Ứng dụng của protease trong công nghệ thực phẩm
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các
lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm, lượng
enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500
triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là
enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế
biến thực phẩm (đông tụ sữa làm fomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất
lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực
phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Vì tầm quan trọng
của protease trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên nhóm
chúng tôi đã lựa chọn ứng dụng của protease trong công nghệ thực phẩm làm đề tài
báo cáo.
3
DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ
Trang
Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat.......................... 14
Bảng 2: Tỉ lệ nước, muối trong ướp cá......................................................... 27
Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain)...................................... 6
Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin).................................... 7
Hình 3: Bào tử xạ khuẩn............................................................................... 10
Hình 4: Sản xuất Fomat.................................................................................. 13
Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease............................ 10
Sơ đồ 2: quy trình chế biến nước mắm bằng phương pháp cổ truyền........... 25
Sơ đồ 3: qui trình chế biến nước mắm bằng phương pháp vi sinh vật.......... 26
Sơ đồ 4: Các giai đoạn trong sản xuất nước chấm lên men chìm................. 28
Sơ đồ 5: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật........ 29
Sơ đồ 6: Quy trình sản xuất nước tương theo phương pháp thủy phân......... 30
4
NỘI DUNG
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.
Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử
dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy
sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20
– 30%. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm
thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết.
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme
ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và
xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống.
Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp
trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân
(75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công
nghiệp (60%).
1. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE
1.1. Giới thiệu chung
Nhóm enzyme protease (peptidase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết
peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các
acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận
chuyển acid amin.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
5
Hình 1: Mô hình phân tử enzyme protease (papain)
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptitd
định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl
hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,…
Trong cơ thể protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các
enzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là các
protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhày thành ruột. Các acid
amin tự do và các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở thành
ruột. Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột. Các
acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình chuyển hóa.
Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại
thực phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực phẩm
đó hay do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực phẩm.
6
Trong nhiều trường hợp các tính chất protein thực phẩm được cải thiện nhờ
thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủy phân hạn chế có
tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và khả
năng khuếch tán đến bề mặt phân chia).
Hình 2: Cấu trúc không gian enzym protease (renin)
1.2. Phân loại protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống
phân loại các nhóm enzyme;
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase;
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptit, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một
tripeptit;
Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của
chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
7
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,
cathepsin, rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung
tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm
thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới
tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
Protease acid: pH = 2 – 4;
Protease trung tính: pH = 7 – 8;
Protease kiềm: pH = 9 – 11.
1.3. Nguồn thu protease vi sinh vật
Trong công nghiệp protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi sinh vật
như: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn.
1.3.1. Vi khuẩn:
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó
protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptid trong phân tử protein.
8
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi
khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và
kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 8)
và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và
một số giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân
tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng
pH rộng 7 – 12.
1.3.2. Nấm mốc:
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola,
A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả
năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp
chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti…
cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất
fomat.
1.3.3. Xạ khuẩn:
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus...
9
Hình 3: Bào tử xạ khuẩn
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptit của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ),
người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp
chế biến thịt.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
1.4. Thu nhận protease từ vi sinh vật
Sự thu nhận protease từ vi sinh vật trải qua các giai đoạn chính có thể tóm tắt
thành sơ đồ như sau:
Sơ đồ 1: Các giai đoạn trong quá trình thu nhận protease
10
1.4.1. Tuyển chọn chủng:
Yêu cầu tuyển chọn chủng tổng hợp được enzyme cần thiết, với lượng đáng
kể và hoạt tính cao. Đối với việc thu protease thì thu từ nguồn như nấm mốc, vi
khuẩn, xạ khuẩn.
Môi trường tuyển chọn phân lập thường từ đất, nước, lương thực, thực
phẩm…Tuy nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp
được một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), người ta cần tiến hành gây đột biến
bằng phương pháp sinh học, lý, hóa học… để tạo chủng có khả năng “siêu tổng hợp
enzyme”. Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn cần được nhân giống và nuôi trong
điều kiện tối ưu để chúng sinh sản và phát triển tốt, tổng hợp nhiều enzyme.
1.4.2. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp
Protease:
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh
hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành
phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của
vi sinh vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì
chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong
toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không
bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là
cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,
Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
Về phương pháp nuôi cấy hiên nay người ta thường dùng hai phương pháp
sau:
Nuôi bề mặt (môi trường nuôi dạng rắn) hay trên bề mặt dạng lỏng;
Nuôi bề sâu (nuôi chìm) – môi trường nuôi dạng lỏng.
1.4.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme:
Tách chiết enzyme theo các công đoạn như sau:
Phá vỡ màng tế bào để giải phóng enzyme: có thể dùng các phương pháp vật
lý, hóa học, cơ học…;
11
Dùng dung môi chiết enzyme: thường dùng nước, NaCl, dung dịch đệm có
pH ổn định và phù hợp với enzyme;
Lọc, ly tâm;
Kết tủa enzyme: có thể dùng dung môi hữu cơ (ethanol, acetol), dùng muối,
điểm đẳng điện pH = pI;
Ly tâm, tách tủa;
Sấy kết tủa cho đến khô.
Qua các bước như trên ta thu được enzyme chưa tinh khiết, cần qua giai đoạn
tinh sạch enzyme để được enzyme tinh khiết. Có nhiều phương pháp tinh sạch như
sau:
Phương pháp thẩm tích Dialise: là phương pháp sử dụng màng lọc bán thấm
chỉ cho những chất có khối lượng phân tử nhỏ đi qua;
Phương pháp kết tủa phân loại: thay đổi nồng độ chất kết tủa;
Phương pháp điện di;
Phương pháp lọc gel (gel Sephadex);
Phương pháp sắc ký.
2. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
2.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa
2.1.1. Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa [4]:
Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất. Các
sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra
vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau.
Sữa chứa hầu hết các men có trong tự nhiên. Các men này vào sữa theo tuyến
sữa và từ các vi sinh vật trong không khí hay dụng cụ chứa sữa như lipase, protease.
Protease tham gia vào quá trình thủy phân protein tạo thành các sản phẩm
như pepton, acid amin,.... Một số peptone được hình thành có thể gây vị đắng trong
sữa. Protease được hình thành tự nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn
toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ 76 ÷ 78oC.
Khi điều kiện vệ sinh không tốt, một số men tạo ra từ các nguồn vi sinh vật
xâm nhập vào gây tác hại đến sữa. Chúng có thể làm giảm nghiêm trọng chất lượng
12
của sữa ban đầu. Sự có mặt một số men trong sữa được dùng làm chỉ tiêu trong
kiểm tra chất lượng sữa.
Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và
tính cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng
như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường.
Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú
và chiếm một vị trí quan trọng trong ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa.
Có thể kể ra đây là bơ, fomat, kefir, yoghurt,…do đó các enzyme sử dụng trong
công nghiệp sữa ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng, có thể kể đến như rennin
(chymosin), pepsin có thể làm đông tụ sữa được dùng trong sản xuất fomat, sữa
đông tụ…
2.1.2. Ứng dụng trong việc sản xuất fomat:
13
Hình 4: Sản xuất Fomat
Fomat là sản phẩm chế biến từ sữa có sử dụng quá trình lên men lactic. Đây
là môt thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu, rất phổ biến và
thích hợp khẩu vị người châu Âu, châu Mỹ.
Protease ngoài khả năng thuỷ phân protein đều có khả năng đông tụ sữa tuỳ
mức độ khác nhau, mạnh nhất là rennin, sau đó là pepsin và các protease khác. Quá
trình đông tụ sữa được ứng dụng trong sản xuất fomat. Protease được thu nhận từ
một số vi sinh vật như Asp. candidus, P. roquerti, Bac. mesentericus,…
Bảng 1: Một số enzyme đông tụ sữa trong sản xuất Fomat
Nhóm
Nguồn gốc
Dạ dày bê
Động vật
Dạ dày cừu
Dạ dày dê
Dạ dày heo
Thực vật
Cynara cardunculus
Rhizomucor miehei
Vi sinh vật
R. pusillus
Cryphonectria parasitica
Vi sinh vật chuyển gen Aspergillus niger
Kluyveromyces lactis
Chymosin từ bê
2.1.2.1.
Tên enzyme
Chymosin A, pepsin và
gastriscin
Chymosin và pepsin
Chymosin và pepsin
Pepsin A, B và gastricin
Cyprosin 1, 2, 3 hoặc
cardosin A, B
Aspartic protease
Chymosine B
Rennin:
Khái niệm chung:
Năm 1951, Heinz khám phá ra enzyme đông tụ sữa ở dịch tiêu hoá
ngăn thứ tư dạ dày bê gọi là rennin.
Rennin có trong dịch dạ dày của động vật đang bú mẹ (trâu, bò, dê…
mới đẻ), đặc biệt ngăn thứ tư dạ dày bê. Khi con vật lớn hơn 5 tháng tuổi, bắt
đầu ăn, hàm lượng rennin giảm dần và được thay thế bằng pepsin.
14
Từ năm 1971, người ta đã thành công trong việc dung chymotrypsin
cố định trên carboxylmethylcellulose để làm dông tụ sữa thay cho rennin đắt
tiền [3].
Phân loại:
Rennin là một protease acid tính, số phân loại E.C.3.4.4.3. Rennin đặc
biệt có khả năng đông tụ sữa cao và phân giải protein (chủ yếu casein của
sữa).
Rennin là enzyme thuỷ phân liên kết peptit trong protein có trọng
lượng phân tử khoảng 33.000 – 34.000 Da. Rennin tinh khiết có dạng tinh
thể hình lập phương. Về mặt cấu tạo phân tử, rennin có mạch polypeptit có
gắn glycine trong mạch có vòng cacbon. Các liên kết hydro có thể đóng vai
trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc bậc 2, 3 của rennin ở dạng hoạt
động. Trong thành phần hoá học, rennin chứa nhiều amino acid có tính acid
nhưng ít hơn pepsin. Do đó, rennin thể hiện tính acid yếu hơn pepsin.
Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin:
Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của
rennin pI = 4,5. Rennin thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm
qua màng tế bào ở môi trường kiềm.
Đặc hiệu thuỷ phân:
Rennin chỉ thuỷ phân các liên kết peptit và không làm ảnh hưởng đến
liên kết ester và amin. Rennin đặc biệt có tác động mạnh lên các liên kết
được tạo nên bởi tyrosine và phenylalanine.
Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác.
Đặc tính thuỷ phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH. Ở pH = 6,8
rennin phân cắt trung bình 1/33 còn ở pH = 2,3 thì phân cắt 1/8 số liên kết
peptit trong phân tử casein.
Sự hoạt hoá prorennin thành rennin:
Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite được giữ
lại trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme.
Quá trình hoạt hoá prorennin giống sự hoạt hoá pepsinogen, ở pH < 3
quá trình chuyển hoá từ prorennin thành rennin xảy ra rất mạnh. Nhưng quá
15
trình hoạt hoá prorennin không phải là quá trình tự xúc tác và peptit được
giải phóng ra không thể có tác động kìm hãm với rennin.
Các yếu tố ảnh hưởng:
Hoạt động xúc tác tối ưu của rennin ở pH = 3,7; pH tối ưu của rennin
nằm ở vùng pH acid yếu hơn so với pepsin và thay đổi tuỳ theo cơ chất vào
khoảng 3,4 – 4. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải
và cần có sự hiện diện Ca2+. Ở pH = 3,7, các ion Ca2+ làm tăng hoạt độ
rennin, những cation hoá trị 1+ làm giảm hoạt độ của nó.
Ở pH = 7 có sự tự phân huỷ và hoạt tính thuỷ phân của rennin ở pH
này rất thấp. Hoạt tính bị giảm khi pH > 6 kèm theo sự xuất hiện protein kết
tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao.
Rennin tiếp xúc trong môi trường kiềm yếu pH = 9 sẽ bị bất hoạt dần
nhưng trong môi trường acid mạnh sẽ bất hoạt nhanh chóng.
Bảo quản rennin:
Dịch rennin có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột màu
trắng đến nâu nhạt.
Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15oC. Dịch rennin được bảo quản ở
nồng độ cao 14 – 20% và có thể thêm Na – benzoate và propylene – glycol
để bảo quản.
Thu nhận enzyme rennin:
Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế)
dưới 5 tháng tuổi.
Xử lý sơ bộ: tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn
ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng
lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh , không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme,
sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%.
Xay nhuyễn: Dùng kéo cắt nhuyễn màng nhầy dạ dày thành miếng
nhỏ khoảng 1cm rồi xay nhuyễn đồng nhất nhằm phá vỡ các mô tế bào tạo
điều kiện cho quá trình trích ly.
Chiết enzyme và chỉnh pH = 4:
16
Bản chất của quá trình chiết tách enzyme từ màng nhầy dạ dày động
vật là sự phối hợp của ba giai đoạn: phá vỡ tế bào, hoạt hoá và chiết tách
enzyme.
Có hai phương pháp là: phương pháp chiết và phương pháp tự phân.
Cả hai phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: enzyme rennin được giải
phóng từ màng nhầy dạ dày động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid
loãng hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid.
• Phương pháp 1: phương pháp chiết: dạ dày rửa sạch, tách màng
nhầy, nghiền ngâm vào nước 5% butanol hay glycerin có cloroform để
tránh nhiễm khuẩn, thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường. Sau đó
chế hoá bằng etanol để rennin kết tủa.
• Phương pháp 2: phương pháp tự phân:
♦ Niêm mạc dạ dày xay nhỏ, dùng HCl hay H 3PO4, H2SO4 với
nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hoá prorennin thành rennin.
HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày
động vật giúp prorennin được hoạt hoá thành rennin. Thời gian tự
phân 30 giờ ở 40 – 42oC.
♦ Dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường về 4 sẽ cho hoạt tính
enzyme cao, khả năng hoà tan tốt.
♦ Chiết enzyme dựa theo phương pháp tự phân do phương pháp
này có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào, hiệu suất thu
enzyme cao hơn phương pháp chiết 5–7 lần.
Phối trộn NaCl 12% vào dạ dày bê theo tỉ lệ 1: 3 giúp cho quá trình
chiết tách .
Khuấy: khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri benzoat 1% để
tránh VSV phát triển trong dung dịch, chống oxy hoá,..
Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải
mùn để thu được dịch enzyme.
Kết Tủa: tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muối
NaCl nồng độ bão hoà 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ đến khi dung dịch
bão hoà, để tủ lạnh 20 phút. Tủa bằng muối trung tính có nồng độ cao để kết
17
tủa thuận nghịch enzyme mà không làm giảm hoạt tính của chúng. Ngoài ra,
có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulfate, cồn tuyệt đối, aceton,
izopropanol… Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra một
nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính enzyme. Do đó, dung dịch sau tự
phân đã lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi
phải được cho từ từ và tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời
gian 5–10 phút, nhiệt độ thấp 0–5oC.
Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm lạnh ở
4oC, trong 45 phút, tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa.
Tinh sạch enzyme rennin:
Có thể sử dụng hai phương pháp sau:
Phương pháp1: thẩm tích bằng màng bán thấm (cellophan)
Nguyên tắc:
Màng bán thấm (cellophane) có cấu tạo gồm nhiều lỗ nhỏ dùng để
tách muối và cho chất có phân tử lượng nhỏ qua túi và giữ lại những chất
có phân tử lượng lớn theo nguyên tắc khuyếch tán từ nồng độ cao (dung
dịch trong cellophane) đến nồng độ thấp (bên ngoài cellophane) cho đến
khi đạt cân bằng nồng độ.
Cho dịch rennin thô vào giấy cellophan, đặt vào nước cất lạnh có
nhiệt độ 0–4oC, khuấy và thay nước cất lạnh cho đến khi thử âm tính với
AgNO3, thời gian thẩm tích khoảng 2 ngày đêm.
Phương pháp 2: phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G–50
Nguyên tắc:
Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau
chạy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình
tách những phân tử có kích thước và trọng lượng khác nhau. Những chất
có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm
qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài hạt gel
nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau đó, chất có
phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng.
Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân
18
đoạn theo trình tự: các phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn ra trước, các
phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ ra sau.
Sấy đông khô:
Nguyên tắc của quá trình sấy đông khô: Nguyên tắc của phương pháp
sấy đông khô là tách nước ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển từ trạng
thái đá (rắn) vào trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng (nước). Nhờ
vậy, nước được đưa ra khỏi nguyên liệu mà không làm hỏng nguyên liệu.
Quá trình sấy đông khô: gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1– làm lạnh: đây là giai đoạn quan trọng làm lạnh nguyên
liệu xuống điểm eutectic - điểm có nhiệt độ thấp nhất mà tại đó pha lỏng
và pha rắn cùng tồn tại - đảm bảo cho quá trình thăng hoa xảy ra ở giai
đoạn kế tiếp.
Giai đoạn 2– sấy bậc 1: tạo áp suất chân không và hạ nhiệt độ xuống
-40oC để nước trong nguyên liệu thăng hoa ở trạng thái lạnh.
Giai đoạn 3– sấy bậc 2: giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn
sấy bậc 1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất hoá lý. Giai
đoạn này áp suất chân không tiếp tục thúc đấy quá trình thăng hoa.
Tính chất của sản phẩm sấy đông khô:
Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng, mất đi tính chất
ban đầu thì phương pháp này giúp cho enzyme giữ nguyên được tính chất
hoá lý và có thể bảo quản trong thời gian dài.
Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng
hoặc phớt hồng.
2.1.2.2. Quy trình chế biến fomat:
Giai đoạn lên men sữa, kết tủa casein:
Sữa sau khi đã thanh trùng Pasteur ở 85 – 95 oC từ 15 - 20 phút, dùng chế
phẩm men Rennin và vi khuẩn lactic để kết tủa sữa. Vi khuẩn lactic lên men sinh ra
acid lactic, làm giảm pH môi trường tạo điều kiện thuận lợi để casein kết tủa và
enzyme Rennin giúp cho sự kết tủa casein tốt hơn, casein lắng xuống và thu được
fomat. Ngoài tác dụng kết tủa, Renin còn thủy phân một phần casein thành pepton,
acid amin…
19
Chú ý: Thanh trùng để tiêu diệt các loại vi trùng là cần thiết. Tuy nhiên,
thanh trùng đã phá vỡ cân bằng giữa các muối, làm giảm hàm lượng muối calci mà
kết quả là làm giảm khả năng đông tụ sữa bằng men sữa (rennin). Để khắc phục
nhược điểm này, người ta phải bổ sung calci dưới dạng CaCl 2.
Giai đoạn ép nén tách huyết thanh:
Phần casein kết tủa được ép từ 20 - 24 giờ, ở nhiệt độ 35 – 50 oC. Trong thời
gian này sự lên men lactic vẫn tiếp tục mạnh mẽ. Sau khi ép huyết thanh ra khỏi cục
sữa kết tủa, Fomat lúc này có thành phần chủ yếu là casein và lipid. Huyết thanh
sữa bị loại ra chứa lacto, lactalbumin, lactoglobulin…
Giai đoạn muối fomat:
Khối fomat sau khi tách huyết thanh sẽ cho vào bể nước muối nồng độ 24%
ngâm trong vài ngày để tăng vị mặn, tạo sự đồng nhất về thành phần cho khối fomat
và kìm hãm vi sinh vật có hại phát triển chủ yếu là trực khuẩn đường ruột.
Giai đoạn ủ chín:
Sau khi muối xong, khối fomat được chuyển vào hầm lên men ở nhiệt độ 18
– 22oC, độ ẩm 80 - 90%. Quá trình lên men chậm dần do đường lactoza đã bị tách
hầu hết trong giai đoạn ép nén. Trong khối fomat, vi khuẩn Propionic hoạt động
mạnh, lên men lactic thành acid propionic, acid acetic và CO 2. Cả hai acid này làm
cho Fomat có vị chua, hăng đặc biệt. Sự lên men propionic sẽ kết thúc sau 2 – 2,5
tháng. Giai đoạn này gọi là quá trình ủ chín. Tuy vậy, quá trình ủ chín Fomat vẫn
được tiếp tục một thời gian nữa cho fomat hoàn toàn chín. Trong thời gian này
casein tiếp tục được phân giải thành đạm dưới tác dụng của enzyme Rennin và vi
khuẩn lactic. Khi fomat chín thì 2/3 casein được phân giải thành pepton, acid amin
và một ít NH3.
Fomat được bảo quản lạnh, bao gói bằng một số vật liệu thích hợp, cách ẩm
và chống oxy hóa tốt để sử dụng lâu dài và vận chuyển đi xa.
2.2. Ứng dụng protease trong công nghệ sản xuất nước mắm
Nước mắm là loại thực phẩm, gia vị giàu dinh dưỡng, chứa nhiều loại acid
amin, đặc biệt là các loại acid amin không thay thế. Nhờ hệ enzyme có sẵn do hệ vi
20
sinh vật sống trong ruột cá, các protid của cá được thủy phân thành acid amin,
peptid.
Thành phần đạm có trong nước mắm:
Đạm toàn phần 13 – 30g/l
Đạm formon 12 – 18g/l
Đạm NH3 4 – 6g/l
2.2.1. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm
Gồm 3 hệ enzyme lớn:
Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase):
Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao
nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau.
Loại enzyme này có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối
với các loại peptid. Đây là nhóm thủy phân enzyme trung tính, pH tối thích
từ 5–7, pI = 4–5, nó ổn định với ion Mg 2+, Ca2+và mất hoạt tính với Zn2+,
Ni2+, Pb2+, Hg2+..
Hệ enzyme serin-protease:
Điển hình là enzyme trypsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn
đầu của quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2
và phát triển dần đạt giá trị cực đại ở tháng tứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp
chín (protein phân giải gần như hoàn toàn không còn ở dạng pepton). Hệ
enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme.
Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B nhưng
men cathepsin B dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để men
cathepsin B hoạt động được người ta thực hiện phương pháp cho muối nhiều
lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5–10, mạnh nhất ở
pH=9.
Hệ enzyme acid-protease:
Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme
này dễ bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại
một thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này
đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm.
2.2.2. Quá trình sản xuất nước mắm xảy ra theo 3 pha
21
Pha 1 (trong khoảng 25 ngày đầu): Có sự gia tăng thể tích của phần chất
lỏng nổi ở trên bề mặt sản phẩm và protein hòa tan.
Pha 2 (80 – 120 ngày): Mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên
tiếp xúc với enzyme, sản phẩm của quá trình tự phân protein được phóng
thích. Hầu như tất cả mô tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120 – 140
ngày.
Pha 3 (140 – 200 ngày): Enzyme phóng thích và tấn công vào các phần
protein hòa tan. Đây là nguyên nhân làm thay đổi hợp chất Nitơ.
Ngoài ra đường, chất béo cũng bị phân giải thành rượu và các acid
hữu cơ.
2.2.3. Nhân tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm
Nhiệt độ:
Nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng tăng, đến một nhiệt độ nào đó sẽ
không tăng nữa và có thể giảm xuống do nhiệt độ cao làm cho hệ enzyme
serin–protease mất hoạt tính. Quá trình thủy phân kém. Vì vậy phải tạo một
nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động.
Nhiệt độ 30 – 47oC thích hợp cho quá trình chế biến chượp. Chượp
càng phơi nắng nhiều nước mắm càng ngon, càng rút ngắn đườc thời gian
“chượp chín” tăng hiệu suất thủy phân.
Nhiệt độ 70oC trở lên hầu hết các hệ enzyme trong cá mất hoạt tính.
Đây là yếu tố điều chỉnh tốc độ phản ứng cho enzyme xúc tác, đơn
giản nhưng rất hiệu quả.
pH:
Mỗi hệ enzyme có pH tối thích khác nhau, vì vậy phải xem loại
enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất
nước mắm để tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động. Qua thực nghiệm
cho thấy:
pH môi trường tự nhiên từ 5,5–6,5 enzyme trypsin và pepsin hoạt
động được, đồng thời ở pH này có tác dụng ức chế một phần vi khuẩn gây
22
- Xem thêm -