Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen rassf1a, gstp1...

Tài liệu ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen rassf1a, gstp1 ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt

.PDF
113
86
118

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Đoàn Thị Hồng Vân ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Đoàn Thị Hồng Vân ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội-2017 LỜI CẢM ƠN Trong những năm tháng theo học và làm việc tại Phòng Thí nghiệm Sinh Y, tôi có cơ hội học hỏi kiến thức mới, có điều kiện thực hành cũng nhƣ tiếp xúc với tác phong khoa học nề nếp. Tôi đƣợc thử sức mình với những khó khăn, thử thách của thực nghiệm mang lại. Vì thế, lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin đƣợc gửi tới PGS. TS. Võ Thị Thƣơng Lan – ngƣời đã bên cạnh tôi suốt những năm tháng đó. Cô là ngƣời hƣớng dẫn đặc biệt, tâm huyết và vô cùng kiên nhẫn sửa đổi khuyết điểm của tôi. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Tạ Bích Thuận. Mặc dù, cô không hƣớng dẫn trực tiếp nhƣng những lời động viên của cô làm cho tôi suy nghĩ tích cực hơn trong lúc gặp trắc trở. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Phạm Anh Thùy Dƣơng và NCS. Ngô Thị Hà – hai ngƣời chị luôn chia sẻ kinh nghiệm và lắng nghe những khúc mắc của tôi. Tôi gửi lòng yêu mến của mình tới các bạn đồng khóa cùng toàn thể sinh viên và học viên cao học trong Phòng Thí nghiệm Sinh Y. Để có đƣợc kết quả trong luận văn này, tôi xin cảm ơn Khoa Giải phẫu, Bệnh viện K, các thầy cô Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình học tập và thực hành. Tôi gửi lòng biết ơn cũng nhƣ lời cảm ơn này tới các thành viên trong gia đình đã ủng hộ mọi quyết định của tôi. Hà Nội, ngày 27 tháng 7 năm 2017 Học viên cao học Đoàn Thị Hồng Vân MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 2 1.1. METHYL HÓA DNA VÀ UNG THƢ ................................................................ 2 1.1.1. Methyl hóa DNA .......................................................................................... 2 1.1.2. Methyl hóa DNA và ung thƣ ........................................................................ 5 1.1.3. Methyl hóa gen GSTP1 ................................................................................ 7 1.1.4. Methyl hóa gen RASSF1A ............................................................................ 8 1.2. MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA DNA ...................... 10 1.2.1. Các kỹ thuật phân tích phổ biến ................................................................. 10 1.2.2. Kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR) .. 12 1.3. KỸ THUẬT LAI ĐIỂM .................................................................................... 15 1.3.1. Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic ................................................ 15 1.3.2. Phƣơng pháp đánh dấu đầu dò ................................................................... 17 CHƢƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 26 2.1. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ........................................................ 26 2.2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................. 26 2.2.1. Nguyên liệu ................................................................................................ 26 2.2.2. Hóa chất ...................................................................................................... 27 2.2.3. Thiết bị........................................................................................................ 30 2.3. PHƢƠNG PHÁP ............................................................................................... 30 2.3.1. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú ........................................ 30 2.3.2. Xử lý DNA với sodium bisulfite ................................................................ 30 2.3.3. Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 30 2.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR............................................................................ 34 2.3.5. Tách plasmid .............................................................................................. 35 2.3.6. Phƣơng pháp xác định nồng độ DNA bằng quang phổ hấp thụ ................. 35 2.3.7. Điện di ........................................................................................................ 35 2.3.8. Phƣơng pháp lai điểm ................................................................................. 35 2.3.9. Phƣơng pháp phân tích thống kê sinh học.................................................. 36 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 38 3.1. ĐIỀU KIỆN LAI ĐIỂM TỐI ƢU CỦA ĐẦU DÒ G200 VÀ R200 PHÂN BIỆT TRÌNH TỰ BỊ METHYL HÓA VÀ TRÌNH TỰ KHÔNG BỊ METHYL HÓA ... 38 3.1.1. Kết quả tinh sạch các trình tự nucleotide bị methyl hóa và trình tự nucleotide không bị methyl hóa ................................................................. 38 3.1.2. Kết quả tổng hợp đầu dò............................................................................. 39 3.1.3. Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) và trình tự GSTP1 không bị methyl hóa (UnG) với đầu dò G200 ........................... 40 3.1.4. Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A không bị methyl hóa (UnR) với đầu dò R200 .............. 42 3.2. PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA PROMOTER GEN GSTP1 VÀ RASSF1A BẰNG KỸ THUẬT MSP ...................................................................................... 47 3.2.1. Tách chiết DNA .......................................................................................... 47 3.2.2. Xử lý DNA với sodium bisulfite ................................................................ 49 3.2.3. Xác định sự methyl hóa promoter của hai gen GSTP1 và RASSF1A trên các mẫu bệnh phẩm........................................................................................... 50 3.2.4. Mối liên hệ giữa sự methyl hóa và các thông số sinh học .......................... 55 3.2.5. Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm .............. 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 60 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng cho kỹ thuật lai điểm .................................................. 27 Bảng 2.2. Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm ............................. 28 Bảng 2.3. Trình tự mồi sử dụng cho nghiên cứu và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng ................................................................................................................ 29 Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa .................................................................................... 31 Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự GSTP1 không bị methyl hóa ......................................................................... 32 Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự RASSF1A bị methyl hóa................................................................................ 33 Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự RASSF1A không bị methyl hóa .................................................................... 33 Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tổng hợp đầu dò có và không có biotin ............................................................................................................. 34 Bảng 3.1. Điều kiện lai điểm phân biệt sản phẩm tinh sạch mang trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) và trình tự GSTP1 không bị methyl hóa (UnG) sử dụng đầu dò G200 .................................................................................................. 40 Bảng 3.2. Điều kiện lai điểm phân biệt sản phẩm tinh sạch mang trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A không bị methyl hóa (UnR) sử dụng đầu dò R200 .................................................................................................. 45 Bảng 3.3. Nồng độ và độ sạch của một số mẫu DNA tách chiết từ mẫu mô ................ 48 Bảng 3.4. Nồng độ và độ sạch của một số mẫu DNA sau xử lý với sodium bisulfite .. 49 Bảng 3.5. Tỷ lệ methyl hóa hai gen GSTP1 và RASSF1A trong ung thƣ vú ................. 55 Bảng 3.6. Mối liên hệ giữa sự methyl hóa promoter hai gen GSTP1 và RASSF1A với các thông số sinh học của bệnh nhân ung thƣ vú ......................................... 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sự methyl hóa DNA trong genome động vật có vú ........................................ 4 Hình 1.2. Cấu trúc gen GSTP1, mRNA, protein và các yếu tố điều hòa phiên mã......... 7 Hình 1.3. Cấu trúc gen RASSF1A .................................................................................... 9 Hình 1.4. Phƣơng pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite ........................................ 12 Hình 1.5. Các cặp mồi của kỹ thuật MSP ..................................................................... 13 Hình 1.6. Kỹ thuật MethyLight ..................................................................................... 14 Hình 1.7. Phƣơng pháp đánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA in vitro............ 18 Hình 1.8. Hệ thống đánh dấu gián tiếp .......................................................................... 20 Hình 1.9. Mức độ tƣơng đồng giữa trinh tự bị methyl hóa và trình tự không bị methyl hóa với đầu dò đặc hiệu. ............................................................................... 23 Hình 3.1. (A) Kết quả tách plasmid mang các trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa. (B) Kết quả điện di 4 ng tinh sạch sản phẩm PCR các trình tự nucleotide GSTP1 và RASSF1A bị methyl hóa (MeG, MeR) và trình tự nucleotide không bị methyl hóa (UnR, UnG)............................................... 39 Hình 3.2. Kết quả tổng hợp đầu dò G200, R200 có và không có biotin ....................... 39 Hình 3.3. Kết quả lai điểm với đầu dò G200 tại các nồng độ muối SSC khác nhau .... 41 Hình 3.4. Kết quả lai điểm với đầu dò R200 trên các sản phẩm tinh sạch mang trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A không bị methyl hóa (UnR) ............................................................................................................ 43 Hình 3.5. Kết quả lai điểm với đầu dò R200 tại nhiệt độ 400C, 450C và 490C trong dung dịch đệm lai có bổ sung 50% formamide ............................................ 45 Hình 3.6. Kết quả lai điểm và điện di của sản phẩm PCR tinh sạch mang trình tự bị methyl hóa (MeG, MeR) và trình tự không bị methyl hóa (UnG, UnR) ...... 46 Hình 3.7. Kết quả điện di minh họa một số DNA tách chiết từ 49 cặp mẫu bệnh phẩm mô ung thƣ vú-VU và mô liền kề-VL (A) và từ 10 mẫu đúc mô ung thƣ tuyến tiền liệt T1-T10 (B) ............................................................................. 47 Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter GSTP1 sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt (T1-T10) ......................... 51 Hình 3.9. Kết quả điện di minh họa sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter gen GSTP1 sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú ................................... 52 Hình 3.10. Kết quả điện di minh họa sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter RASSF1A sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú...................................... 54 Hình 3.11. Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú (A) và ung thƣ tuyến tiền liệt (B) ................................................................. 57 KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT APS Amonium persulfate ATP Adenine triphosphate bp Base pair C Cytosine cs. Cộng sự Da Dalton d(A, C, G)TP Hỗn hợp gồm deoxyadenine triphosphate, deoxycytosine triphosphate và deoxyguanine triphosphate DNA Deoxyribonucleic Acid DNMTs DNA methyltransferases dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates dTTP Deoxythymidine triphosphate dUTP Deoxyuridine triphosphate ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ER Estrogen Receptor GSTs Glutathione S-transferases GSTP1 Glutathione S-transferases Pi 1 HER-2 Human Epidermal growth factor Receptor 2 ICR Imprinting Control Region JNK c-Jun N-terminalkinase kb Kilobase=1000 bp LB Luria-Bertani mRNA Messenger Acid Ribonucleic MSP Methylation-Specific PCR PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PR Progesterone Receptor PSA Prostate specific antigen (kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt) RASSF1A Ras association domain family 1A RNA Ribonucleic Acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate SNP Single Nucleotide Polymorphism (đa hình đơn nucleotide) SSC Saline Sodium Citrate T Thymine TBE Tris-Borate-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) TEMED N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine TRAF2 Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 U Uracil LỜI MỞ ĐẦU Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế chính của di truyền ngoại gen, có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học nhƣ: phát triển phôi, điều hòa phiên mã, cấu trúc nhiễm sắc thể, bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen và ổn định hệ gen. Do những vai trò quan trọng đó nên hiện tƣợng methyl hóa DNA có mối liên hệ với nhiều bệnh ở ngƣời. Đối với bệnh ung thƣ, hiện tƣợng methyl hóa DNA bất thƣờng đƣợc quan sát ở các tế bào bắt đầu bị tổn thƣơng cho tới các tế bào ở các giai đoạn khác nhau. Bởi vậy, methyl hóa DNA có thể trở thành dấu chuẩn tiềm năng hỗ trợ chẩn đoán sớm, tiên lƣợng và điều trị đích ung thƣ. Các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA ngày càng phát triển và hoàn thiện không chỉ để đáp ứng độ nhạy và độ đặc hiệu cao mà còn có khả năng ứng dụng thực tiễn. Hiện nay, kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR) đƣợc sử dụng phổ biến trong nhiều phòng thí nghiệm, bởi có độ nhạy cao và không yêu cầu thiết bị đặc biệt. Mặc dù vậy, nhƣợc điểm của MSP là không định lƣợng, có hiện tƣợng dƣơng tính giả và cần thời gian chuẩn bị gel để phân tích kết quả. Do vậy, nhiều nghiên cứu đã cải tiến kỹ thuật MSP cũng nhƣ kết hợp với các kỹ thuật khác nhằm mục đích tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, khả năng ứng dụng trong thực tế và giảm chi phí. Tiếp nối các nghiên cứu phân tích sự methyl hóa các gen ức chế khối u cũng nhƣ kết hợp kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa DNA của Phòng Thí nghiệm Sinh Y, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thƣ vú và ung thƣ tuyến tiền liệt”. 1 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. METHYL HÓA DNA VÀ UNG THƢ 1.1.1. Methyl hóa DNA Di truyền ngoại gen là những thay đổi sự biểu hiện hoặc kiểu hình có khả năng di truyền qua các thế hệ nhƣng không do biến đổi về trình tự DNA [44]. Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế chính của di truyền ngoại gen liên quan trực tiếp tới sự biến đổi hóa học DNA. Đây là hiện tƣợng thêm một gốc methyl (-CH3) vào vị trí carbon số 5 của cytosine thành dạng 5-methylcytosine [44]. Hiện tƣợng này xảy ra ở prokaryote và eukaryote [24]. Ở vi khuẩn, methyl hóa DNA phân biệt DNA genome vi khuẩn với DNA của thực khuẩn thể, nhờ đó DNA của thực khuẩn thể bị cắt bởi các enzyme vật chủ. Đối với thực vật, sự methyl hóa xảy ra ở các cấu trúc CG, CHG và CHH (trong đó H có thể là A, C hoặc T). Nhƣng ở động vật có vú, sự methyl hóa xảy ra ở cytosine trong dinucleotide CpG [24]. Ở động vật có vú, sự methyl hóa DNA đƣợc xúc tác bởi họ enzyme DNA methyltransferases (DNMTs) chuyển một gốc methyl từ S-adenyl methionine (SAM) vào carbon số 5 của gốc cytosine thành dạng 5-methylcytosine [24, 44]. DNMT3A và DNMT3B có thể thiết lập sự methyl mới trên sợi DNA không đƣợc biến đổi. Mặt khác, chức năng DNMT1 trong quá trình tái bản DNA để sao chép sự methyl hóa của sợi DNA bố mẹ tới sợi mới. Cả ba enzyme này đều liên quan tới quá trình phát triển của phôi nhƣng giảm biểu hiện vào cuối giai đoạn biệt hóa [44]. Sự methyl hóa DNA có liên quan và đóng vai trò quan trọng trong bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen, ổn định hệ gen và điều hòa biểu hiện gen [12, 61]: Bất hoạt nhiễm sắc thể X: Ở giới tính cái của động vật có vú (kiểu gen XX), một trong hai nhiễm sắc thể X bị bất hoạt để bù lại sự mất cân bằng các gen liên kết với nhiễm sắc thể X so với giới tính đực (kiểu gen XY). Quá trình này xảy ra trong giai 2 đoạn phát triển phôi sớm [12]. Sự bất hoạt xảy ra ngẫu nhiên với một trong hai nhiễm sắc thể và đƣợc duy trì trên cùng nhiễm sắc thể đó trong quá trình nguyên phân của tế bào cho tới khi phát triển thành mô trƣởng thành. Cơ chế duy trì nhiễm sắc thể X bị bất hoạt là sự methyl hóa quá mức đảo CpG vùng promoter các gen phân bố dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể X bị bất hoạt (Hình 1.1D) [12]. Sự methyl hóa DNA trong trƣờng hợp này xảy ra khá muộn [61]. Quá trình bất hoạt đƣợc khởi đầu bởi sự hoạt hóa các RNA không mang mã hoạt động kiểu cis (cis-acting noncoding RNA), từ đó làm kích hoạt sự thay thế các nhân tố phiên mã, thay đổi nhiễm sắc thể và sau cùng, các CpG bị methyl hóa tại đảo CpG vùng promoter [43]. Sự methyl hóa DNA rất cần thiết cho việc duy trì ổn định trạng thái không phiên mã của các gen nằm trên nhiễm sắc thể X bị bất hoạt [12]. In dấu gen: Ở động vật có vú, hệ gen có nguồn gốc từ bố và từ mẹ có chức năng không cân bằng nhau nhƣng đều cần cho sự phát triển bình thƣờng. Tính trạng của gen đƣợc biểu hiện phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền từ bố hay mẹ. Những gen đƣợc in dấu thƣờng định vị theo cụm và các allen đƣợc đánh dấu khác nhau nhờ sự methyl hóa DNA, acetyl hóa/khử acetyl hóa histone, methyl hóa histone và thƣờng liên quan tới các sợi antisene RNA [61]. Các gen trong cụm thƣờng chịu kiểm soát của vùng điều khiển in dấu ICR (Imprinting Control Region) (Hình 1.1E). Phôi sau khi thụ tinh, methyl hóa ICR ở dòng tế bào mầm không chịu sự tái lập chƣơng trình của genome nhƣng trong quá trình phát triển của tế bào mầm, sự methyl hóa ICR bị xóa và đƣợc thiết lập lại. ICR hoạt động khi không bị methyl hóa và không hoạt động khi bị methyl hóa. Ở trạng thái hoạt động, ICR sẽ điều khiển các gen bị in dấu biểu hiện [48]. Ổn định hệ gen: Methyl hóa DNA đóng vai trò ổn định hệ gen bằng cách bất hoạt phiên mã các trình tự DNA lặp lại và các transposon nội sinh [61]. Hoạt động phiên mã ở các vùng này bị ức chế bởi sự methyl hóa quá mức. Nếu các transposon không bị ức chế bởi sự methyl hóa thì có thể làm đồng hoạt hóa các gen xung quanh hoặc phiên mã các yếu tố có khả năng di chuyển (Hình 1.1B). Nếu vùng lặp lại ở gần 3 tâm động đƣợc hoạt hóa phiên mã thì gây ra sắp xếp lại các vùng lân cận tâm động, có khả năng là nguyên nhân dẫn đến các nhiễm sắc thể không xếp hàng trong nguyên phân (Hình 1.1C) [43]. Hình 1.1. Sự methyl hóa DNA trong genome động vật có vú [43]. (A) Phân loại promoter của gen dựa trên mật độ CpG bị methyl hóa. (B) Các transposon bị ức chế bởi sự methyl hóa DNA. (C) Sự methyl hóa DNA ức chế phiên mã của các trình tự lặp lại vùng tâm động. (D) Sự methyl hóa DNA duy trì bất hoạt gen trên một nhiễm sắc thể X. (E) In dấu gen điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu allen. Sự methyl hóa DNA tại vùng điều khiển in dấu điều hòa các protein bám hoặc biểu hiện của các RNA không mang mã hoạt động kiểu cis. Điều hòa biểu hiện gen: Phân bố CpG đƣợc coi là vùng quan trọng cho sự điều hòa của di truyền ngoại gen tới biểu hiện gen [41]. CpG phân bố không ngẫu nhiên trong genome mà tập trung thành vùng đƣợc gọi là đảo CpG [11]. Đảo CpG chiếm 12% genome, dài 200 bp đến vài kb, thành phần G và C ít nhất chiếm 50% với tỉ lệ quan sát/mong đợi >0,6 [11, 41]. Các nghiên cứu hiện tại bổ sung thêm vào xung quanh đảo CpG các vùng CpG lân cận. Mặc dù các vùng này có mật độ CpG thấp hơn nhƣng lại có chức năng quan trọng đối với điều hòa biểu hiện gen. Ví dụ, trong quá trình biệt hóa 4 tế bào, sự methyl hóa vùng CpG cách đảo CpG 2 kb diễn ra mạnh hơn sự methyl hóa tại đảo CpG, chứng tỏ vai trò chính của vùng lân cận này đối với hƣớng biệt hóa của tế bào [14]. Đảo CpG thƣờng gần với vùng promoter và/hoặc exon của gen [11]. Mật độ CpG vùng promoter xác định sự methyl hóa sẽ ảnh hƣởng tới biểu hiện gen (Hình 1.1A). Theo nghiên cứu của Lister và cs. (2009), vùng promoter giàu CpG (Highdensity CpG Promoter, HCP) không bị methyl hóa ở tất cả các mô ngay cả khi sự phiên mã của gen liên quan bị bất hoạt. Vùng promoter mật độ CpG thấp (Low-density CpG Promoter, LCP) hầu nhƣ bị methyl hóa không kể tới sự hoạt hóa hay ức chế của gen. Ngƣợc lại, sự methyl hóa ở vùng promoter có mật độ CpG trung bình (Intermediatedensity CpG Promoter, ICP) có liên quan tới sự bất hoạt gen [40]. Bất hoạt phiên mã bởi sự methyl hóa DNA chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ mặc dù đã có nhiều cơ chế đƣợc đƣa ra. Cơ chế thứ nhất, sự methyl hóa tại trình tự DNA điều hòa đặc hiệu và việc thêm nhóm methyl vào DNA có thể ngăn cản các protein điều hòa bám vào trình tự này [12]. Vì thế, sự methyl hóa DNA theo cơ chế này sẽ trực tiếp ngăn cản các gen hoạt động. Một cơ chế khác điều hòa gián tiếp thông qua protein bám DNA. Những protein này có vùng bám DNA bị methyl hóa nên có thể nhận biết và bám vào một hoặc nhiều CpG bị methyl hóa. Sau đó, chúng tƣơng tác hoặc tham gia vào phức bất hoạt quá trình phiên mã nhƣ phức tái cấu trúc nhiễm sắc thể và/hoặc các enzyme biến đổi histone [12]. 1.1.2. Methyl hóa DNA và ung thƣ Methyl hóa DNA có nhiều ƣu điểm để trở thành chỉ thị sinh học trong ung thƣ và ứng dụng trong lâm sàng. Thứ nhất, các chỉ thị methyl hóa DNA đặc hiệu cho các tế bào khối u và xảy ra với phần trăm cao hơn so với biến đổi di truyền [30]. Thứ hai, DNA là phân tử hóa học ổn định, vì thế, có thể khuếch đại và phát hiện dễ dàng. Thứ ba, các khối u có nhiều vùng bị methyl hóa bất thƣờng, một trong số đó đặc hiệu cho từng loại khối u trong khi một số khác có mặt ở hầu hết các loại khối u [30]. Do đó, methyl hóa bất thƣờng DNA có thể đƣợc tìm thấy trong các tế bào biểu mô có vẻ bình 5 thƣờng [30]. Ƣu điểm này của dấu chuẩn methyl hóa DNA đã đáp ứng yêu cầu phát hiện sớm và sàng lọc quần thể ngƣời có nguy cơ mắc ung thƣ. Methyl hóa DNA bất thƣờng đƣợc quan sát ở ung thƣ tự phát và ung thƣ do di truyền [41]. Có hai hiện tƣợng thay đổi sự methyl hóa DNA thƣờng xảy ra trong tế bào ung thƣ so với tế bào bình thƣờng đã đƣợc nghiên cứu: Trong tế bào bình thƣờng, vùng dị nhiễm sắc bị methyl hóa cao. Các vùng trình tự lặp lại nhƣ LINE, SINE, IAP và Alu bị bất hoạt, nhờ đó đảm bảo genome đƣợc toàn vẹn và ổn định. Tuy nhiên, trong nhiều loại khối u, cơ chế này bị gián đoạn và xảy ra hiện tƣợng mất đi sự methyl hóa ở các vùng mà bình thƣờng bị methyl hóa. Đây đƣợc gọi là sự methyl hóa dƣới mức. Hiện tƣợng này tạo cơ hội cho sự tái tổ hợp không mong muốn trong nguyên phân. Các yếu tố gen nhảy đƣợc tái hoạt hóa và tích hợp vào vị trí bất kì trong hệ gen dẫn tới hình thành đột biến và sự bất ổn hệ gen. Điều này có liên quan tới sự phát triển khối u và các giai đoạn của bệnh [36]. Ví dụ, mất sự methyl hóa DNA của Sat2 (juxtacentromeric satellite 2) và Satα (centromeric satellite) trong ung thƣ vú có liên hệ với sự phát triển sớm của khối u trong khi ở ung thƣ buồng trứng thì chúng góp phần vào sự tiến triển của khối u và đƣợc đề nghị trở thành chỉ thị cho tiên lƣợng sớm [36]. Ngƣợc lại với hiện tƣợng trên, ở các tế bào ung thƣ, các gen chịu sự bất hoạt do sự methyl hóa quá mức đảo CpG mà trong tế bào bình thƣờng chúng không bị methyl hóa [36]. Các gen liên quan tới chu trình tế bào, sửa chữa DNA, kháng thuốc và khử độc, biệt hóa, tự chết theo chu trình, tăng sinh mạch, di căn và xâm nhập đều bị bất hoạt bởi methyl hóa quá mức [11]. Nghiên cứu của Drexlex và cs. (1998), hai gen liên quan tới chu trình tế bào là p16INK4a và p15INK4a chịu sự methyl hóa quá mức ở nhiều loại ung thƣ. Nhiều gen sửa chữa DNA cũng bị methyl hóa trong các khối u nhƣ MGMT, MLH1. Điển hình, sự methyl hóa gen BRCA1, gen liên quan tới sửa chữa đứt gãy sợi đôi DNA, đƣợc nghiên cứu nhiều ở ung thƣ vú và ung thƣ buồng trứng [36]. 6 Dấu chuẩn methyl hóa DNA đƣợc tiến hành phân tích thuận tiện và có thể sử dụng kết hợp với các phƣơng pháp chẩn đoán khác. Methyl hóa DNA không chỉ có thể ứng dụng trong chẩn đoán mà còn là công cụ hỗ trợ xác định và phân loại khối u, có khả năng dự đoán đáp ứng điều trị và cải thiện tiên lƣợng bệnh [13]. 1.1.3. Methyl hóa gen GSTP1 Glutathione S-transferases (GSTs) bao gồm các enzyme có nhiều chức năng. Các enzyme này có vai trò giải độc cho tế bào, bảo vệ các đại phân tử khỏi các chất oxi hóa [27]. GST Pi 1 (GSTP1) là một trong ba lớp phổ biến của GSTs [45]. Gen GSTP1 nằm trên vùng 11q13, dài 2.8 kb và bao gồm 7 exon. Khung đọc mở bắt đầu tại vị trí 3’ của exon đầu tiên và dài 630 bp, mã cho protein gồm 290 axit amin với khối lƣợng phân tử khoảng 23224 Da (Hình 1.2) [45]. Vùng mã hóa bị điều khiển bởi đảo CpG thuộc vùng promoter nằm ở phía trƣớc vị trí khởi đầu phiên mã. Cả khu vực này bị phân cách bởi trình tự dài lặp lại ATAAA. Trình tự lặp lại ATAAA hoạt động gần nhƣ là một nhân tố để phân chia các trạng thái khác nhau của di truyền ngoại gen [53]. Ngoài ra, nhiều nhân tố phiên mã khác nhƣ SP1 (Stimulator protein 1), AP1 (Activator protein 1), yếu tố nhân tăng cƣờng hoạt hóa tế bào B (NF-ĸB) và GATA1 cũng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện GSTP1 (Hình 1.2) [53]. Hình 1.2. Cấu trúc gen GSTP1, mRNA, protein và các yếu tố điều hòa phiên mã [45, 53]. 7 Protein GSTP1 liên quan tới điều hòa chết theo chƣơng trình của tế bào. GSTP1 tƣơng tác với tín hiệu gây chết c-Jun NH2-terminal kinase (JNK1) hoặc thụ thể liên quan với nhân tố hoại tử khối u (TRAF2). GSTP1 có chức năng chuyển hóa và giải độc nên gen GSTP1 biểu hiện ở hầu hết các tế bào, đặc biệt các tế bào tiếp xúc với môi trƣờng bên ngoài nhƣ tế bào của hệ thống tiết niệu, tiêu hóa, hô hấp [53]. Mức độ biểu hiện GSTP1 tăng chứng tỏ hoạt động giải độc tăng cƣờng để đáp ứng với các chất oxi hóa. Thực nghiệm cho thấy, chuột không biểu hiện protein GSTP1 sẽ nhạy cảm với các độc tố môi trƣờng, thúc đẩy hình thành đột biến và phát triển ung thƣ [53]. Sự methyl hóa quá mức vùng promoter dẫn tới bất hoạt biểu hiện gen GSTP1 đƣợc nghiên cứu nhƣ một chỉ thị tiềm năng cho chẩn đoán ung thƣ tuyến tiền liệt [53]. Ngoài tuyến tiền liệt, protein GSTP1 biểu hiện ở nhiều mô trong đó có mô vú [45]. Do đó, sự methyl hóa bất thƣờng vùng promoter GSTP1 cũng đƣợc phát hiện ở các bệnh nhân ung thƣ vú [53]. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự methyl hóa bất thƣờng GSTP1 là một sự kiện xảy ra sớm trong quá trình phát sinh ung thƣ vú [37], có thể trở thành chỉ thị sinh học cho sàng lọc sớm và nguy cơ mắc ung thƣ vú [18, 37]. 1.1.4. Methyl hóa gen RASSF1A Gen RASSF1 nằm trên vùng 3p21.3, có kích thƣớc xấp xỉ 11 kb, bao gồm 8 exon [15]. Sự cắt nối luân phiên cùng với việc phiên mã từ 2 promoter khác nhau tạo thành 8 đồng phân khác nhau RASSF1A-RASSF1H trong đó RASSF1A và RASSF1C là hai dạng phổ biến [3]. Gen RASSF1 có 2 vùng promoter tƣơng ứng với 2 đảo CpG khác nhau. Đảo CpG nhỏ có kích thƣớc 737 bp chứa 85 CpG và là promoter của RASSF1A, RASSF1D, RASSF1E, RASSF1F và RASSF1G. Đảo CpG lớn hơn có kích thƣớc 1365 bp chứa 139 CpG và là promoter của RASSF1B và RASSF1C [3]. RASSF1A bao gồm các exon 1, 2, 3, 4, 5, 6 mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 340 axit amin có khối lƣợng phân tử 39 kDa (Hình 1.3) [3, 15]. 8
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

Tài liệu vừa đăng

Tài liệu xem nhiều nhất