Tài liệu ứng dụng kỹ thuật metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của việt nam​

Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT HỒ MẠNH TƢỜNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT METAGENOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY DÓ BẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH CỦA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm) HÀ NỘI, 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 1 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT HỒ MẠNH TƢỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm) Mã số: 60 42 01 14 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. LÊ VĂN SƠN Đơn vị: Viện Công nghệ sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 2 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Hà Nội, 2015 MỞ ĐẦU Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới, độc đáo và có thể áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học. Công nghệ metagenomics kết hợp với kỹ thuật gen, kỹ thuật protein sẽ cung cấp các hiểu biết sâu sắc về các vấn đề trong tiến hóa gen hoặc thông tin về các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí ẩn vì chúng khó có thể đƣợc nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm. Môi trƣờng đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lƣơng và sự đa dạng các loài trong hệ vi sinh vật. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lƣợng các sinh vật nhân sơ đƣợc xác định từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một gram đất. Số lƣợng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chƣa đƣợc biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích. Do đó, số lƣợng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều. Trong khi đó, phƣơng pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất. Nuôi cấy và phân lập DNA của vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến nhƣng chỉ đƣợc từ 0,1 đến 1% vi sinh vật là có thể đƣợc nuôi cấy sử dụng các phƣơng pháp tiêu chuẩn, vì vậy sự đa dạng của hệ vi sinh vật vẫn chƣa đƣợc khám phá hết. Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm họ Trầm, bộ Bông là lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan. Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 3 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh. Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh hiểm nghèo, có tác dụng kháng khuẩn, có tính kháng sinh. Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm hƣơng. Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp. Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị. Hệ vi sinh vật vùng rễ đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trƣởng và phát triển của cây dó bầu. Tuy nhiên, vai trò của chúng chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ cũng nhƣ chƣa có một nghiên cứu nào về sự tác động của hệ vi sinh vật đến khả năng tạo trầm. Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào sử dụng kỹ thuật mới metagenomic để nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đƣợc thành phần giới, họ, chi, loài của các mẫu nghiên cứu - So sánh sự giống và khác nhau của các mẫu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Phân lập DNA tổng số từ đất của các mẫu nghiên cứu - Gắn adapter với mỗi mẫu nghiên cứu - Xác định trình tự 16S của các mẫu nghiên cứu - Xác định độ đa dạng của các mẫu nghiên cứu - Xác định thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu - So sánh thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 4 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường I. 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cây dó bầu và khả năng tạo trầm 1.1.1. Nguồn gốc, phân bố Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm (Aquilaria), họ Trầm (Thymelaeaceae), bộ Bông (Malvales), lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan. Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả năng cho trầm hƣơng gồm: Aquilaria crassna; A.baillonii; A.sinensis hoặc A.chinesis; A.borneensis ; A.malaccensis ; A.gollocha ; A.hirta; A.rostrata; A.beccariana; A.cummingiana; A.filaria; A.khasiana; A.microcarpa; A.grandiflora; A.bancana; A.rugosa, trong đó loài A rugosa đƣợc Kiet và cộng sự phát hiện năm 2005 (Kiet et al., 2005). Chi Trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc. Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc (Hình 1, Danh lục các loài thực vật Việt Nam). Trầm hƣơng phân bố tại Việt nam có 4 loài là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 5 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Trầm hƣơng (A.crassna Pierre ex Lecomte); dó baillon (A. baillonii Pierre ex Lecomte), dó bana (A. banaensae.Phamhoang.) (Phạm Hoàng Hộ 1992) và dó quả nhăn (A. rugosa L.C. Kiet & Krbler) (Lê Công Kiệt et al., 2005). Trong đó, cây dó bầu A. crassna là loài đƣợc trồng phổ biến nhất vì khả năng loại trầm tốt nhất thế giới (Hoàng Cảnh 2006). Các loài dó baillon (A. baillon), dó bana (A. banaensae) và dó quả nhăn (A. rugosa) đều là đặc hữu có thể bắt gặp tại một vài địa điểm thuộc Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam. Trong kho đó, dó quả nhăn (A. rugosa) là loài mới đƣợc phát hiện tại Kon Tum. Hình 1.1. Phân bố dó bầu tại Việt Nam Hiện nay, các cá thể trƣởng thành của trầm hƣơng cơ bản bị tuyệt diệt trong tự nhiên. Vùng trọng điểm gây trồng cây dó trầm hiện nay ở nƣớc ta là Bán Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, và Tây Nam Bộ. Trong đó, vùng Bắc Trung Bộ tập trung chủ yếu tại Hà Tĩnh,vùng Nam Trung Bộ tập trung chủ yếu tại Quảng Nam, vùng Tây Nguyên chủ yếu tập trung tại Kon Tum, Đông Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Bình Phƣớc, Tây Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Kiên Giang và An Giang. 1.1.2. Giá trị kinh tế, dược liệu và sinh thái Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 6 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Giá trị kinh tế: Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm hƣơng. Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp. Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị. Theo công ƣớc về buôn bán quốc tế những loài động thực vật hoang dã nguy cấp, khối lƣợng mua bán trầm hƣơng trên thị trƣờng thế giới thời kỳ 1995 – 1997 khoảng 1.350 tấn. Giá mua bán Trầm hƣơng đƣợc tính theo kg tùy thuộc vào chất lƣợng. Giá bán Trầm tại thị trƣờng Dubai (Arabia Saudi) vào năm 1993 dao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt nhất) (Barden et al., 2000). Giá trị dược liệu: Trong y học, trầm hƣơng còn đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh hiểm nghèo, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyển, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Trầm hƣơng có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết thƣơng), có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện). Đặc biệt có thể dùng trầm hƣơng để chữa ung thƣ tuyến giáp. Giá trị sinh thái: Đối với môi trƣờng sinh thái và phát triển bền vững, việc đƣa dó bầu (Aquilaria sp.) vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng tại tỉnh Hà Tĩnh nói riêng và trong cả nƣớc nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng độ che phủ của rừng, chống xói mòn đất và bảo vệ môi trƣờng. Cây gió bầu góp phần bảo tồn và phát triển loài cây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 7 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường kinh tế của nƣớc ta, đây còn là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi với bảo vệ môi trƣờng, kết hợp lợi ích trƣớc mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu trên cơ sở khai thác và tái tạo lợi thế đặc hữu, ƣu việt của tài nguyên quốc gia. Hơn nữa, cây dó bầu còn có ý nghĩa tạo công ăn việc làm cho ngƣời lao động, mở ra hƣớng phát triển kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa (Thái Thành Lƣợm 2009). 1.1.3. Khả năng sinh trầm của dó bầu Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…Có 3 giả thuyết tồn tại đến sự tạo trầm liên quan đến các tác nhân bệnh lý, thƣơng tích bệnh lý hoặc thƣơng tích không bệnh lý (Ng et al., 1997). Kết quả của nghiên cứu không cung cấp đƣợc bằng chứng thuyết phục là tác nhân nào trong số 3 tác nhân trên tác động đến sự tạo trầm của cây. Ngoài ra, nghiên cứu của Oldfield et al. (1998) cho rằng quá trình tạo trầm có liên quan đến sự đáp ứng của cây với nấm. Hơn nữa, Heuveling và Phillips (1999) cho rằng nó liên quan đến đáp ứng với thƣơng tích. Nghiên cứu cho rằng sự xâm nhiễm của nấm có thể làm tăng sự tạo trầm cũng nhƣ sự đáp ứng của tế bào chủ với vết sự phát triển của nấm xâm nhiễm. Dó bầu có thể đƣợc xâm nhiễm tự nhiên bởi một vài các loại nấm nhƣ: Aspergillus spp, Botryodyplodia spp, Diplodia spp, Fusarium bulbiferum, F. laterium, F. oxysporum , F. solani, Penicillium spp, and Pythium spp. (Anon 1998; Soehartono and Mardiastuti 1997; Wiriadinata 1995). Sự tƣơng tác giữa tế bào chủ với nấm hay các tác nhân khác để tạo thành trầm vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ. Sự tƣơng tác này xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác. Căn cứ vào sự hóa nhựa nhiều hay ít mà có những sản phẩm nhƣ: Tóc, Trầm hƣơng và Kỳ nam. Thực tế cho thấy những cây dó bầu sau khi chết rục thì lƣợng Kỳ nam hoặc Trầm hƣơng thƣờng đƣợc phát hiện ở phần gốc rễ, nơi thƣờng tiếp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 8 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường xúc với hệ sinh vật đất. Đây cũng có thể là tác nhân sinh học gây bệnh tạo trầm hƣơng. Trên cơ chế hình thành trầm trong tự nhiên, 3 kỹ thuật cấy tạo trầm nhân tạo phổ biến đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu là: phƣơng pháp vật lý (gây vết thƣơng cơ giới); phƣơng pháp hóa học (xúc tác hóa chất); phƣơng pháp sinh học (xử lý với men vi sinh). Ngoài ra, một số cách tạo trầm khác nhƣ: kết hợp một số phƣơng pháp trên với nhau. Kết quả mỗi phƣơng pháp tạo trầm hƣơng khác nhau về số lƣợng, chất lƣợng, thời gian và chi phí, nhƣng hiệu quả tạo trầm chƣa cao, nhƣ kỳ vọng của các nhà sản xuất. Hiệu quả tạo trần thấp là do cơ chế và sự tƣơng tác các tác nhân (đặc biệt tác nhân sinh học) của việc sinh tạo trầm trong tự nhiên vẫn chƣa đƣợc làm rõ. Hơn nữa, trong những năm gần đây các nghiên cứu tạo các chromone invitro (thành phần chính trong tinh dầu trầm) từ nuôi cấy huyền phù tế bào của dó bầu đã thu đƣợc các kết quả khả quan ban đầu (Qi et al., 2005; Ito et al., 2005). 1.2. Ứng dụng Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật 1.2.1. Vai trò của hệ vi sinh vật đối với môi trường và cây trồng Các vi sinh vật đóng vai trò to lớn đối với các sinh vật sống trên trái đất. Sự đa dạng của hệ vi sinh vật phản ánh sự phong phú về chức năng, cung cấp các thành phần cần thiết cho tất cả các dạng sống tồn tại. Các vi sinh vật tham gia vào hầu hết các chu trình sinh, hóa học trên tái đất từ xử lý rác thải tới thúc đẩy sự tăng trƣởng và sinh sản của thực vật, động vật. Hơn nữa, vi sinh vật cung cấp cho con ngƣời các sản phẩm nhƣ: thuốc, các loại sản phẩm lên men và góp phần vào việc duy trì sức khỏe. Chỉ gần đây các nhà vi sinh vật học mới đánh giá chính xác sự đa dạng trong hệ vi sinh vật do nhiều vi sinh vật không thể đƣợc nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả dẫn đến các nhà vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 9 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường sinh vật rất khó để tìm hiểu về các hệ vi sinh vật không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp truyền thống này. Vai trò của các vi sinh vật có thể đƣợc khái quát nhƣ sau: Microbial services: Các vi sinh vật là các sinh vật rất quan trọng trên trái đất nhƣng vai trò của chúng ít đƣợc biết đến do chúng không thể đƣợc phát hiện bằng mắt thƣờng. Vi sinh vật cung cấp cho con ngƣời không khí, thức ăn và thực hiện hầu hêt các chức năng của cơ thể, trong khi đó rất ít ngƣời biết về vai trò của chúng với cuộc sống. Có rất nhiều các ví dụ điển hình cho việc cung cấp các thành phần thiết yếu của vi sinh vật cho các sinh vật khác (Madigan and Martinko 2005). Sự tạo thành oxi: Một bƣớc quan trọng trong lịch sử sống trên trái đất là sự chuyển từ hô hấp kỵ khí sang hiếu khí đƣợc tạo ra bởi vi sinh vật tự dƣỡng. Khi sự sống trên trái đất bắt đầu, môi trƣờng sống là hô hấp kỵ khí hoặc không cần oxi. Khoảng 1 tỷ năm trƣớc đây, một vài vi sinh vật ngoài đại dƣơng tiến hóa khả năng sử dụng năng lƣợng mặt trời để tham gia vào các phản ứng mà kết quả là giả phóng oxi. Oxi trên trái đất tích tụ lại tạo thành khí quyển cho đến khi lƣợng của chúng đủ để hình thành và nuôi dƣỡng các sinh vật hiếu khí. Trong đó một dạng oxi phân tử cao đƣợc hình thành là O3 do các phân tử O2 va chạm với nhau. Ozone là một phân tử rất đặc biệt, không giống nhƣ oxi, nó có thể hấp thụ tia UV. Do đó, sự sống trên bề mặt trái đất có thể phát triển vì tầng ozone đã lọc hết các tia UV và bảo vệ trái đất khỏi phóng xạ có thể phá hủy DNA và tế bào. Ngay sau khi hình thành oxi và tầng ozone ở tầng bình lƣu, sự sống bắt đầu bùng. Tầng oxi và ozone đƣợc hình thành đầu tiên hoàn toàn do vi sinh vật và ngày nay đƣợc duy trì bởi các vi khuẩn tự dƣỡng và thực vật (Handelsman 2007). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 10 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Sự chuyển hóa nito: Một trong những vai trò quan trọng khác của vi khuẩn là cung cấp nito dƣới dạng có thể hấp thu đƣợc đối với động vật và thực vật. Một trong những điều thú vị là mặc dù khí quyển có tới 79% là nito, tuy nhiên hầu hết các sinh vật đề không thể sử dụng chúng. Nito trong khí quyển tồn tại dƣới dạng bền N2 nên các sinh vật không thể bẻ gẫy các liên kết này để sử dụng đƣợc. Thực tế vi khuẩn là sinh vật duy nhất có thể bẻ gẫy các liên kết trong N2 và cố định chúng (Handelsman 2007). Duy trì sức khỏe con người: Các hệ vi sinh vật sống trong, trên cơ thể con ngƣời rất cần thiết cho sức khỏe của vật chủ. Vi khuẩn trong hệ đƣờng ruột bảo vệ con ngƣời khỏi sự tấn công của các mần bệnh, khi mà sự cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng ruột bị phá vỡ thì sẽ kéo theo sự xuất hiện của rất nhiều bệnh nhƣ: nhiễm trùng đƣờng ruột, ung thƣ ruột, béo phì và tiểu đƣờng những bệnh này không gây ra bởi một sinh vật riêng lẻ mà liên quan tới các quá trình của hệ vi sinh vật. Trong một số khía cạnh các chức năng của hệ vi sinh vật nhƣ là một đơn vị trong đó mỗi vi sinh vật phụ thuộc vào các vi sinh vật khác cần thiết cho cuộc sống và hiệu quả chức năng của hệ thống phụ thuộc vào sự tƣơng tác và hợp tác giã mỗi thoành viên trong cộng đồng. Các hệ vi sinh vật liên quan tới cơ thể con ngƣời là chủ đề của hai quá trình tiến hóa. Đầu tiên, chúng đồng tiến hóa với con ngƣời qua hàng ngàn năm cộng sinh, do đó gen của con ngƣời đã đƣợc sự hỗ trợ và dựa vào những gen những vi sinh vật này. Thứ hai, mỗi vi sinh vật trong hệ tiên hóa trong thời gian sống của chúng. Tiến hóa của các hệ vi sinh vật với loài ngƣời cũng nhƣ với sinh vật khác tạo ra sự phụ thuộc và giao tiếp giữa chúng. Kết quả là cá vi sinh vật cần đƣợc nghiên cứu về cả hệ vi sinh vật mà không chỉ nuôi cấy trong phòng thí nghiệm (Handelsman 2007). Tổng hợp kháng sinh: Các vi sinh vật là nguồn cung cấp hầu hết các kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1920, Alexander Fleming đã Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 11 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường tìm ra chất tiết penicillin của nấm có thể ngăn cản việc phát triển của vi khuẩn. Phát hiện ra penicillin đã dẫn tới việc khám phá và thƣơng mại hóa kháng sinh cho y học và nông nghiệp. Rất nhiều vi khuẩn tiết ra kháng sinh với nhiều tính chất hóa học và chức năng khác nhau, cung cấp các loại thuốc chúng ta có ngày nay. Nguyên nhân nấm và vi sinh vật sản sinh ra kháng sinh vẫn chƣa đƣợc biết nhƣng khả năng phổ biến là chúng rất quan trọng trong đời sống của các sinh vật này. Một giả thuyết đƣợc quan tâm là các sinh vật này sử dụng để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác; một giả thuyết khác là chúng sử dụng kháng sinh nhƣ là một tín hiệu để cảnh báo với các loài khác trong khu hệ (Handelsman 2007). Các vai trò khác: Vai trò của vi sinh vật với các quá trình sinh hóa và tự nhiên là vô cung to lớn: tham gia vào các chu trình dinh dƣỡng, hoặc cải tiến y học. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào các quá trình chuyển hóa thức ăn: lên men, cung cấp các enzyme hay polymers, làm sạch các rác thải độc hại và bảo vệ sức khỏe của con ngƣời, thực vật và động vật. mặc dù vi sinh vật thƣờng liên quan tới các bệnh nhƣng các tác nhân gây bệnh chỉ là một phần nhỏ của hệ vi sinh vật trên trái đất và các vi sinh vật có ích sẽ giúp kiểm soát các tác nhân gây bệnh (Handelsman 2007). Ngoài ra, các hệ vi sinh vật tồn tại trên và xung quanh cây trồng đóng vai trò hết sức quan trọng lên năng suất và chất lƣợng cây trồng. Tuy nhiên, mới chỉ một số loài vi khuẩn có vai trò đã đƣợc biết đến. Nhiều loài vi sinh vật khác có khả năng sử dụng các chất từ xác động vật và thực vật phân hủy, hoặc chuyển hóa một số nguyên tố nhƣ sắt và mangan, thành các hình thức mà thực vật có thể hấp thụ đƣợc. Thực vật không thể tồn tại và phát triển nếu thiếu hệ vi sinh vật đất. Trên một số môi trƣờng đất, cây trồng vẫn phát triển tốt ngay cả khi tồn tại các tác nhân gây bệnh ở mật độ cao. Sau nhiều thập kỷ nghiên cứu, các nhà bệnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 12 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường lý học thực vật phát hiện các hệ vi sinh vật cực kỳ phức tạp đóng vai trò ức chế tác nhân gây bệnh, các nghiên cứu chỉ ra rằng các phức hệ vi sinh vật này có thể góp phần vô cùng hữu ích cho sản xuất nông nghiệp. Không một vi sinh vật riêng lẻ nào đƣợc phân lập lại có khả năng tƣơng tự, điều này cho thấy tác động qua lại, hỗ trợ nhau trong quá trình ức chế tác nhân gây bệnh của các thành viên trong hệ vi sinh vật đất. Các nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng của hệ vi sinh vật đất là rất lớn và nghiên cứu thành công hệ vi sinh vật này hứa hẹn mang lại nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực sản xuất các chế phẩm sinh học nhƣ phân bón vi sinh hay tác động đến hệ vi sinh vật đất nhằm cải thiện và nâng cao chất lƣợng cây trồng. Qua trên có thể thấy rằng Metagenomics là một bƣớc cách mạng hóa ngành vi sinh vật vì nó đã mở ra một cửa sổ để nghiên cứu thế giới vi sinh vật khổng lồ mà trƣớc đây chƣa đƣợc nghiên cứu. 1.2.2. Giới thiệu về công nghệ metagenomics Thuật ngữ "metagenomics" lần đầu tiên đƣợc đƣa ra năm 1985 bởi nhóm nghiên cứu của Handelsman (Handelsman et al., 1998). “Metagenomics” là phƣơng pháp phân tích hệ vi sinh vật các loài vi sinh vật trong các phức hệ vi sinh vật thu trực tiếp từ môi trƣờng tự nhiên mà không cần nuôi cấy thông qua phƣơng pháp đọc trình tự (Handelsman et al., 1998; Handelsman and Sjoling, 2007, Chen and Patcher 2005; Riesenfeld et al., 2004; Schloss et al., 2004; Susannah and Edwward 2005; Patrick et al., 2005). Đây là một ngành khoa học mới nhằm cung cấp cho các nhà khoa học công cụ tiếp cận với hầu hết các loài vi sinh vật khó nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo. Do đó, metagenomics cho phép nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi sinh vật mà chƣa từng đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, vì vậy cung cấp một nhận thức hoàn toàn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 13 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường mới về cấu trúc và chức năng của hệ sinh thái cúng nhƣ sự đa dạng của đại dƣơng và hệ tiêu hóa của con ngƣời. Nhƣ đã biết, chỉ có khoảng 0,1 đến 10% trong tổng số lƣợng các loài vi sinh vật đã đƣợc quan sát trong tự nhiên là có thể nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Những sinh vật không thể nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo này đôi khi là độc nhất và có những tiềm năng độc đáo nhƣ phân hủy rác thải hay tổng hợp các hợp chất có thể sử dụng nhƣ là thuốc hay kháng sinh. Metagenomics là một công cụ mạnh mẽ trong việc tiếp cận với các nguồn tài nguyên vi sinh vật mà chƣa đƣợc khai thác về đa dạng sinh học trong các mẫu thu từ môi trƣờng. Metagenomics đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ của hệ thống điều tra, phân loại và thao tác toàn bộ vật liệu gen phân lập từ môi trƣờng. Quá trình đa bƣớc này dựa vào 4 bƣớc chính: (1) phân lập các vật liệu gen; (2) thao tác trên các vật liệu gen này; (3) xây dựng thƣ viện gen; (4) phân tích các vật liệu gen trong các thƣ viện metagenomic. Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới và có thể áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học. Mặc dù đã có những bƣớc phát triển trong biểu hiện các gen khác nhau, xây dựng thƣ viện gen , nhƣng việc thiết kế vector cần phải cải tiến hơn nữa. Các kỹ thuật phân tử hiện nay đã đƣợc chứng minh là có đủ khả năng giải quyết các vấn đề về sản phẩm nhƣ: khám phá ra các loại kháng sinh và các loại enzime mới. Các nghiên cứu gần đây về tảo biển (Sargasso Sea) (Venter et al., 2004), Acid mine drainage (AMD) (Tyson et al., 2004), đất (Tringe et al., 2005) đã sử dụng phƣơng pháp giải trình tự đoạn ngắn (shotgun-sequencing) để phát hiện và thống kê các mẫu trong các mẫu môi trƣờng khác nhau. Trong mỗi nghiên cứu, các mẫu môi trƣờng đƣợc thu thập và DNA đƣợc tách chiết trực tiếp từ các mẫu này, sau đó chúng đƣợc nhân dòng trong E.coli và các dòng nhân ngẫu nhiên này đƣợc giả trình tự. Tuy nhiên, những thƣ viện gen này không thể giả thích chức năng của các gen của mỗi sinh vật trong trong hệ vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 14 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường sinh vật. Do đó, khi công nghệ metagenomics kết hợp với kỹ thuật gen , kỹ thuật protein, phân tích dựa vào sự biểu hiện và kính hiển vi sẽ cung cấp các nhận thức sâu sắc về các vấn đề nhƣ: tiến hóa gen hay các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí ẩn vì chúng khó có thể đƣợc nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm (Allen et al., 2005). Những sự tiến bộ gần đây trong phân tích metagenomic bắt nguồn dựa vào phân tích trình tự và chức năng của các mẫu từ nƣớc, đất và liên quan với các tế bào vật chủ. Ý tƣởng nhân dòng DNA trực tiếp từ các mẫu môi trƣờng đƣợc đƣa ra đầu tiên bởi Pace (Pace et al., 1985), sau đó năm 1991 đã nhân dòng thành công vector phage (Schmidt et al., 1991). Các bƣớc cải tiến tiếp theo đã đƣợc xây dựng một thƣ viện metagenomic với DNA bắt nguồn từ hỗn hợp các sinh vật đƣợc nuôi trên cỏ khô trong phòng thí nghiệm (Healy et al., 1995). Công việc của nhóm DeLong đã đƣa tiếp nối các thành công của lĩnh vực này khi nhóm đã thực hiện thành công việc lập thƣ viện từ các loài nhân sơ từ nƣớc biển (Stein et al., 1996). Mặt khác, một thách thức lớn để tiếp cận với việc phân tích metagenomic là việc xác định các dòng gen chức năng. Sự thành công yêu cầu sự phiên mã và dịch mã chính xác gen bao gồm phân tích năng của gen để xác định các loại kháng sinh mới (Courtois et al., 2003; Gillespie et al., 2003), các loại gen kháng kháng sinh (Diaz Torres et al., 2003; Riesenfeld et al., 2004), vẩn chuyển Na_Li/(H) (Majernik et al., 2001) và các loại enzyme phân hủy (Healy et al., 1995; Henne et al., 1999; 2000). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 15 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường 1.2.3. Ứng dụng công nghệ metagenomic trong nghiên cứu đa dạng của các hệ vi sinh vật đất Hình 1.2. Các bƣớc thực hiện phân tích, đánh giá nguồn gen vi sinh vật bằng công nghệ metagenomics Hệ vi sinh vật trong môi trường đất: môi trƣờng đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lƣơng và sự đa dạng các loài trong hệ vi sinh vật. Một ví dụ nhƣ: một gram của đất rừng có chứa khoảng 4x107 tế bào sinh vật nhân sơ, trong khi đó 1 gram của đất trồng trọt và đồng cỏ có chứa khoảng 2x109 tế bào sinh vật nhân sơ. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lƣợng các sinh vật nhân sơ đƣợc xác định từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một gram đất. Số lƣợng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chƣa đƣợc biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích. Do đó, số lƣợng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều (16177 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 16 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường loài đã đƣợc xác định bởi National Center for Biotechnology Information vào năm 2005). Đất là một môi trƣờng thích hợp của vi sinh vật vì nó có chứa các khoáng chất với các kích cỡ, hình dạng và tính chất khác nhau kết hợp cùng với hệ vi sinh vật đất và các hợp chất hữu cơ trong các quá trình phân hủy. Các dạng đất sét hữu cơ phức tạp và sự ổn định của các phân tử đất sét, cát và phù sa thông qua sự tập hợp là các tính chất cấu trúc nổi bật của hỗn hợp đất. Các khu hệ vi sinh cho các vi sinh vất đất bao gồm bề mặt của các thành phần của đất và các cấu trúc lỗ phức tạp có trong đất. Trong khi đó, phƣơng pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất. Kỹ thuật độc lập với nuôi cấy: Để vƣợt qua các hạn chế trong phƣơng pháp nuôi cấy trực tiếp vi sinh vật đất, một phƣơng pháp phân tử dựa trên sự phân lập và phân tích các nucleic acid trong đó chủ yếu là DNA từ các mẫu đất mà không cần nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đã đƣợc phát triển. Các khảo sát phát sinh loài vẫn tiếp tục với việc sử dụng phƣơng pháp PCR với ở gen 16S rRNA của vi sinh vật đất sử dụng các cặp mồi phổ biến cho vi khuẩn và cổ khuẩn. Những khảo sát này cho phép liệt kê và so sánh sự đa dạng trong các môi trƣờng sống khác nhau, phân tích sự thay đổi trong cấu trúc hệ sinh thái do sự thay đổi của các tác nhân. Các gen chỉ thị khác đƣợc sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng hệ vi sinh vật bao gồm dnaK (HSP-70-type molecular chaperone) và amoA (ammonia monooxygenase). Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự đa dạng của môi trƣờng đất vẫn chỉ mới bắt đầu. Xây dựng thư viện gen DNA: Mặc dù việc lập thƣ viện gen của vi sinh vật đất là phụ thuộc vào kích cỡ của metagenome vi sinh vật đất và số lƣợng lớn các dòng gen và yêu cầu hiểu biết đầy đủ về chúng là một nhiện vụ phức tạp và khó Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 17 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường khăn. Việc nghiên cứu metagenomic ở vi sinh vật đất phải thông qua việc xây dựng thƣ viện DNA và xác định chức năng của các gen có trong thƣ viện này. Những năm gần đây, các tiến bộ mới trong phƣơng pháp đọc trình tự đã mang đến bƣớc đột phá mới trong việc xây dựng thƣ viện gen, giảm bớt đáng kể các bƣớc thực hiện trong công nghệ metagenomics (Metzker 2010; Mardis 2008). Công nghệ này đã góp phần xác định vai trò của các vi sinh vật khác nhau trong phức hệ vi sinh vật đất, nghiên cứu phân tích hệ vi sinh vật của các mẫu đất khác nhau và sản xuất các chế phẩm mới từ vi sinh vật đất. Trong các nghiên cứu gần đây, nhiều gen mã hóa các enzyme có ích và kháng sinh đã đƣợc phát hiện nhờ nghiên cứu phân tích thƣ viện gen của các vi sinh vật đất, việc xác định các gen mới này đã nói lên tiềm năng to lớn của việc xây dựng và phân tích thƣ viện gen của các vi sinh vật đất (Hardeman and Sjoling 2007; Lussier et al., 2011). Nhƣ vậy mặc dù gặp phải những trở ngại khó khăn ban đầu nhƣ quá trình tách DNA khỏi các tạp chất, số lƣợng khổng lồ các vi sinh vật tồn tại trong môi trƣờng đất, xây dựng thƣ viện metagenomic, xác định chức năng của các gen mới v.v… nhƣng cùng với những bƣớc phát triển đột phá trong phƣơng pháp đọc trình tự và công cụ tin sinh học công nghệ metagenomics hiện nay đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể và ngày càng đƣợc quan tâm phát triển hơn. Ứng dụng công nghệ metagenomics đã xác định đƣợc phần lớn các vi sinh vật có mặt trong môi trƣờng đất, so sánh mức độ đa dạng giữa các môi trƣờng khác nhau, đánh giá sự thay đổi về cấu trúc thành phần của hệ vi sinh vật dƣới tác động của các tác nhân khác nhau lên môi trƣờng. Ngày nay số lƣợng lớn dữ liệu thu đƣợc từ công nghệ metagenomics đã đƣợc công bố rộng rãi, không những tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà khoa học nghiên cứu phân tích các gen mới mà còn mở ra những hƣớng mới góp phần cải thiện nâng cao sản xuất nông nghiệp, công nghiệp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 18 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật metagenomics và xây dựng thƣ viện metagenom cho phép đánh giá đa dạng di truyền và phƣơng pháp trao đổi chất của các vi sinh vật không thể nuôi cấy trong quần thể vi sinh vật (Handelsman 2004; Iqbal et al., 2012). Các vector tách dòng thích hợp cho nghiên cứu metagenomics bao gồm BAC, cosmid và plasmid. Phân tích các dòng vô tính ở các bƣớc tiếp theo có thể thực hiện bằng cách đọc trình tự hoặc thông qua các công cụ sàng lọc chức năng. Việc phân tích dựa trên kết quả đọc trình tự có thể tiến hành theo phƣơng pháp shotgun metagenome hoặc touchdown PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho các gen quan tâm (Iqbal et al., 2012). 1.3. Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong nghiên cứu metagenomics 1.3.1. Các thế hệ máy giải trình tự trên thế giới Ngày nay, các công ty thƣơng mại trên thế giới đã cho ra đời các thế hệ máy đọc trình tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Generation Sequencing NGS). Các kỹ thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự ứng dụng huỳnh quang phân tích tự động (Olsvik et al., 1993; Pettersson et al., 2009). Các công nghệ đọc trình tự mới luôn hƣớng tới làm tăng dung lƣợng (throughput), làm giảm thời gian và giá thành (Schadt et al., 2010). Mặc dù vậy, phƣơng pháp Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide (ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuếch đại DNA in vitro) đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trƣớc đây vẫn đƣợc thực hiện xen kẽ khi cần thiết (Sanger et al., 1977). Đọc trình tự đƣợc thực hiện sau phản ứng khuếch đại DNA (nhƣ ở phƣơng pháp Sanger) đƣợc thay thế bằng đọc trình tự thực hiện ngay trong giai đoạn tổng hợp sợi DNA bổ sung cho sợi khuôn (phƣơng pháp pyrosequencing) (Nyrén, 2007; Ronaghi et al., 1996, 1998). Đây là công nghệ khởi đầu cho kỹ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 19 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường thuật “đọc trình tự bằng tổng hợp”, nền tảng của kỹ thuật đọc trình tự bộ gen hay còn gọi là kỹ thuật đọc trình tự thế hệ mới sau này. Với ƣu thế thời gian đọc nhanh, trình tự đọc đƣợc rất chính xác, cƣờng độ phát quang định lƣợng đƣợc nên dù trình tự đọc đƣợc không dài (<100 bases) nhƣng pyrosequencing thể hiện rõ ƣu thế hơn hẳn phƣơng pháp Sanger và trở thành một kỹ thuật không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử (Poehlmann et al., 2007). Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới: theo 2 nguyên lý chính bao gồm đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) đã đƣợc các thế hệ máy Roche 454, Ion Torrent và Illumina sử dụng. SBS liên quan đến việc sử dụng một hỗn hợp các dNTP đƣợc biến đổi tại vị trí 2’ bao gồm các dNTP bổ sung tự nhiên và có đánh dấu huỳnh quang. Quá trình xác định trình tự sẽ diễn ra tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR. Về mặt lý thuyết, độ dài đoạn đƣợc đọc bằng SBS có thể lên đến hàng trăm base. Nguyên lý thứ hai đó là đọc trình tự gắn nối (sequencing by ligation, SBL) đƣợc sử dụng ở máy SOLiD do George Church phát minh. SBL đã đƣợc sử dụng để xác định trình tự genome và là nền tảng cho các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới. SBL là một chu trình tuần hoàn gồm 4 bƣớc. SBL hoạt động trong cả hai chiều: chiều xuôi (5 'đến 3') và chiều ngƣợc (3 'đến 5') (Margulies et al., 2005; Schuster, 2008; Rusk, 2011, Mardis, 2008, Valouev et al., 2008). 1.3.2. Công nghệ giải trình tự Illumina (Solexa) sequencing Nguyên lý công nghệ Công nghệ giải trình tự của Illumina sử dụng các array đơn dòng và công nghệ khóa dừng thuận nghịch cho việc giải trình tự trên diện rộng với độ chính các cao. Hệ thống giải trình tự linh hoạt, hiện đại cho phép thực hiện một loạt các ứng dụng nghiên cứu genomics, transcriptomics, và epigenomics. Các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 20 http://www.lrc.tnu.edu.vn