ở trạng thái đống băng (-20 độ C) dung dịch Trypsin có thể bảo quản được mấy tháng ở + 4 độ C, chỉ giữ được vài tuần lễ. Trước khi dùng đem pha loãng 4 lần với dung dịch đệm Fotfat hay dung dịch Hanks vô trùng để có nồng độ cuối cùng là 0,25%. Dung dịch Vecxen (Vecxen là muối của axit etylen diamin tetra-axetic) Để điều chế dung dịch 0,02% người ta cấy 0,5g Vecxen hòa tan trong 2500ml dung dịch đệm Fotfat không chứa Ion Ca và Mg rót vào lọ 50ml, sấy vô trùng dưới áp suất 1 at, 30 phút. Bảo quản ở 4 độ C trong thời gian 1 -2 tháng tránh ánh sáng. Dung dịch đỏ Phenol 1% Trước hết chứa 100ml 1N NaOH bằng cách trộn 10ml dung dịch NaOH bảo hòa(li tâm dung dịch NaOH bảo hòa để bỏ hết cặn) với 90 ml nước cất 2 lần. Sau đó cứ 10g đỏ Phenol hòa tan trong cồn cho thêm 20ml dung dịch 1N NaOH lắc đều để lắng mấy phút. Hút hết nước trong ở bên trên cho vào ống đo lường 1 lít và cho thêm vào chỗ cặn độ 10ml 1N NaOH lại lắc và hút lấy nước trong hộp vào ống đong, cứ tiếp tục như thế cho đến khi thuốc đỏ Phenol tan hết. Tuy nhiên 1N NaOH dùng để hòa tan 10g Phenol Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 4 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào không được quá 70ml vì nếu số lượng NaOH nhiều quá thì dung dịch có màu đỏ thẫm không dùng được vào nuôi cấy tế bào. Dung dịch đỏ trung tính Muốn chế dung dịch 0,1% đỏ trung tính người ta hòa tan 0,1g thuốc vào 100ml cồn Etyl 60 độ dung dịch này dùng để nhuộm ống tế bào để đếm và để phát hiện Plecơ . Dung dịch Cristal Violet( xem thêm ) Dung dịch này cũng dùng để nhuộm sống tế bào để đếm trong khi làm Trypsin hóa mô. Pha 0,1% dung dịch Cristal Violet trong 0,1N axit Nitric. Tạo Huyết Thanh Ứng dụng dùng để thêm vào môi trường dinh dưỡng 1 lượng nhất định từ 5 – 10% để tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh Điều chế : Lấy máu của động vật thường là của Bê, Ngựa & của người..... Cho vào lọ rộng cổ để trong tủ ấm 20 – 30 độ C cho máu đông, sau đó dùng que tách máu đông ra khỏi lọ, đặt lọ vào tủ lạnh +4 độ C trong 1 – 2 ngày. Chắt huyết thanh li tâm 2000 vòng/phút trong 20 phút lọc lấy huyết thanh qua lọc Seitz rót vào lọ hay ống và đậy nắm cao su, thử vô trùng và bảo quản ở tủ từ 4 – 20 độ C. Tùy mục đích sử dụng có thể dùng tươi hay đun ở 50 độ C trên 30 phút trước khi dùng cần thử độc tính đối với tế bào. Chất làm nhũ hóa Liên quan đến chất béo chia nhỏ chất béo... Dung dịch Glyxerin 15% trong H2O huyết thanh ngựa bình thường không chứa chất bảo quản, dung dịch Sacarozơ 10% với Gelatinh 1% có PH 6,8 – 7 hoặc các dung dịch chứa glucozơ, lactozơ có 10 – 30% sữa. Thủy phân tinh bột Nguyên lí : Dùng(H2SO4 hoặc HCl) với áp lực dư. Dịch thủy phân thu được trung hòa bằng Na2CO3 hoặc NaOH. Nếu dùng H2SO4 làm tác nhân thủy phân thì có thể dùng CaCO3 hoặc nước vôi để trung hòa, sau đó lọc qua lọc ép khung bản với than hoạt tính để khử màu : Dịch thủy phân thường là glucoza, 1 lượng nhỏ aa, khoán chất có thể đem làm cô đặc lại 60-70% để sử dụng dần. • Dùng enzim : Bột gạo, bột ngô đã tách phôi men α amilaza hay β Amilaza, Bột đậu tương là 1 nguồn Nitơ kỹ thuật chứa 40% Protein 19% chất béo và các Axit amin. Cách làm cao ngô Bắp Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 5 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Cách làm cao ngô thường có màu nâu sẫm 150 kg hạt không mọt không mốc, rửa sạch ngậm với 220l nước, máy tỉ lệ nước bằng 1:1,3 thêm 2 lít HCl 30% và 1,2 kg Na2SO3 để làm dịch ngâm có PH = 3 và nồng độ SO2 có 0,25% ngâm 48 giờ ở 50 – 55 độ C. Sau khi kết thúc dịch ngâm được gia nhiệt tới 75 – 80 độ C dùng sữa vô đã lọc sạch, chỉnh PH 8 – 8,2 để lắng 30 phút cho protein kết tủa. Lọc qua lọc ép khung bản và rữa bả bằng nước nóng. Dịch lọc và nước rửa được điều chỉnh PH bằng HCl tới 5 và cô chân không ở 60 độ C tới 28 độ bé. Thành phần lớp tạo phủ dùng để làm phương pháp plecơ : 1. Dung dịch Earcle đặc 10 lần không chứa đỏ 18 ml Phenol và Bica. 2. Nước cất vô trùng : 60 ml 3. Huyết thanh bê hoặc khỉ 3,6 ml 4. NaHCO2 (7,5%) : 5,4 ml 5. Đỏ trung tính (1:1000) : 3 ml 6. Penixilin : 18.000 đơn vị 7. Streptomixin : 18.000 đơn vị Thạch phủ này đảm bảo tế bào sống được 8 – 12 ngày • 2% thạch • Môi trường dinh dưỡng dung dịch Gey A đặc 10 lần 20% • Dung dịch Gey B đặc 10 lần 10% • Tris 0,2 M, PH = 7,6 đặc 10 lần 10% • 5% Lactoalbumin Hydrolisat 10% • Chứa 10% huyết thanh bê • Đỏ trung tính 1:1000 • Nước cất 30% Dung dịch Gey B NaCl : 8g KCl : 0,375g Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 6 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào CaCl2 : 0,275g MgCl2 : 0,21g Na2HPO4 : 0,15g KH2PO4 : 0,025g Glucoza : 2g NaHCO3 : 0,25g Nước cất 2 lần 1000ml có thêm đỏ Phenol làm chất chỉ thị màu, bảo quản ở nhiệt độ +4 độ C thời gian 1 tháng. Tách Enzim dùng muối trung tính kết tủa là Sunfat amon [(NH4)2SO4] tỉ lệ 50 – 60 % dùng (Etanol, Izopropanol và axeton) chiết nước nấm men cho 3-4 thể tích cồn vào 1 thể tích nước chiết enzim để trách giảm hoạt tích enzim cần lạnh xuống 3 – 5 độ C khuấy mạnh, khi enzim kết tủa lắng xuống cần li tam cần rửa đến 2 – 3 lần ca độ cho vào bình hút ẩm hoặc máy sấy chân kh6ong sản phẩm thu được ở dạng bột. Chương 2 : Nuôi cấy vi khuẩn. Tóm tắt nội dung chương 2 : bài này hướng dẫn nuôi cấy những vi khuẩn có lợi, và ứng dụng vào cuộc sống, cách nuôi cấy vi khuẩn khác cũng tương tự các bạn tìm hiểu thêm tại trường hoặc hỏi những người có chuyên môn. Bảng vi khuẩn và ứng dụng của vi khuẩn. Vi sinh vật sản sinh Aerobacter cloal Amanita muscaria và các nấm khác. Bacillus anthracis. Bản chất sản phẩm trao đổi chất Polisacarit Muscarin. Bacillus licheniforms. Bacillus subtilis. Các loài Claviceps. Nước chiết thô // Ecgotalcaloit Corticium caeruleum. Fusarium oxysporum. Nhiều loài Fusarium. Gibbrella Zea Ruglovasin A & B Axit Fusaric Caxit5-butylpicolinic Nước chiết thô. Zlagenin Lactobacillus leichmannii Zearalenon Nước chiết thô. Dịch lọc thô nước chiết. Hoạt tính Dược học Chống viêm tăng phó giao cảm. Giống Eponefrin hoat tính tim mạch. Giống ACTH // Phong bế adreneric kích thích cơ trơn hoạt tính CNS Hạ huyết áp. Hạ huyết áp. Gây buồn nôn. Gây hạ protein, gây động dục. Gây động dục. Giống ACTH. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 7 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Lenzites trabea Lentinus Edodes Lenzites trabea Naematoloma fasciculare Oospora-astringenes Oudemansiella radicata Nhiều loài Panaeolus Pellicularia filamentosa Penicillium convor ruglosum Penicillium corylophiloides Penicilium purpurogenum Penicilium Rugulosum Phialocepphala repens Psilocybe mexicana và các nấm khác Rhizoc tonia leguminicola Salmoella enteriditis Salmonella tiphi Serratia marcescens Nhiều loài Serratia Streptomyces allbire ticuli Streptomyces argenteolus Var.toyonakensis Treptomyces cacaoi Varasoensis Treptomyces caespitosus Treptomyces chartreusis Streptomyces grioseolus Streptomyces griseus Streptomyces hygroc picus Streptomyces kinoluteus Streptomyces lavendulae Streptomyces nigrifaciens Var.FFD-101 Streptomyces : noboritoensis Streptomyces : roseochromogenes Streptomyces roseus Streptomyces testaceus Streptomyces thioluteus Streptomyces Verticillatus Var Zynogenes Streptomyces EF-44-201 Rugulovasin A & B Lentysin Rugulovasin A & B Naemototin Oosponals oospo lacton, oospong lycol Oudenon Serotonin 5 hydroxytriptophan Rugulovasin A & B Rugulovasin A & B Rugulovasin A & B Rugulovasin A & B // Phialoxin Psiloxin Hạ huyết áp Giảm lipit máu. Hạ huyết áp. Giảm động mạch vành Co cơ. Pepstatin Hạ huyết áp. Co mạch. Hạ huyết áp. Hạ huyết áp. Hạ huyết áp. Hạ huyết áp // Chống đông. Tăng hoạt động tâm thần. Tăng phó giao cảm. Giống ACTH. // // Chống viêm. Chống Plaxmin, chống viêm ức chế, các men Trypsin Papainmen chống đông máu và các men khác. Ức chế Pepxin. Proteinnaza trung tín. Chống viêm. Pepstatin Leupeptin Proteinnaza trung tín proteaza Chimostatin. Kinonaza B1 Proteinnaza Chimostatin Leupeptin Nigrifactin Ức chế pepsin Như stm.albireticuli Chống viêm. Giống Insulin ức chế chimotripsin Chống viêm ức chế chimotripsin như stm.albireticuli Chống hixtamin Leupeptin // Như stm.albiraticuli // Leupeptin Leupeptin Leupeptin Retikinonaza I & II Proteinaza trung tin. 4 thành phần S-PI Như stm.albiraticuli Ức chế Peptin Như stm.albiraticuli Chống Viêm. Slaframin Nước chiết thô. // // Proteaza(TSP) Leupeptin Ức chế pepsin Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 8 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Các loài streptomyces Enzim Zygosporiu Masonii Zygosporium Mycophilum Penicillium chrysogenum Zygosporin A Zygosporin A Penixylin Streptomyces Erythryus Streptomyces Griseus Striptomyces erythreus Penixillium patulum Clavileps purpurea Tetraxiclin Streptomyxin Eritromixin Grizeofulvin Alcaloit của nấm cựa gà như : Ecgotamin, Ecgotoxin Propionibacterium Shermanii Vitamin(B12) corinoit Ca1v loại vi khuẩn xạ khuẩn và nấm. Steroit có cấu trúc được thay đổi 1 cách đặc hiệu nhờ vi sinh vật. Acetobacter subboxy dans Dextran L-socboza (Tiền chất để tổng hợp axit ascorbic) Chất thay thế huyết tương. Aspergllus niger Enzim Penixilium chryso genum Glucozooxydaza Escherichia coli Asparaginaza Streppiococcus spec Streptokinaza Bacillus subtilis Rhizpus spec. Penixilinaza Lipaza. Giảm nhóm Protein A & B của máu. Chống Viêm Chống Viêm Điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, nấm hoặc virus. // // // // Trong khoa sản (giúp vào việc co tử cung) và điều trị các bệnh mạch máu, bệnh nhứt đầu 1 bên. Điều trị thiếu máu ác tính. Chế phẩm hoocmon Ví dụ để kìm hãm sự rụng trứng để điều trị viêm và thấp khớp. Tiền chất của Vitamin C Leuconostoe mesenteroides Chuẩn đoán lâm sàn hóa sinh. Chuẩn đoán bệnh đái đường. Kiềm hãm khối u và bệnh bạch cầu. Điều trị bệnh mạch máu. Loại trừ Penixilin Thuốc trị tiêu hóa. Môi trường nuôi dưỡng kháng sinh Penixilin Các chủng Penixilin : Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 9 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Penicyllum, Aspergllus Penicillum notatum, Pichrysogenum. Môi trường nuôi cấy : 30g Lactozơ kỹ thuật, 3g NaNO3, o,5g KH2PO4, 0,25g MgSO4 0,2g C6H5Ch2CooH, 0,044g ZnSO4 Nước cất vừa đủ 1 lít dùng NaOH điều chỉnh PH tới 5,5 Cấy chìm gam/lít: Cao ngô : 2 Glucozơ : 2 Lactozơ : 0,5 Nitrat amol : 0,125 Sunfat Magie : 0,025 Sunfat Nitrat : 0,05 Kali Photohat monobazic : 0,2 CaCO3 : 0,5 Treptomixin Môi trường : Có glucoz ơ, bột đậu tương, cao ngô, ngoài ra còn có muối Amon, photphat và CaCO3 điều chỉnh PH. Giberelin Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 10 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Môi trường : Sacarozơ : 40 – 60 Tatarat amon : 7 KH2PO4 : 2 MgSO4.7H2O : 0,2 Hỗn hợp chứa các nguyên tố vi lượng PH = 5,5 thêm 0,5 Cao ngô. Eremothecium a shbyii và Ashbya gossypii Giới thiệu chủng vi khuẩn tạo ra Ribolavin (hay còn gọi là B12). Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 11 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào E.ashbyii có khuẩn ti dạng sợi kích thướt 2 – 4 x 60 – 80 Micromet. Khuẩn ti có cấu tạo phân nhánh. Giống này sinh sản vô tính bằng bào tử, có hình 1 đầu 1 đầu nhỏ mỗi bào tử nang chứa 8 – 10 bào tử nảy mầm phát triển thành khuẩn ti. Trên môi trường thạch E.ashbii còn non có màu trắng dần sang màu vàng già hơn có thể bị phân hủy, có màu vàng lục huỳnh quang (5 – 10 ngày cấy 1 lần). Ashbya gosspii sống kí sinh ở nụ bông, cafe, 1 số cây khác, cấu tạo có hình thoi 1 đầu khá dài tránh ánh nắng mặt trời nhiệt độ phát triển 28 độ C. Môi trường E.ashbyii : Bã mía : 130 γ/gam. Khô hạt bông : 1000 Khô đậu tương : 2200 Khô lạc : 3500. Mầm đại mạch : 6000 Mầm thóc : 5000 Bã đậu : 3000 Có 5% đường vàng, 3% dịch thủy phân protein chưa tới Pepton 1% phôi mì, 0,3% cao thịt, 0,3 % cao thịt, 0,3% KH2PO4, 0,25% NaCl và nước cất, PH = 6, 7 ngày cấy 1 lần nhiệt độ = 28 độ C. Tetraxyclin Còn gọi là Tetraxin, steclin, acromixin, polixiclin tạo bằng phương pháp hóa học Clotetraxylin hoặc nuôi cấy xạ khuẩn Str.aureofaciens. Môi trường nuôi cấy : Sacacroza : 2% Cao ngô : 0,24 Bột đậu tương : 2 CaCO3 : 0,4 NaCl : 0,5 Rỉ đường : 0,2 . Phương pháp chiết lấy các chất từ vi nấm : Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 12 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào • Phương pháp nuôi cấy riêng rẻ các khuẩn lạc trên môi trường rắn là gelatin hoặc thạch (agar - agar) • Penixilin nhờ mốc màu xanh lục Penicillium notatum. • Đối với sản phẩm là chất hòa tan trong dung dịch nuôi cấy thì phải li tâm tách lấy phần dịch rồi cho kết tủa, làm sạch, có thể cho kết tinh trở lại hoặc sản phẩm nằm trong tế bào thì phải phá vỡ vỏ tế bào rồi mới tiến hành tách và làm sạch tiếp theo pectinaza phân hủy pectin • Sự chuyển hóa Steroit như tạo thành cortizol sự oxi hóa không hoàn toàn như sự tạo thành axit axetic và sobboza để sản xuất axit ascorbic (Vitamin C), những thành tựu của quá trình này được ứng dụng trong sản xuất Cortizon, axit asscorbic(Vitamin C), axit glucomic tiền chất của Aphidrin và các chất điều trị các chứng viêm khớp. 1 số loại Vi khuẩn có lợi cho công môi trường : Vi khuẩn dùng dầu mỏ làm thức ăn  ứng dụng dùng để phân hủy dầu mỏ hay các vệt dầu loang .... Achromabater, Alkigenes,Bacillus, Bacterium, Corynerbacterium,Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibria.... Chủng nấm men, nấm mốc : Acremonium, Aspergilus, Candida, Cyfromyces, Debaryomyces, Endomyces, Hansenula monilia, Penicillium, Scopuluriosis, Torulopsis. Khuẩn Ty xạ khuẩn : Micromonospora , Mycobacterium.... Các chủng sử dụng Hydrocacbua : Candida lipolytica, Cointermedias, C.Tropicalis, C.Parasilops, S.guilliermondii..... Tên các loại vi khuẩn gây bệnh: Phế cầu : Pneumococcus. Lậu cầu : Conococcus. Màn não cầu : Miningococcus. Bruxela (Brucella). Micobacterium bền với axit . Trực khuẩn than : Bacillus anthracis. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 13 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Vi khuẩn hiếm khí gây bệnh trực khuẩn đường ruột. Các vi khuẩn influenxa Strepto và Staphylococcus Tụ cầu khuẩn : Staphylococcus. ............................... 1 số cách đột biến cơ bản : Treptomixin là xạ khuẩn Streptomyces griseus còn gọi là Actinomyces Streptomixin  Đột biến nhờ tia tử ngoại. Polysacarit của sinh vật sinh ra ta thấy có dextran trùng hợp từ các gốc glucoza, Levan trùng hợp từ Fructoza nhờ vi khuẩn Aerobacter Levanicum và Pulalan trùng hợp từ Maltoza nhờ loại nấm tương tự nấm men là Pullularia Pullulans. Dextran là Plysacarit do vi khuẩn lactic có phân tử lượng là 15000 – 50000000 liên kết giữa các gốc glucoza với nhau bằng mối 1,6 glucorit vi khuẩn sinh ra Leuconostoc mesenteroides. Đột biến : Hợp chất chứa Nitơ như Nitrozomety guanidin metyldicloroety lamin, nitrix, Hydroxylamin hay EtylametanSunfotnat. Inozit rượu mạch vòng 6 nguyên tử. Chương 3 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào thực vật. Về chương này cũng nhẹ vì VN ở cách viện sinh học VN đều làm được hết nên tôi cũng chỉ nhắc lại đôi nét về hoocmon Thực vật. Hoocmon thực vật gồm có : Auxin, Giberilin, Xitokin kích thích mô non phân hóa thành cây con. Cách thức : Trước hết dùng 1 tổ hợp phá màn xenlulo bằng Trypxin thành tế bào trần sau đó nuôi trong môi trường dinh dưỡng tiếp đến xử lí hoocmon thành cây con. Hiện nay trên nét có rất nhiều tài liệu về hoocmon thực vật GIới thiệu các chất trong thành phần : • Giberelin được tìm thấy trong việc phá ngủ các hạt giống có tác dụng kích thích nẩy mầm hình thành bằng con đường lên men (lột bỏ vỏ hạt cho lên men) được phân lập từ rễ cân lúa Von và 1 số khác, giống vi khuẩn Fusariummonilifome, Fusarium OxySprum có tất cả 38 loại : + A1 : C19H24O6 Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 14 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào + A2 : C19H26O6 + A3 : C19H22O6 + A4 : C19H24O5 ....... A12 : C20H28O4........ A38 : C20H26O6. Giberelin thúc quả xanh chóng chín và cảm ứng ra hoa ở cây dứa Trên chương nuôi vi khuẩn có giới thiệu cấu trúc. • Auxin là hợp chất của β-indolaxetic chứa trong bộ phận sinh sản của cây cối tham gia vào quá trình sinh trưởng nẩy mầm của hạt giống  hình ảnh minh họa : Chức năng : Auxin Ức chế hạt nảy mầm và kích thích sự rụng lá. • Xitokin (Cytokin) là chất được chiết suất trong tế bào bạch cầu của động vật hay nhựa cây thực vật từ Limphokin Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 15 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Chức năng : Kích thích ra rễ của cành giâm (chiết) và kích thích thu tinh tạo hạt • Etilen : Nuôi cấy tế bào và mô thực vật (nhân giống vô tính) và kích thích sinh trưởng của chồi non • Axit Abscisic Pha ngủ cho mầm hạt, củ khoai tây và tạo quả không hạt Chương 4 : Hướng dẫn nuôi cấy tế bào động vật và động vật hữu nhũ. Tinh chế Phôi : Tinh chế mô phôi được dùng rộng rãi nhất để cho thêm vào môi trường nuôi tế bào + Phôi gà có trống ấp 9-11 ngày lấy phôi cắt bỏ mắt, ,mỏ, chân, cánh, rửa bằng dung dịch hanks trong 1 cái cốc, rồi dùng kéo cắt thật nhỏ hay nghiền nhỏ cho vào ống rồi cho thêm vào 1 thể tích bằng ấy dung dịch hanks chứa 100 đơn vị trong 1ml của Penixilin và Sterptomyxin. Li tâm 30 phút, hút lấy nước trong ở trên là tinh chế phôi gà 50% thử vô trùng như thường lệ, bảo quản ở 12-20 độ C trong ống đậy nút cao su, trước khi dùng phải làm tan chảy li tâm 30 phút, tốc độ 2000 – 3000 vòng/ phút, hút lấy nước trong. Đối với phôi người hay các động vật khác cũng tiến hành tương tự chỉ khác là ngâm mô đã nghiền trong dung dịch hanks 30 phút trong tỷ ấm 37 độ trước khi li tâm. Môi trường dinh dưỡng 5% Lactoalbumin hydrolysat. Gọi tắt là “LH” Đây là môi trường, phổ cập nhất dùng để nuôi tế bào thành phần gồm có : - Lactoalbumin Hydrolysat : 5g Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 16 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào - NaCl - Nước cất 2 lần : 0,85g : 1000ml Trước tiên là hòa tan NaCl vào nước cất. Sau đó cho Lactoal bumin Hydrolysat vào lọc qua lọc Seitz rót vào lọ, đậy nút cao su hàn Parafin (là sáp nến hay sáp đèn cầy), thử vô trùng bằng cách cấy vào canh than thịt Pepton và thạch Saboureaud. Lacoalbumin Hydrolisat thường được dùng ở nồng độ 0,5% nên trước khi dùng phải pha loãng dung dịch mẹ ra 10 lần với dung dịch hanks hay dung dịch Earle. Môi trường Parker còn gọi là (199) Đây là môi trường tổng hợp thường được dùng để dưỡng tế bào sau khi đã gây nhiễm virus Điều chế môi trường Parker đặc 10 lần : - Chuẩn bị các dung dịch riêng rẻ : + Dung dịch 1 tính bằng gam cho 1 lít môi trường L - acginin : 0,7g L - histidin : 0,2g L – Lizin : 0,7g Dl – Triptophan : 0,2g Dl – phenilalanin : 0,5g Dl – metionin : 0,3g Dl – axit glutamic : 1,5g Dl – serin : 0,5g Dl – treonin : 0,6g Dl – lơxin : 1,2g Dl – izolơxin : 0,4g Dl – valin : 0,5g L – Hydroxyprolin : 0,1g Glyxin : 0,5g Dl – axit asparaginic : 0,6g Dl – alfa – alanin : 0,5g (dl – α - alanin) Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 17 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào L – prodin : 0,4g L – glutamin : 1g Sodium axetat : 0,5g Các axit amin này cùng với sodium axetat được câ sẵn và hỗn hợp ở dạng bột và sẽ cho vào môi trường theo trật tự sẽ nói sau . + Dung dịch 2 : Hòa 400mg L – lirozin và 200mg L-xistin trong 200mg 0,075N HCl đun nóng lên tới 85 – 90 độ C. Lắc mạnh không để sôi, sau đó để dung dịch vào nồi đun cách thủy nhiệt độ 37 độ C thỉnh thoảng lắc cho tan hoàn toàn. + Dung dịch 3 : Axit Nicotinic : 25mg Amit axit nicotic : 25mg Piridioxin Hydroclorit : 25mg Tiamin Hydroclorit : 10mg Ribolavin : 10mg Calcium Pantotenat : 10 mg L – Inozit : 50mg Axit para aminobenzoic : 50 mg Cholin Clorit : 500mg Hòa tan tất cả trong 175 ml nước cất 2 lần, lắc mạnh và khuấy bằng que thủy tinh cho nước cất 2 lần thêm cho đủ 200ml. Rót ra mỗi ống 2ml và bảo quản ở - 20 độ C. + Dung dịch 4 : Sơ bộ chế 2 dung dịch với 2 thành phần như sau A : L – glutation : 10 mg L – Sytin Hydroclorit : 20 mg Axit Ascocbic : 10 mg Hòa tan trong 100 ml nước cất 2 lần. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 18 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào B : Vitamin A : 20 mg Cồn etyl (95%) 2 ml Tween 80 (dung dịch 5% trong 20ml nước ) Vitamin A hòa tan trong cồn etyl sau đó cho thêm tween 80 (axit oleic) Trộn 2 dung dịch A và B cho nước cất 2 lần thêm vào cho đủ 200 ml và cho thêm vào cho đủ 200ml và cho thêm 1g Adeno Zintrifotfat Sodium (ATP) Chế xong rót dung dịch vào ống 10ml và bảo quản ở -20 độ C + Dung dịch 5 : Hòa 100mg biotin trong 75ml, nước cất 2 lần cho thêm 1ml dung dịch 1N HCl để bảo quản được bền hơn cho nước cất 2 lần vào cho đủ 100ml rót ra ống 1ml và bảo quản -20 độ C + Dung dịch 6 : Hòa 10mg axit folic (tinh thể) trong 100ml dung dịch Hanks, rót ra ống 1ml và bảo quản ở - 20 độ C + Dung dịch 7 : Hòa 20mg Vitamin D2 (Calciferol) , trong 40ml cồn etyl 90% cho thêm 40mg Cholesterin. Để làm tan Cholesterin phải lắc mạnh và khuấy bằng que. Sau đó cho thêm 60ml dung dịch 5% Tween 80 rót ra ống từng 5ml một và bảo quản ở -20 độ C. + Dung dịch 8 : 10 mg Vitamin E (alfatocaferol fotfat) Hòa tan trong 100ml nước cất 2 lần rót ra 2 ống từng 1 ml và bảo quản ở - 20 độ C. + Dung dịch 9 : 10 mg Vitamin K hòa trong 100ml nước cất 2 lần, lắc mạnh và đặt và nồi cách tủy 37 độ cho đến khi tan hoàn toàn. Rot ra từng 1 ml và bảo quản ở - 20 độ C. + Dung dịch 12 Hòa 18 mg Guanin (Chlorit) trong 167 ml nước cất 2 lần cho thêm 0,5 ml NH4OH đậm đặc và cho nước cất 2 lần thêm vào cho đủ 180 ml. Đun sôi để nguội và lại cho thêm nước cất cho đủ 180ml. + Dung dịch 13 : Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 19 2011 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Hòa 100 mg d-riboza và 100mg α –dezoxyriboza trong 100 ml nước cất 2 lần. Rót từng 5 ml 1 vào ống và bảo quản ở - 20 độ C + Dung dịch 14 : Hòa 100 mg nước cất 2 lần hòa tan 40 mg axit adenilic : Rót ra ống từng 5ml một và bảo quản ở -20 độ C. + Dung dịch 15 : Hòa tan 10 mg Fe(NO3)3.9H2O trong 100 ml nước cất 2 lần. Cho thêm 1 giọt HNO3 đậm đặc. Rót ra ống từng 2ml một và bảo quản ở -20 độ C. Chế môi trường 199 đặc 10 lần trong dung dịch Hanks a. Hòa tan 80 g NaCl trong 200 ml dung dịch 2 cho thêm 30 ml dung dịch 12 và 30 ml dung dịch 13. Hòa tan vào trong hỗn hợp này 4g HCl và sau đó cho 2g MgSO4.7H2O b. Trong 1 bình khác hòa tan 0,6g KH2PO4 trong 55 ml nước cất 2 lần. Hòa tan thêm và đó 0,6g Na2HPO4 (không ngậm nước) hay 1,52g Na2HPO4.12H2O và cho thêm nước vừa đủ 111ml. Dung dich vừa mới chế này đem trộn với dung dịch chế ở điểm a. c. Hòa tan riêng biệt 10g Glucoza (Dextrozơ không ngậm nước) trong 55 ml nước cất 2 lần, cho thêm vào đấy 20ml dung dịch 1% đỏ phenol và trộn với hỗn hợp vừa chế bên kia. d. Trong 1 bình riêng hòa tan hòa tan 1,4g CaCl2 không ngậm H2O trong 60ml 2 lần dung dịch này đem rót từ từ vào hỗn hợp trên, vừa rót vừa lắc mạnh để đề phòng kết tủa Ca3(PO4)2 không tan. e. Cho hỗn hợp vừa chế vào những dung dịch đã chế sẵn dưới đây : Dung dịch 3 2ml Dung dịch 5 1ml Dung dịch 6 1ml Dung dịch 7 5ml Dung dịch 8 1ml Dung dịch 9 1ml Dung dịch 13 5ml Dung dịch 14 5ml Dung dịch 15 2ml Nếu những dung dịch này đã rót sẵn vào ống với những khối lượng nói trên thì sau khi rót vào hỗn hợp phải trán kĩ ống. Khotien.vn | Tài liệu được viết bởi Lê Hoàng Duy 20
- Xem thêm -