Tài liệu ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp

… Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Së GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HƯNG YÊN TRƯỜNG THPT TIÊN LỮ S¸ng kiÕn kinh nghiÖm Năm học: 2012 – 2013 Môn: Sinh học §Ò tµi: “øng dông c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong n«ng nghiÖp” Ngêi thùc hiÖn: ®ç ngäc th¸i Tiªn L÷, th¸ng 4 n¨m 2013 Môc lôc Trang PhÇn A: §Æt vÊn ®Ò -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -1Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ I. LÝ do chän ®Ò tµi II. Môc ®Ých vµ yªu cÇu cña ®Ò tµi III. ý nghÜa thùc tiÔn cña ®Ò tµi IV. §èi tîng vµ ph¹m vi nghiªn cøu V. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu PhÇn B: Néi dung nghiªn cøu I. Vi nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« thùc vËt. II. T¹o c©y ®¬n béi b»ng nu«i cÊy h¹t phÊn. 2.1. C¸c yÕu ¶nh hëng. 2.2. T¸i sinh c©y. 2.3. øng dông. III. Chän dßng tÕ bµo thùc vËt. 3.1. C¬ së khoa häc. 3.2. VËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p. 3.3 chän dßng chÞu bÖnh. 3.4. Chän dßng chèng chÞu c¸c stress cña m«i trêng. 3.5. Chän dßng tÕ bµo cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao. IV. Lai tÕ bµo thùc vËt. V. ChuyÓn gen ë thùc vËt. 5.1. Mét sè vÊn ®Ò chung vÒ chuyÓn gen ë thùc vËt. 5.2. C¸c ph¬ng ph¸p chuyÓn gen. 5.2.1. ChuyÓn gen nhê vi khuÈn ®Êt Agrobacterium tumefaciens. 5.2.2. ChuyÓn gen nhê vi khuÈn ®Êt Agrobacterium tumefaciens vµ virus. 5.2.3. Ph¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp. 5.2.4. Ph¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê sung g¾n gen. 5.2.5. Ph¬ng ph¸p chuyÓn gen b»ng vi tiªm 5.3. øng dông kÜ thuËt chuyÓn gen trong n«ng nghiÖp VI. Thµnh tùu c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt ë ViÖt Nam VII. KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ thùc nghiÖm s ph¹m VIII. §iÒu kiÖn ¸p dông ®Ò tµi PhÇn C: KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ I. KÕt luËn II. KiÕn nghÞ III. Nh÷ng h¹n chÕ vµ híng ph¸t triÓn tiÕp cña ®Ò tµi Tµi liÖu tham kh¶o PhÇn A: ®Æt vÊn ®Ò 2 2 3 3 3 4 5 6 7 8 9 11 14 17 20 26 27 27 28 28 29 29 31 31 33 34 34 35 36 I. LÝ do chän ®Ò tµi ThÕ kØ XXI lµ thÕ kØ cña c«ng nghÖ sinh häc, nã ®ang trë thµnh ngµnh khoa häc mòi nhän vµ then chèt cña nhiÒu níc. Sù ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ sinh häc lµ mét trong nh÷ng tiªu chÝ hµng ®Çu ®Ó ®¸nh gi¸ tr×nh ®é ph¸t triÓn cña mét níc nµo ®ã. ChÝnh v× vËy, c¸c níc ®· tËp trung rÊt ng©n s¸ch cña vµ nh©n lùc cho sù ph¸t triÓn cña ngµnh c«ng nghÖ sinh häc (biotechnology). Víi tÇm quan träng nh vËy nªn ë tÊt c¶ c¸c Trêng §¹i häc: N«ng nghiÖp, L©m nghiÖp, Thñy S¶n, Y häc vµ Sù ph¹m ®Òu cã bé m«n hay khoa c«ng nghÖ sinh häc. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -2Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Trong ch¬ng tr×nh m«n Sinh häc vµ C«ng nghÖ Trung häc phæ th«ng cã kho¶ng tõ 5 -10 bµi häc cã liªn quan ®Õn c«ng nghÖ sinh häc. Trong c¸c ®Ò thi tuyÓn sinh ®¹i häc cã kho¶ng 2 - 5 c©u hái tr¾c nghiÖm cã liªn quan ®Õn c«ng nghÖ sinh häc. §iÒu nµy ®ßi hái c¸c ®ång chÝ gi¸o viªn vµ c¸c em häc sinh ph¶i cã nh÷ng hiÓu biÕt s©u s¾c vµ toµn diÖn vÒ c«ng nghÖ sinh häc. Tuy nhiªn, do ®©y lµ néi dung míi nªn c¸c ®ång chÝ gi¸o viªn vµ c¸c em häc cßn nhiÒu bì ngì. XuÊt ph¸t tõ nh÷ng lÝ do trªn, nªn khi tiÕn hµnh nghiªn cøu viÕt s¸ng kiÕn kinh nghiÖm, t«i ®· m¹nh d¹n chän ®Ò tµi: “øng dông c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong n«ng nghiÖp” II. Môc ®Ých vµ yªu cÇu cña ®Ò tµi 1- Môc ®Ých : X©y dùng vµ hoµn thiÖn chuyªn ®Ò “ øng dông c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong n«ng nghiÖp” vµ trë thµnh nguån t liÖu quý cho gi¸o viªn vµ häc sinh. 2- Yªu cÇu : Tr×nh bµy ®îc øng dông cña c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong c¸c lÜnh vùc sau: - Vi nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« thùc vËt - T¹o c©y ®¬n béi b»ng nu«i cÊy h¹t phÊn - Chän dßng tÕ bµo thùc vËt - Lai tÕ bµo thùc vËt - ChuyÓn gen thùc vËt - Thµnh tùu c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt ë ViÖt Nam III. ý nghÜa thùc tiÔn cña ®Ò tµi Sù hoµn thiÖn ®Ò tµi nµy sÏ trë thµnh nguån t liÖu phong phó gióp cho mçi gi¸o viªn vµ häc sinh cã c¸i nh×n toµn diÖn vµ s©u s¾c vÒ tÇm quan träng cña øng dông c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong n«ng nghiÖp. Tõ nhËn thøc ®Õn hµnh ®éng, biÕn mçi gi¸o viªn vµ häc sinh trë thµnh nh÷ng kÜ thuËt viªn, tuyªn truyÒn viªn tÝch cùc, cæ vò cho sù ph¸t triÓn cña ngµnh c«ng nghÖ sinh häc níc nhµ. Ngoµi ra, ®Ò tµi nµy cßn gióp gi¸o viªn vµ häc sinh d¹y - häc tèt m«n Sinh häc nãi chung vµ chuyªn ®Ò øng dông c«ng nghÖ sinh häc nãi riªng. Qua ®ã n©ng cao tØ lÖ thi ®ç vµo chuyªn ngµnh khèi B cña c¸c trêng §¹i häc, Cao ®¼ng vµ Trung cÊp chuyªn nghiÖp. IV. §èi tîng vµ ph¹m vi nghiªn cøu §èi tîng nghiªn cøu: Thùc vËt. Ph¹m vi nghiªn cøu: C«ng nghÖ sinh häc lµ m«n khoa häc ®a ngµnh vµ ®a lÜnh vùc. Tuy nhiªn, víi ®Ò tµi nµy t«i chØ tËp trung nghiªn cøu øng dông cña 5 lÜnh vùc: nu«i cÊy m«, t¹o c©y ®¬n béi b»ng nu«i cÊy h¹t phÊn, chän dßng tÕ bµo, lai tÕ bµo vµ kÜ thuËt chuyÓn gen ë thùc vËt. V× ®©y lµ nh÷ng kiÕn thøc cã liªn quan trùc tiÕp ®Õn vÇn ®Ò d¹y häc vµ «n thi ®¹i häc vµ cao ®¼ng cña häc sinh Trung häc phæ th«ng. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -3Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ V. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu c¸c tµi liÖu ®îc lÊy tõ c¸c nguån th«ng tin nh gi¸o tr×nh ®¹i häc vµ cao häc, c¸c chuyªn ®Ò chuyªn s©u dµnh cho båi dìng gi¸o viªn c¸c trêng chuyªn, internet, .... Råi tiÕn hµnh tæng hîp, so s¸nh, ®èi chiÕu c¸c tµi liÖu ®Ó thùc hiÖn ®Ò tµi. Ph¬ng ph¸p trao ®æi kinh nghiÖm, häc hái c¸c ®ång nghiÖp vµ c¸c chuyªn gia. Ph¬ng ph¸p tham gia c¸c héi th¶o vÒ chuyªn ®Ò “ C«ng nghÖ sinh häc” Ph¬ng ph¸p tham quan c¸c c¬ së C«ng nghÖ sinh häc : ViÖn rau qu¶ trung ¬ng, ViÖn c«ng nghÖ sinh häc, Khoa c«ng nghÖ sinh häc, ... §Æc biÖt lµ trùc tiÕp lµm thÝ nghiÖm: trong thêi gian häc cao häc, t«i ®· trùc tiÕp tham gia ®Ò tµi cÊp nhµ níc “ChuyÓn gen sinh auxin vµ gen mÉn c¶m auxin ho¹t ®éng ®Æc thô bÇu nhôy vµo c©y cam Vinh vµ quýt §êng canh“. Ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ qua thùc tiÔn s ph¹m. PhÇn B. Néi dung nghiªn cøu I. VI NH©N GIèNG b»ng nu«i cÊy m« thùc vËt Vi nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« hay cßn gäi lµ vi nh©n gièng in vitro. Qu¸ tr×nh nh©n gièng nµy ph¶i tr¶i qua nhiÒu c«ng ®o¹n: Chän nguyªn liÖu ban ®Çu cho vi nh©n gièng lµ rÊt quan träng, nã kh«ng nh÷ng quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng ban ®Çu mµ c¶ qu¸ tr×nh nh©n tiÕp theo. C¸c c«ng tr×nh cña D.Amato (1977) cho thÊy chØ cã ®Ønh sinh trëng cña chåi míi b¶o ®¶m sù æn ®Þnh vÒ di truyÒn. TiÕp ®Õn lµ ®Ønh m« ph©n sinh víi kÝch thíc nhá, kÕt hîp víi xö lý nhiÖt ®Ó lµm s¹ch bÖnh lµ nguyªn liÖu tèt ®Ó nh©n. C¸c chåi nh©n ban ®Çu thêng ®îc t¹o tõ ®Ønh chåi hoÆc ®Ønh m« ph©n sinh trªn m«i trêng th¹ch chøa c¸c muèi kho¸ng, cabonhydrat, vitamin vµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh trëng (xitokinin vµ auxin). Vi nh©n gièng ®îc b¾t ®Çu b»ng t¸ch ®Ønh chåi hoÆc m« ph©n sinh tõ c¸c c©y ®Þnh nh©n sau ®ã khö trïng vµ ®a vµo nu«i cÊy ë m«i trêng phï hîp cã xitokinin. Sù ph¸t triÓn nhanh cña m« nu«i cÊy phô thuéc vµo ¸nh s¸ng vµ nhiÖt ®é. Chåi ® îc nh©n lªn sau 3 ®Õn 4 tuÇn. C¸c chåi h×nh thµnh l¹i ®îc t¸ch ra chuyÓn sang m«i trêng míi vµ qui tr×nh cø thÕ ®îc lÆp l¹i. §Ó t¹o rÔ th× chåi nh©n ph¶i chuyÓn sang m«i trêng cã auxin. §©y lµ ph¬ng ph¸p nh©n cho hÖ sè nh©n thÊp h¬n ph¬ng ph¸p nh©n qua giai ®o¹n m« sÑo hoÆc ph«i, nhng c¸c chåi nh©n gi÷ l¹i ®îc nh÷ng ®Æc ®iÓm cña ph«i gèc, Ýt hoÆc kh«ng bÞ thay ®æi vÒ mÆt di truyÒn. HiÖn nay nhê ph¸t triÓn nh÷ng m«i trêng vµ hÖ thèng nh©n phï hîp, hÖ sè nh©n ®· ®îc t¨ng lªn nhiÒu (58 – 515 chåi/th¸ng). §Æc biÖt lµ nh©n chåi trong m«i trêng láng cã l¾c hoÆc nh©n trong c¸c reactor. Trong mét sè trêng hîp, vi nh©n gièng cã thÓ thùc hiÖn th«ng qua viÖc t¹o ph«i hoÆc t¸i sinh c©y th¼ng tõ m« sÑo. Ph¬ng ph¸p nµy cho hÖ sè nh©n cao h¬n, nhng thêng kÐo theo sù biÕn dÞ s«ma nªn tríc khi chuyÓn sang giai ®o¹n nh©n ®¹i trµ cÇn kiÓm tra kü nh÷ng thay ®æi vÒ di truyÒn. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -4Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Vi nh©n gièng cã nh÷ng u viÖt sau: - HÖ sè nh©n cao, rót ng¾n thêi gian ®a gièng vµo s¶n xuÊt. - Nh©n ®îc mét sè lîng c©y lín trong mét diÖn tÝch nhá. Trong 1 m2 nÒn cã thÓ ®Ó ®îc tíi 18.000 c©y. - C©y ®îc lµm s¹ch bÖnh vµ kh«ng tiÕp xóc víi c¸c nguån bÖnh v× vËy b¶o ®¶m c¸c c©y gièng s¹ch bÖnh. - ThuËn tiÖn vµ h¹ gi¸ thµnh vËn chuyÓn (mét thïng 40.000 c©y d©u t©y chØ nÆng 15kg). ViÖc b¶o qu¶n c©y gièng còng thuËn lîi. C¸c c©y gièng gi÷ ë nhiÖt ®é 4 oC trong hµng th¸ng vÉn cho tØ lÖ sèng ®Õn 95%. Nhu cÇu vÒ c©y gièng nh©n in vitro ngµy cµng nhiÒu. MÊy n¨m gÇn ®©y, hµng n¨m trªn thÕ giíi s¶n xuÊt kho¶ng 50 triÖu c©y, íc tÝnh ph¶i ®¹t 250 triÖu c©y/n¨m míi ®¸p øng ®îc yªu cÇu thùc tiÔn. Mét vÊn ®Ò hiÖn nay lµ gi¸ c©y trång nh©n b»ng ph¬ng ph¸p vi nh©n cßn cao (300 - 8000 ®/c©y) v× vËy cÇn ph¶i c¶i tiÕn c¸c qui tr×nh nh©n ®Ó lµm h¹ gi¸ thµnh, ®Æc biÖt lµ c¬ giíi hãa c¸c kh©u nh©n hoÆc chØ nh©n nh÷ng gièng c©y thËt quÝ hiÕm vµ cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao. Trªn thùc tÕ c©y nh©n b»ng ph¬ng ph¸p vi nh©n bao giê còng ®¾t h¬n c©y gièng tõ h¹t. HiÖn nay nh©n gièng ®· thµnh c«ng trªn nhiÒu gièng c©y nh lan, hoa cóc, hoa hång, cÈm chíng, døa, mÝa, d©u t©y, chuèi, cam, quýt, th«ng.... Vi nh©n gièng ngoµi viÖc øng dông ®Ó nh©n nhanh mét sè gièng c©y, cßn cã thÓ rót ng¾n thêi gian ®a c¸c c©y lai vµ c¸c loµi c©y nguyªn chñng tù nhiªn cã c¸c ®Æc ®iÓm tèt vµo s¶n xuÊt hoÆc nh©n nhanh bè mÑ cña c¸c cÆp lai trong s¶nh xuÊt h¹t lai. II. T¹O C©Y §¬N BéI b»ng nu«i cÊy h¹t phÊn Cã nhiÒu ph¬ng ph¸p t¹o c©y ®¬n béi, nhng tõ nh÷ng n¨m 60, viÖc t¹o c©y ®¬n béi b»ng nu«i cÊy bao phÊn vµ h¹t phÊn ®îc ph¸t triÓn. C©y ®¬n béi cã thÓ nhËn b»ng nu«i cÊy bao phÊn hoÆc h¹t phÊn trªn m«i trêng th¹ch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) hoÆc m«i trêng láng (Wernicke & cs, 1976). Trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy, h¹t phÊn ph©n chia, t¹o m« sÑo hoÆc ph«i vµ tiÕp theo cã thÓ t¹o c©y. 2.1. C¸c yÕu tè ¶nh hëng lªn sù h×nh thµnh ph«i vµ m« sÑo 2.1.1. C¸c yÕu tè liªn quan ®Õn nguyªn liÖu nu«i cÊy Tr¹ng th¸i sinh lý cña c©y cho bao phÊn hay h¹t phÊn ¶nh hëng rÊt lín ®Õn h¹t phÊn nu«i cÊy in vitro. Tuæi cña c©y, sù thay ®æi chu kú quang còng nh nhiÖt ®é lµ nh÷ng yÕu tè ¶nh hëng ®¸ng kÓ ®Õn nu«i cÊy t¹o c©y ®¬n béi. KÕt qu¶ nghiªn cøu cña Dunwell (1976) cho thÊy tØ lÖ ph«i cao nhËn ®îc khi sö dông nh÷ng nô hoa h×nh thµnh sím vµ c©y ph¸t triÓn ë nhiÖt ®é thÊp hoÆc ng¾n ngµy víi cêng ®é chiÕu s¸ng cao cho tØ lÖ t¹o ph«i tõ h¹t phÊn cao h¬n. ë mét sè lo¹i c©y h¹t phÊn ë giai ®o¹n nh©n sím cho tØ lÖ t¹o ph«i vµ m« cao, ë mét sè gièng kh¸c th× h¹t phÊn ë giai ®o¹n mitos ®Çu cho hiÖu qu¶ tèt h¬n. VÊn ®Ò kiÓu -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -5Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ gen còng rÊt quan träng, Jacobsen (1978) bao phÊn cña c¸c c©y khoai t©y nhÞ béi t¹o tõ c©y ®¬n béi sö dông ®Ó nu«i bao phÊn cã hiÖu qu¶ h¬n so víi bao phÊn tõ c©y bè mÑ. Ngoµi ra, xö lÝ bao phÊn ë nhiÖt ®é thÊp (3 - 10 oC) còng gia t¨ng tØ lÖ t¹o m« vµ ph«i tõ h¹t phÊn (Wenzel & cs, 1977). 2.1.2.C¸c yÕu tè liªn quan ®Õn ®iÒu kiÖn nu«i cÊy in vitro Thµnh phÇn cacbonhydrat trong m«i trêng hÕt søc quan träng, ®Æc biÖt lµ ®êng sucrose khi nu«i cÊy bao phÊn thuèc l¸ cÇn tõ 2% - 4%. §èi víi khoai t©y vµ lóa cÇn ®Õn 6%, thËm chÝ 12%. Trong c¸c chÊt h÷u c¬, c¸c axit nh glutamic cã t¸c dông kÝch thÝch ph¸t triÓn ph«i ë mét sè gièng c¶i vµ thuèc l¸, serin ®Æc biÖt cÇn cho ph¸t triÓn ph«i tõ h¹t phÊn thuèc l¸. C¸c dÞch chiÕt tù nhiªn nh dÞch chiÕt khoai t©y, dÞch chiÕt nÊm vµ mét sè chÊt kh¸c nh vitamin C, níc dõa cã t¸c dông tÝch cùc cho t¹o ph«i, m« sÑo vµ t¸i sinh c©y trong nu«i cÊy bao phÊn. Auxin ®Æc biÖt quan träng cho t¹o m« sÑo nhng l¹i øc chÕ t¹o ph«i. V× thÕ trong trêng hîp t¹o ph«i cÇn tr¸nh sö dông auxin. Nãi chung auxin thêng cã t¸c dông ë giai ®o¹n nu«i cÊy ban ®Çu. Xytokinin cùc k× quan träng cho ph¶n øng cña h¹t phÊn nu«i cÊy. Trong mét sè Ýt trêng hîp etylen kÝch thÝch t¹o m« sÑo. Wilson & cs (1978) cho biÕt nu«i cÊy bao phÊn trong m«i trêng láng lµm t¨ng tÇn sè t¹o ph«i ë thuèc l¸ vµ lóa m¹ch. Bæ sung vµo m«i trêng than ho¹t tÝnh cã t¸c dông lo¹i bá c¸c chÊt øc chÕ vµ lµm t¨ng hiÖu qu¶ nu«i cÊy bao phÊn. §èi víi nu«i cÊy h¹t phÊn, mËt ®é h¹t thÝch hîp lµm t¨ng hiÖu qu¶ nu«i cÊy. §èi víi thuèc l¸ mËt ®é tèi u lµ 105 h¹t/ml m«i trêng. §èi víi c¸c c©y kh¸c mËt ®é dao ®éng tõ 104 - 105. ¸nh s¸ng ®èi víi nu«i cÊy bao phÊn lóa cÇn ®Õn 3200 lux, ®èi víi thuèc l¸ chØ cÇn 300-500 lux. NhiÖt ®é b×nh thêng tõ 25-28oC lµ thÝch hîp ®èi víi nu«i cÊy bao phÊn vµ h¹t phÊn cña hÇu hÕt c¸c gièng c©y. 2.2. T¸i sinh c©y ViÖc t¸i sinh c©y tõ bao phÊn thuèc l¸ vµ mét sè c©y hä cµ kh¸c t¬ng ®èi dÔ, thËm chÝ c©y cã thÓ t¸i sinh ngay trªn m«i trêng t¹o m« sÑo hoÆc t¹o ph«i. §èi víi mét sè loµi c©y kh¸c, nhÊt lµ c©y mét l¸ mÇm (lóa, ng«, m×), trªn m«i trêng nu«i cÊy ban ®Çu chøa chÊt sinh trëng vµ ®êng cao kh«ng thÓ t¸i sinh c©y, muèn t¸i sinh c©y ph¶i chuyÓn sang m«i trêng kh«ng cã chÊt ®iÒu hßa sinh trëng. Mét sè trêng hîp ph¶i dïng zeatin vµ níc dõa míi cã thÓ t¸i sinh c©y. Trong trêng hîp t¹o c©y qua m« sÑo, viÖc t¸i sinh c©y còng cã thÓ x¶y ra trªn m«i trêng kh«ng cã chÊt ®iÒu hßa sinh trëng, nhng thêng th× ph¶i chuyÓn sang m«i trêng cã nång ®é auxin thÊp vµ nång ®é cytokinin. C¸c cytokinin thêng hay dïng lµ BAP vµ -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -6Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ kinetin. Cho thªm c¸c chÊt nh casein, lactoabumin thñy ph©n vµ níc dõa thêng lµm gia t¨ng tØ lÖ t¸i sinh c©y nhÊt lµ ®èi víi c¸c c©y ngò cèc. M« giµ do l©u kh«ng cÊy chuyÓn hoÆc m« qua cÊy chuyÓn nhiÒu lÇn thêng cho tØ lÖ t¸i sinh c©y thÊp hoÆc mÊt kh¶ n¨ng t¸i sinh. Khi nu«i cÊy bao phÊn, c¸c c©y ngò cèc th êng cã hiÖn tîng t¸i sinh nhiÒu c©y b¹ch t¹ng (cã khi ®Õn 50%). Wang vµ cs (1977) thÊy r»ng t¨ng nhiÖt ®é vµ nång ®é 2,4D lµ nguyªn nh©n dÉn ®Õn tØ lÖ c©y b¹ch t¹ng cao. Ngoµi ra, c©y b¹ch t¹ng xuÊt hiÖn nhiÒu tõ c¸c bao phÊn chøa nhiÒu vi nh©n (Teng Li-Ping, 1978). PhÇn lín c©y t¸i sinh tõ h¹t phÊn lµ c©y ®¬n béi, nhng ë mét sè loµi c©y cã c¶ c©y nhÞ béi vµ ®a béi. Nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu tÕ bµo häc cho thÊy sù t¹o thµnh c¸c c©y nhÞ béi vµ ®a béi lµ do kÕt qu¶ cña dung hîp nh©n hoÆc nh©n b¶n di truyÒn mµ kh«ng cã sù ph©n chia nh©n x¶y ra trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy. 2.3. øng dông c©y ®¬n béi tõ h¹t phÊn C¸c c©y ®¬n béi tõ h¹t phÊn cã ý nghÜa thùc tiÔn lín, tríc hÕt lµ lµm nguyªn liÖu ®Ó t¹o c¸c dßng thuÇn. Muèn t¹o dßng thuÇn ph¶i lìng béi hãa c¸c c©y ®¬n béi b»ng xö lÝ consixin hoÆc th«ng qua t¹o m« sÑo tõ c¸c c©y ®¬n béi sau ®ã t¸i sinh c©y. Nh ®· nãi trªn, ë mét sè lo¹i c©y cã thÓ nhËn ®îc c©y nhÞ béi ngay trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy bao phÊn hoÆc h¹t phÊn, nhng trong trêng hîp nµy cÇn kiÓm tra sinh hãa vµ tÕ bµo häc kü lìng. C¸c dßng thuÇn cã ý nghÜa rÊt lín trong c¶i biÕn c©y trång. Chóng ®îc sö dông t¹o c¸c c©y lai kháe m¹nh tõ c¸c cÆp lai gi÷a bè mÑ bÊt t¬ng hîp ( Chu & cs, 1978) vµ rót ng¾n thêi gian t¹o h¹t lai. C¸c dßng ®¬n béi kÐp ®· t¹o ®îc øng dông trong s¶n xuÊt lóa m¹ch, thuèc l¸, c¶i dÇu, lóa... Trong thêi gian ng¾n kho¶ng 3 ®Õn 4 n¨m hai gièng thuèc l¸ cho n¨ng suÊt cao vµ chÊt lîng tuyÖt h¶o ®· ®îc t¹o ra b»ng ph¬ng ph¸p cÊy bao phÊn (Hu han & cs, 1978). NhiÒu gièng lóa míi nh Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976), nh÷ng gièng lóa m× Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) còng ®· ®îc t¹o b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy h¹t phÊn. Ngoµi ra c¸c dßng ®¬n béi kÐp cßn ®îc sö dông ®Ó ph¸t triÓn quÇn thÓ cho viÖc lËp b¶n ®å ph©n tö. Trong nghiªn cøu, c©y ®¬n béi lµ ®èi tîng tèt ®Ó nghiªn cøu kÕt hîp ®«i gi÷a c¸c cÆp NST, ngoµi ra ph©n tÝch di truyÒn trªn quÇn thÓ c©y ®¬n béi ®Ó x¸c ®Þnh kiÓu di truyÒn c¸c tÝnh tr¹ng lÆn. C¸c c©y ®¬n béi cßn dïng lµm nguyªn liÖu t¹o c¸c c©y ®a béi lÖch. C©y ®¬n béi còng ®îc dïng trong lai kh¸c loµi ®Ó rót ng¾n thêi gian æn ®Þnh vÒ NST. Nu«i cÊy bao phÊn cã thÓ øng dông ®Ó nghiªn cøu vµ t¹o ®ét biÕn. S¬ ®å øng dông nu«i cÊy bao phÊn Bao phÊn hoÆc Gièng míi h¹t phÊn Nu«i cÊy bao phÊn C©y ®¬n béi -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -7Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Lìng béi hãa C©y lìng béi Dßng thuÇn Dßng siªu chñng III. CHäN DßNG TÕ BµO THùC VËT (CDTBTV) 3.1.C¬ së khoa häc. C¬ së khoa häc ®Çu tiªn cña CDTBTV lµ tÕ bµo thùc vËt mang tÝnh toµn n¨ng. Mçi loµi thùc vËt cã kh¶ n¨ng t¸i sinh kh¸c nhau. C¬ së thø hai lµ m« hoÆc quÇn thÓ tÕ bµo nu«i cÊy bao gåm mét sè lîng lín c¸c tÕ bµo kh«ng ®ång nhÊt. V× thÕ quÇn thÓ tÕ bµo nu«i cÊy cã thÓ xem nh quÇn thÓ thùc vËt ë ®Êy còng diÔn ra nh÷ng thay ®æi vÒ kiÓu gen, kiÓu h×nh vµ tuæi. Khi nh÷ng tÕ bµo ®îc t¸i sinh thµnh c©y sÏ thÓ hiÖn nh÷ng thay ®æi ®ã ë møc ®é c¬ thÓ, thËm chÝ cã nh÷ng quÇn thÓ tÕ bµo ph¸t triÓn tõ mét tÕ bµo ban ®Çu nhng trong suèt qu¸ tr×nh sinh trëng vµ ph¸t triÓn tÕ bµo ®Õn khi h×nh thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh cã thÓ diÔn ra nhiÒu thay ®æi vÒ di truyÒn do ¶nh hëng cña c¸c yÕu tè trong m«i trêng nu«i cÊy, ®Æc biÖt lµ c¸c chÊt ®iÒu hßa sinh trëng. MÆt kh¸c, còng cã c¸c quÇn thÓ tÕ bµo ®ång ®Òu vÒ mÆt sinh lý, di truyÒn vµ ph¸t triÓn, nh÷ng quÇn thÓ tÕ bµo nµy lµ ®èi tîng hÕt søc lÝ tëng trong viÖc sö dông c¸c chÊt g©y ®ét biÕn ®Ó thu nhËn c¸c ®ét biÕn cã ý nghÜa. Còng nh c©y trång, trong nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo, cã thÓ quan s¸t thÊy hai lo¹i thay ®æi kiÓu h×nh. Mét lo¹i lµ kÕt qu¶ cña sù thay ®æi gen, ®îc gäi lµ nh÷ng thay ®æi di truyÒn, cßn mét lo¹i kh«ng liªn quan ®Õn thay ®æi gen, ®îc gäi lµ biÕn ®æi ngoµi gen. Nh÷ng thay ®æi ngoµi gen kh«ng di truyÒn ®îc. Ngoµi nh÷ng vÊn ®Ò võa nªu, trong nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo cßn gÆp mét hiÖn t îng phæ biÕn lµ: mét phÇn ®¸ng kÓ m« hoÆc c©y t¸i sinh tõ côm tÕ bµo thËm chÝ tõ mét tÕ bµo cã thÓ thay ®æi mét sè ®Æc ®iÓm mµ kh«ng cÇn ¸p dông c¸c ph¬ng ph¸p chän läc nµo. HiÖn tîng nµy gäi lµ hiÖn tîng ph©n dßng s«ma. Cã t¸c gi¶ gäi c¸c dßng c©y t¸i sinh tõ tÕ bµo nu«i cÊy lµ “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), t¸c gi¶ kh¸c gäi c¸c dßng c©y t¸i sinh tõ protoplast lµ “protoclones” (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981) ®a ra mét ®Þnh nghÜa cã tÝnh chÊt kh¸i qu¸t h¬n “somaclonal variation’ ®Ó chØ tÊt c¶ nh÷ng thay ®æi cña c©y t¸i sinh tõ bÊt kú lo¹i tÕ bµo nu«i cÊy nµo. 3.2. VËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p chän dßng Chän vËt liÖu cho c¸c thÝ nghiÖm CDTBTV lµ rÊt quan träng. C¸c vËt liÖu cã thÓ lµ tÕ bµo cho ®Õn c¸c m« ph©n hãa. Mçi lo¹i vËt liÖu cã nh÷ng u ®iÓm vµ nhîc ®iÓm riªng. ViÖc chän vËt liÖu nµy hay vËt liÖu kh¸c cßn phô thuéc vµo sù thuÇn phôc cña c¸c ph¬ng ph¸p nu«i cÊy ®èi víi tõng lo¹i c©y. VËt liÖu thêng dïng h¬n c¶ trong CDTBTV lµ m« sÑo (callus). M« sÑo ®îc dïng ®Ó chän c¸c dßng chèng chÞu nh chÞu bÖnh (Chawla & Wenzel, 1987), chÞu muèi (McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), vµ chän c¸c dßng cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao (Nozue vµ cs, 1987; Hiraoka, 1986). -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -8Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ §èi víi m« sÑo cã thÓ sö dông c¸c ph¬ng ph¸p chän läc trùc tiÕp tøc lµ chän trªn m«i trêng chän läc chøa mét nång ®é nhÊt ®Þnh cña chÊt chän läc, c¸c m« vµ tÕ bµo ®ét biÕn cã tÝnh chän läc h¬n h¼n so víi quÇn thÓ, Mét sè t¸c gi¶ kh¸c l¹i sö dông ph¬ng ph¸p chän läc tõng bíc tøc lµ khi m« hoÆc tÕ bµo sèng sãt trªn mét nång ®é nhÊt ®Þnh cña t¸c nh©n chän läc th× l¹i chuyÓn sang nång ®é cao h¬n. Ngoµi ra còng cã thÓ sö dông kÕt hîp c¶ hai ph¬ng ph¸p. Sù æn ®Þnh cña m« chän läc lµ kh¶ n¨ng ph¸t triÓn b×nh thêng liªn tôc trªn m«i trêng chän läc hoÆc khi chuyÓn m«i trêng chän läc vµ sau mét thêi gian dµi cÊy trªn m«i trêng kh«ng chän läc vÉn mÊt ®i ®Æc ®iÓm ®· ®îc chän läc. Sö dông m« sÑo lµm nguyªn liÖu CDTBTV cã u ®iÓm lµ ®¬n gi¶n nhng nguyªn liÖu nµy cã mét sè nhîc ®iÓm lµ: dÔ t¹o ra c¸c d¹ng kh¶m v× trong m« chän läc cßn cã nhiÒu tÕ bµo b×nh thêng nªn khi t¸i sinh c©y, trong quÇn thÓ c©y t¸i sinh cã c¶ nh÷ng c©y mang ®Æc ®iÓm chän läc vµ nh÷ng c©y vÉn mang ®Æc ®iÓm gièng bè mÑ, thËm chÝ trong mét c©y cã thÓ cã phÇn chøa c¸c tÕ bµo chän läc, phÇn kh¸c vÉn chøa c¸c tÕ bµo b×nh th êng. §Ó kh¾c phôc nhîc ®iÓm nµy cã thÓ gi¶m kÝch thíc cña m«: m« cµng nhá cµng tèt. Träng lîng m« thêng dïng lµ 100-150 mg, nhng cã thÓ gi¶m xuèng ®Õn 10-20 mg (Wakaha & Widholin, 1987). TÕ bµo nu«i cÊy dÞch láng ®· ®îc nhiÒu t¸c gi¶ sö dông trong CDTBTV (Kishinami & Widholin, 1986; Watad vµ cs, 1985). §èi víi lo¹i tÕ bµo nµy c¸c ph¬ng ph¸p chän läc trùc tiÕp vµ chän tõng bíc còng ®· tiÕn hµnh cã kÕt qu¶ trªn nhiÒu ®èi tîng. Sö dông tÕ bµo dÞch láng ®Ó CDTBTV cã u ®iÓm lµ tÕ bµo hoÆc côm nhá c¸c tÕ bµo ®îc tiÕp xóc ®ång ®Òu víi t¸c nh©n chän läc, nhng mét nhîc ®iÓm quan träng lµ sau khi chän läc kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y bÞ gi¶m ®¸ng kÓ vµ trong nhiÒu trêng hîp cã thÓ mÊt h¼n. HÇu hÕt c¸c dßng chän läc th«ng qua hÖ thèng tÕ bµo dÞch láng ®Òu kh«ng nhËn ®uîc c©y (Dix, 1990). V× thÕ hÖ thèng tÕ bµo dÞch láng cã thÓ sö dông ®Ó chän c¸c dßng cã kh¶ n¨ng tæng hîp vµ tÝch lòy c¸c chÊt thø cÊp th× phï hîp h¬n. Trong trêng hîp nµy th× tÕ bµo dÞch láng ®¸p øng ®îc môc ®Ých nu«i cÊy tÕ bµo trªn qui m« lín ®Æc biÖt lµ viÖc sö dông c¸c c«ng nghÖ nu«i tÕ bµo thùc vËt trªn qui m« c«ng nghiÖp. Protoplast (tÕ bµo trÇn) thùc vËt lµ nguyªn liÖu cã thÓ ®¸p øng ®îc nhiÒu mÆt trong CDTBTV. Protoplast lµ hÖ thèng tÕ bµo ®¬n triÖt ®Ó nhÊt. Tõng tÕ bµo ®îc ph¸t triÓn ®ång ®Òu trong m«i trêng, mçi tÕ bµo ph©n chia t¹o ra c¸c quÇn thÓ tÕ bµo vµ m« sÑo, cuèi cïng lµ c¸c m« sÑo t¸i sinh thµnh c©y hoµn chØnh, chÝnh v× thÕ cã thÓ tr¸nh ®îc hiÖn tîng kh¶m. NhiÒu dßng tÕ bµo kh¸ng thuèc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs, 1986) vµ c¸c dßng cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao (Fujita & cs, 1985) ®· ® îc chän läc nhê sö dông hÖ thèng protoplast. Tríc ®©y viÖc nu«i cÊy vµ t¸i sinh c©y tõ protoplast cßn gÆp nhiÒu khã kh¨n, nhÊt lµ t¸i sinh c©y tõ protoplast cña nh÷ng loµi c©y cã ý nghÜa kinh tÕ, nªn viÖc sö dông hÖ thèng nu«i cÊy protoplat trong CDTBTV cßn bÞ h¹n chÕ. HiÖn nay hÖ thèng nu«i cÊy protoplast víi hiÖu qu¶ cao ë nhiÒu loµi c©y trong ®ã cã c¶ c¸c c©y trång quan träng nh khoai t©y, cµ chua, ng«, lóa, lóa m× ®· ®îc c«ng bè. V× vËy protoplast sÏ trë thµnh vËt liÖu lý tëng cho CDTBTV. CÇn ph¶i nãi thªm r»ng protoplast cßn lµ ®èi tîng quan träng trong -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái -9Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ c¶i biÕn di truyÒn thùc vËt th«ng qua hÖt thèng nu«i cÊy in vitro ®Æc biÖt lµ dung hîp tÕ bµo vµ chuyÓn gen. §Ó tr¸nh nh÷ng khã kh¨n trong t¸i sinh c©y tõ m« sÑo, tÕ bµo nu«i cÊy dÞch láng vµ protoplast, mét sè t¸c gi¶ ®· sö dông c¸c m« ph©n hãa hoÆc m« t¸ch rêi lµm nguyªn liÖu CDTBTV. Mét trong nh÷ng m« ph©n hãa ®îc sö dông lµ ph«i tõ h¹t (Kueh & Bright, 1981) hoÆc ph«i ph¸t triÓn tõ tÕ bµo nu«i cÊy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs (1985) ®· chän ®îc dßng kh¸ng thuèc khi xö lÝ mÇm b»ng kh¸ng sinh. McCabe & cs (1989) còng nhËn ®îc dßng kh¸ng thuèc khi xö lÝ m¶nh l¸. Bªn c¹nh viÖc sö dông c¸c ph¬ng ph¸p chän läc in vitro ®èi víi m« sÑo, tÕ bµo dÞch láng, prptoplast vµ m« ph©n hãa cã thÓ kÕt hîp xö lÝ c¸c t¸c nh©n g©y ®ét biÕn ®Ó lµm t¨ng dÇn sè ®ét biÕn vµ c¸c kiÓu ®ét biÕn. Miller & cs (1985) xö lÝ protoplast sau khi t¸ch b»ng tia cùc tÝm (UV) hoÆc N -methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG). Ph¬ng ph¸p t¬ng tù còng ®îc mét sè t¸c gi¶ kh¸c tiÕn hµnh cã hiÖu qu¶ khi sö dông. N -ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, vµ tia X (Maliga & cs, 1981). Ngoµi ra cã thÓ xö lÝ mÉu vËt b»ng c¸c chÊt g©y ®ét biÕn tríc khi ®a vµo nu«i cÊy vµ chän läc. 3.3. Chän dßng chÞu bÖnh MÆc dï ph¬ng ph¸p truyÒn thèng cã thÓ t¹o ®îc c¸c dßng hoÆc gièng chÞu bÖnh nhng trong mét vµi trêng hîp kh«ng thÓ chän ®îc c¸c dßng chÞu bÖnh b»ng nh÷ng ph¬ng ph¸p nµy hoÆc chän ®îc nhng tèn nhiÒu c«ng søc vµ thêi gian. ViÖc g©y nhiÔm bÖnh nh©n t¹o cho mét sè lîng lín c©y ®Ó t¹o chän gièng chÞu bÖnh lµ c¶ mét vÊn ®Ò, ngoµi ra g©y nhiÔm trong nhµ kÝnh nhiÒu khi còng kh«ng thµnh c«ng. Kh«ng nh÷ng thÕ b»ng ph¬ng ph¸p truyÒn thèng viÖc chän c¸c ®ét biÕn ®¬n gen hoÆc ®a gen kh¸ng cïng mét lo¹i bÖnh gÆp rÊt nhiÒu h¹n chÕ: thø nhÊt lµ ph¶i chän bè mÑ phï hîp, thø hai lµ lai ngîc mÊt rÊt nhiÒu thêi gian, thø ba lµ kh«ng chuyÓn ®îc c¸c gen lÆn hoÆc nhiÒu gen mét lóc. §Æc biÖt ®èi víi c¸c loµi c©y chØ nh©n v« tÝnh th× chuyÓn gen kh«ng thÓ thùc hiÖn ®îc b»ng lai t¹o. §ét biÕn thùc nghiÖm cã thÓ t¹o ®îc gièng c©y chÞu bÖnh nhng tÇn sè xuÊt hiÖn c¸c ®ét biÕn ®¬n gen rÊt thÊp (10 -4 - 10-6), ngoµi ra tØ lÖ kh¶m ë c¸c c©y ®ét biÕn t¬ng ®èi cao. Tõ 1970 ®· cã nhiÒu nghiªn cøu cho thÊy kü thuËt CDTBTV in vitro cã thÓ kh¾c phôc ®îc nhiÒu vÊn ®Ò trong chän dßng chÞu bÖnh nh: qui m« thÝ nghiÖm, thêi gian chän läc, khèng chÕ ®îc ®iÒu kiÖn g©y nhiÔm. Ngoµi ra cã thÓ nhËn ®îc c¸c ®ét biÕn ®¬n gen vµ ®ét biÕn lÆn. NÕu tÇn sè ®ét biÕn ®¬n gen trong trêng hîp ®ét biÕn thùc nghiÖm lµ 10-4 - 10-6 th× ë quÇn thÓ c©y t¸i sinh (R o) tõ m« hoÆc tÕ bµo lªn tíi 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981). NÕu kÕt hîp xö lÝ c¸c t¸c nh©n g©y ®ét biÕn trong nu«i cÊy in vitro cã thÓ lµm t¨ng tÇn sè ®ét biÕn h¬n n÷a ( Maliga & cs, 1981). Tuy nhiªn chän dßng chÞu bÖnh trong ®iÒu kiÖn in vitro cã mét sè vÊn ®Ò cÇn nghiªn cøu gi¶i quyÕt nh vÊn ®Ò t¬ng hîp gi÷a chñ vµ t¸c nh©n g©y bÖnh v× ®èi tîng l©y -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 10 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ nhiÔm ë ®©y lµ m« sÑo hoÆc tÕ bµo chø kh«ng ph¶i lµ c©y trong tù nhiªn v× thÕ t¸c nh©n g©y bÖnh kh«ng nhËn ra chñ (nhÊt lµ ®èi víi c¸c nÊm kh¸ng sinh). §Ó chän dßng chÞu bÖnh cã thÓ sö dông trùc tiÕp t¸c nh©n g©y bÖnh hoÆc c¸c ®éc tè g©y bÖnh (§TGB). PhÇn lín t¸c nh©n g©y bÖnh ®· ®îc sö dông lµ virus vµ ®èi tîng ®îc l©y nhiÔm lµ protoplast. VÊn ®Ò then chèt lµ ph¶i t¹o ®îc quÇn thÓ tÕ bµo bÞ nhiÔm ®ång ®Òu vµ ph©n biÖt ®îc tÕ bµo chÞu bÖnh víi tÕ bµo kh«ng bÞ nhiÔm v× c¶ hai ®Òu cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn trªn cïng mét ®iÒu kiÖn nu«i cÊy. §Ó gi¶i quyÕt c¸c vÊn ®Ò trªn, Shepard (1975), Murakishi vµ Carlson (1982) ®· t¸ch protoplast tõ c©y bÞ l©y nhiÔm liªn tôc, sau ®ã nu«i vÊy vµ chän läc. Murakishi vµ Carlson cßn sö dông chñng virus (TMV-Flavum) cã mµu vµng l©y nhiÔm c©y thuèc l¸ ®¬n ®¬n béi, sau ®ã cÊy m¶nh l¸ lªn m«i trêng phï hîp cho sù sinh trëng cña tÕ bµo s¹ch virus hoÆc kh¸ng virus. C¸c t¸c gi¶ thÊy r»ng m« tõ tÕ bµo s¹ch virus sinh trëng nhanh vµ cã mµu xanh, cßn tÕ bµo kh¸ng virus sinh trëng chËm h¬n vµ cã mµu vµng. Mét sè nÊm vµ vi khuÈn g©y bÖnh nh Phoma lingam, Plamidomonas brassicae (Sacristan, 1955; Sacristan vµ Hoffman, 1979; Pullman vµ Rappaport, 1983; Prasad & cs, 1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs, 1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae (Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977), Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) còng ®· ®îc sö dông ®Ó chän dßng chÞu bÖnh. Prasad vµ cs (1984) ®· chän ®îc dßng kª ngäc kh¸ng bÖnh mèc s¬ng b»ng ph¬ng ph¸p t¸i sinh c©y tõ hoa tù non ®· bÞ nhiÔm nÊm. Sun & cs (1986) ®· nu«i m« sÑo tõ ph«i lóa cïng víi vi khuÈn g©y bÖnh Xanthomonas oryzae vµ ®· chän ®îc c¸c dßng kh¸ng bÖnh. Mét sè t¸c gi¶ kh¸c ®· tiÕn hµnh g©y nhiÔm c¸c c©y t¸i sinh tõ m« trong ®iÒu kiÖn in vitro vµ nhËn ®îc nh÷ng kÕt qu¶ ®¸ng ghi nhËn (Peros, 1984; Barlass, 1986; Joung & cs, 1987). Ngoµi ra cã thÓ ®a c¸c c©y t¸i sinh tõ m« hoÆc tÕ bµo trång trªn ®Êt bÞ nhiÔm nÊm, nhng híng nµy cha ®îc tiÕn hµnh nhiÒu. C¸c ®éc tè g©y bÖnh (§TGB) tõ mét sè nÊm vµ vi khuÈn ®· ®îc dïng nhiÒu trong chän dßng chÞu bÖnh, sö dông §TGB trong chän dßng cã u ®iÓm lµ c¸c tÕ bµo cã thÓ bÞ nhiÔm ®ång ®Òu vµ nhiÒu §TGB cã t¸c dông l©y nhiÔm tÕ bµo (Daly, 1981), v× thÕ cã thÓ sö dông c¸c nguyªn liÖu mét c¸ch ®a d¹ng. Ngoµi ra cßn cã sù t¬ng quan thuËn gi÷a kh¸ng §TGB trong ®iÒu kiÖn in vitro vµ in vivo. Chän c¸c dßng kh¸ng §TGB ®· ®îc tiÕn hµnh thµnh c«ng ®èi víi protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tÕ bµo nu«i dÞch láng (Connell & Heale, 1986), m« sÑo tõ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey, 1986), ph«i thø cÊp (Sacristan, 1982) vµ ®Ønh chåi (Gantotti & cs, 1985). Sö dông §TGB ®èi víi tÕ bµo cßn më ra nhiÒu triÓn väng chän ®îc c¸c ®ét biÕn kh¸ng bÖnh hiÕm (Carlson, 1973). Bªn c¹nh nh÷ng u ®iÓm cña §TGB, trong chän dßng chÞu bÖnh cÇn lu ý mét sè vÊn ®Ò nh x¸c ®Þnh cô thÓ vai trß cña ®éc tè trong qu¸ tr×nh g©y bÖnh v× trong nhiÒu trêng hîp c©y bÞ bÖnh nhng kh«ng ph¸t hiÖn cã ®éc tè hoÆc x¸c ®Þnh ®îc trong c©y cã ®éc tè g©y -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 11 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ bÖnh nhng ®éc tè l¹i kh«ng cã vai trß trong viÖc g©y bÖnh (Scheffer, 1983). Mét vÊn ®Ò n÷a lµ trong nhiÒu trêng hîp c©y t¸i sinh tõ m« kh¸ng §TGB l¹i kh«ng cã kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh. §Ó kh¾c phôc vÊn ®Ò nµy, Meredith (1984) cho r»ng mÆc dï cã nh÷ng ®Æc ®iÓm cã thÓ kh«ng thÓ hiÖn ë c©y t¸i sinh, nhng nÕu ta t¸i sinh ®îc sè lîng c©y nhiÒu ®Õn møc cÇn thiÕt th× còng cã thÓ cã nh÷ng c©y mang nh÷ng ®Æc ®iÓm mong ®îi. §iÒu nµy ®· ®îc kh¼ng ®Þnh b»ng c«ng tr×nh cña Thanutong & cs (1983). C¸c t¸c gi¶ ®· nhËn ®îc 1020% sè c©y t¸i sinh cã kh¶ n¨ng kh¸ng ®éc tè cña Pseudomonas vµ ®éc tè cña Alternaria. §TGB dïng trong chän dßng chÞu bÖnh cã thÓ lµ d¹ng th« hoÆc tinh khiÕt. §TGB th« díi d¹ng dÞch chiÕt tõ nÊm hoÆc vi khuÈn ®îc sö dông nhiÒu ®Ó chän dßng chÞu bÖnh. NhiÒu dßng c©y kh¸ng §TGB ®· ®îc c«ng bè khi sö dông §TGB th« nh khoai t©y kh¸ng P.infestas (Behnke, 1979), thuèc l¸ kh¸ng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuèc l¸ kh¸ng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kh¸ng F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines vµ Luke (1985) ®· nhËn ®îc dßng ng« kh¸ng H.maydis r.t vµ dßng lóa m¹ch kh¸ng H.victoriae khi sö dông ®éc tè s¹ch (tinh khiÕt) tõ hai lo¹i nÊm trªn. Ngoµi ph¬ng ph¸p chän dßng chÞu bÖnh trong ®iÒu kiÖn in vitro, b»ng xö lÝ tÕ bµo, m« hoÆc c©y t¸i sinh tõ tÕ bµo vµ m« víi virus, nÊm, vi khuÈn g©y bÖnh hoÆc §TGB, øng dông kh¶ n¨ng ph©n dßng s«ma cña c©y t¸i sinh tõ tÕ bµo hoÆc m«, ta cã thÓ chän ® îc dßng chÞu bÖnh mµ kh«ng cÇn xö lÝ t¸c nh©n g©y bÖnh. NhiÒu t¸c gi¶ (Bretter & cs, 1980; Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) ®· chän c¸c dßng chÞu bÖnh theo ph¬ng ph¸p nµy. Gièng mÝa chÞu bÖng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) vµ gièng lhoai lang “Sarlet” chÞu bÖnh (Moyer & Collins, 1983) ®· ®îc chän vµ ®a vµo s¶n xuÊt. HiÖn nay khi viÖc t¸i sinh c©y tõ tÕ bµo hoÆc m« ®· trë nªn dÔ dµng ®èi víi hÇu hÕt c¸c gièng c©y th× chän läc theo híng nµy cã nhiÒu høa hÑn vµ trªn thùc tÕ ®· cã c¸c gièng chÞu bÖnh ®uîc ®a vµo s¶n xuÊt nhng cã mét sè mÆt h¹n chÕ cña ph¬ng ph¸p nµy: Thø nhÊt lµ ph¶i thö nghiÖm mét quÇn thÓ lín c©y t¸i sinh trong ®iÒu kiÖn tù nhiªn; thø hai lµ ph©n dßng s«ma lµm thay ®æi nhiÒu ®Æc ®iÓm kh¸c nªn nhiÒu khi chän ®îc dßng chÞ bÖnh nhng l¹i ¶nh hëng ®Õn ®Æc ®iÓm kinh tÕ (Bidney & Shepard, 1981). Nh×n chung ®· cã nhiÒu c«ng tr×nh më ra triÓn väng trong viÖc sö dông nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo ®Ó chän dßng chÞu bÖnh ë c©y trång nhng cho ®Õn nay vÉn cßn nhiÒu vÊn ®Ò cÇn gi¶i quyÕt nh c¬ chÕ t¬ng hîp gi÷a chñ (m« hoÆc tÕ bµo) víi c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh, liªn quan ®Õn vÊn ®Ò nµy lµ c¬ chÕ nhiÔm bÖnh trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy in vitro. Mét vÊn ®Ò quan träng n÷a lµ x¸c ®Þnh ®îc vai trß cña c¸c §TGB trong qu¸ tr×nh chän läc in vitro. Mét sè vÊn ®Ò liªn quan vÒ mÆt kÜ thuËt trong nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo lµ rót ng¾n thêi gian nu«i cÊy vµ t¸i sinh c©y ®Ó tr¸nh nh÷ng thay ®æi vÒ h×nh th¸i vµ mét sè ®Æc ®iÓm kh¸c. ViÖc chän lùa ®èi tîng ®Ó ¸p dông kÜ thuËt nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo vµo chän dßng chÞu bÖnh còng rÊt quan träng. Mét sè t¸c gi¶ kh¸c cho r»ng nu«i cÊy m«, tÕ bµo cã thÓ ¸p dông ®Ó chän dßng chÞu bÖnh ë c¸c loµi c©y sinh s¶n v« tÝnh th× phï hîp vµ cã kÕt qu¶ h¬n (Daub, 1986; Jones, 1990). Ngoµi ra nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo cã thÓ ¸p dông ®Ó chän c¸c dßng chÞu bÖnh ®¬n gen hoÆc chÞu bÖnh mang gen lÆn (Jones, 1990). ViÖc sö dông -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 12 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ c¸c §TGB kh«ng ®Æc hiÖu ®Ó chän c¸c dßng chÞu bÖnh ®Æc biÖt mµ b»ng c¸c ph¬ng ph¸p th«ng thêng kh«ng chän ®îc còng ®· ®îc ®Ò cËp (Jones, 1990). 3.4. Chän dßng chèng chÞu c¸c stress cña m«i trêng C¸c stress m«i trêng bao gåm nh÷ng ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i trêng nh phÌn, chua, mÆn, kh«, h¹n, nãng, l¹nh.... ViÖc chän t¹o nh÷ng gièng c©y trång chèng chÞu ®îc c¸c stress m«i trêng lµ rÊt cÇn thiÕt. Theo Nabors (1990) hiÖn nay cã Ýt nhÊt 25% ®Êt trång bÞ mÆn (chñ yÕu do NaCl), 25% sè ®Êt chua (lµ do ion nh«m). 40-60% ®Êt kh« h¹n. Ngoµi ra do viÖc c¶i t¹o m«i trêng nh tíi tiªu, bãn ph©n, sö dông c¸c chÊt diÖt s©u bä vµ diÖt cá còng dÉn ®Õn viÖc cÇn thiÕt chän t¹o c¸c gièng c©y trång chèng chÞu víi c¸c t¸c nh©n trªn. Nh ®· tr×nh bµy ë c¸c phÇn trªn, nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo cã thÓ ®ãng gãp mét phÇn trong viÖc t¹o chän c¸c dßng chèng chÞu c¸c stress m«i trêng. Tríc khi giíi thiÖu mét sè thµnh tùu trong lÜng vùc nµy chóng t«i ®Ò cËp ®Õn mét sè vÊn ®Ò liªn quan ®Õn c¬ së còng nh ph¬ng ph¸p chän c¸c dßng chèng chÞu stress m«i trêng. Ngoµi mét sè vÊn ®Ò chung ®îc ®Ò cËp ë c¸c phÇn chän dßng chÞu bÖnh vµ dßng cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao, chän dßng chèng chÞu stress m«i trêng cßn cã mét sè vÊn ®Ò liªn quan ®Õn c¬ së cña tÝnh chèng chÞu ë møc ®é tÕ bµo vµ ë c©y hoµn chØnh. §Æc biÖt lµ c¬ së di truyÒn cña tÝnh chèng chÞu stress m«i trêng cßn cha ®îc biÕt râ.NhiÒu t¸c gi¶ cho r»ng cã thÓ cã nhiÒu alen tham gia vµo tÝnh chèng chÞu stress m«i trêng, ngoµi ra c¸c alen nµy thêng lµ lÆn nªn kh«ng thÓ hiÖn trong trêng hîp dÞ hîp tö. §©y lµ nh÷ng vÊn ®Ò lµm cho viÖc chän c¸c dßng chèng chÞu stress m«i trêng cha cã ®îc nh÷ng thµnh tùu mong muèn. Ngoµi ra mét sè vÊn ®Ò quan träng n÷a lµ t¬ng quan gi÷a kh¶ n¨ng chèng chÞu c¸c stress m«i trêng ë c©y hoµn chØnh vµ tÕ bµo nu«i cÊy rÊt phøc t¹p v× thÕ chän dßng b»ng nu«i cÊy m« cã thÓ kh«ng t¹o ®îc c©y chèng chÞu nh÷ng ®iÒu kiÖn ®Æc biÖt trªn ®ång ruéng. MÆc dï cã mét sè vÊn ®Ò hÕt søc quan träng ®îc nªu ë trªn, thùc tÕ vÉn cã nh÷ng c¬ së vµ sè liÖu ®¸ng tin cËy vÒ triÓn väng øng dông nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo ®Ó chän c¸c dßng chèng chÞu víi c¸c stress m«i trêng: chóng ta ®Òu biÕt nhiÒu ®Æc ®iÓm ®a gen cã thÓ biÕn ®æi bëi ®ét biÕn x¶y ra ë mét trong c¸c gen tham gia vµo ®Æc ®iÓm nµy. Nh÷ng kÕt qu¶ nghiªn cøu cña Gorham vµ cs ( 1987 ) vµ Ashraf vµ cs ( 1986 ) ®· cho thÊy tÝnh chèng chÞu víi mét sè stress liªn quan ®Õn thay ®æi nhiÔm s¾c thÓ vµ di truyÒn qua thÕ hÖ sau. Ngoµi ra ®· cã nh÷ng sè liÖu vÒ sù ph©n ly theo Mendel cña c¸c ®Æc ®iÓm ®îc chän läc (Comner & Meredits, 1985). Cho ®Õn nay hÇu hÕt c¸c c«ng tr×nh chän dßng chèng chÞu stress m«i trêng ®Òu chän theo ph¬ng ph¸p chän läc trùc tiÕp. ViÖc tiÕn hµnh xö lý c¸c stress cã thÓ tiÕn hµnh khi m« sÑo (callus) míi h×nh thµnh hoÆc khi m« sÑo ®· ph¸t triÓn. C¸c stress cã thÓ ë møc ®é thÊp hoÆc ë møc ®é g©y chÕt, vµ cã thÓ xö lý mét nång ®é nhÊt ®Þnh hoÆc khi tÕ bµo chÞu ®îc mét nång ®é nµo ®ã l¹i ®a lªn nång ®é cao h¬n. ViÖc tiÕn hµnh xö lý cã thÓ liªn tôc hoÆc gi¸n ®o¹n, thêi gian xö lý cã thÓ ng¾n hoÆc dµi. Cho ®Õn nay cha cã nh÷ng nghiªn cøu so s¸nh cô thÓ ®èi víi tõng trêng hîp trªn. Tèt nhÊt tïy tõng ®èi tîng cô thÓ -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 13 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ mµ kÕt hîp viÖc chän läc theo c¸ch nµy hay c¸ch kh¸c. §©y lµ mét vÊn ®Ò nghiªn cøu vÒ mÆt ph¬ng ph¸p nhng hÕt hÕt søc quan träng, nã ®ãng gãp vµo sù thµnh c«ng trong viÖc chän c¸c dßng chèng chÞu stress m«i trêng. Muèn nhËn nh÷ng ®ét biÕn míi hoÆc ®ét biÕn lÆn, chän läc cã thÓ tiÕn hµnh ë m« ®¬n béi tõ h¹t phÊn, nÕu chän läc ë m« ®¬n béi tõ h¹t phÊn lai F1 cã thÓ nhËn ®îc c¸c ®ét biÕn ®¬n gen vµ c¸c t¸i tæ hîp cña c¸c alen s½n cã. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y ®· cã nh÷ng bíc tiÕn ®¸ng kÓ trong viÖc chän dßng chèng chÞu muèi, h¹n, chua vµ nhiÖt ®é. NhiÒu dßng chÞu muèi (NaCl) ®· ®îc chän läc tõ m« nu«i cÊy cña c¸c loµi Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium, Ipomoea babatas L. (Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985), Medicago sativa L. (McCoy 1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and Swartz, 1984). TÝnh chèng chÞu trong mét vµi trêng hîp ®îc th«ng b¸o lµ æn ®Þnh ë møc ®é tÕ bµo vµ c©y hoµn chØnh (Winnicov, 1991). VÒ c¬ chÕ cña tÝnh chÞu muèi còng ®· cã nh÷ng kÕt qu¶ ®¸ng ghi nhËn. ë ViÖt Nam viÖc tiÕn hµnh chän c¸c dßng thuèc l¸ ®Þa ph¬ng chÞu muèi còng ®îc tiÕn hµnh vµ ®· thu ®îc nh÷ng kÕt qu¶ tiÕn bé (NguyÔn Hoµng Léc & cs, 1990). KÕt qu¶ nghiªn cøu cña mét sè t¸c gi¶ cho thÊy abscisic axit (ABA) lµ chÊt cã liªn quan ®Õn viÖc tæng hîp c¸c protein míi (®Æc biÖt lµ protein víi ph©n tö lîng 26) xuÊt hiÖn ë c¸c dßng chÞu muèi (Sigh & cs, 1987). Mèi t¬ng quan gi÷a ABA, tÝnh chÞu muèi vµ sù tæng hîp c¸c protein ®Æc biÖt lµ vÊn ®Ò nghiªn cøu hÕt søc lý thó trong nh÷ng n¨m tíi. C¸c dßng chÞu h¹n ®· ®îc th«ng b¸o (Bressan & cs, 1981, Hand & cs, 1983), c¸c t¸c gi¶ ®· sö dông chÊt g©y h¹n PEG 4000 hoÆc PEG 6000 ®a vµo m«i trêng ®Ó chän. VÊn ®Ò t¹o dßng kh¸ng nh«m ®îc Couner vµ cs nghiªn cøu kh¸ tØ mØ (Conner & Meredith, 1985). C¸c t¸c gi¶ ®· chän ®îc c¸c dßng thuèc l¸ kh¸ng nh«m æn ®Þnh, tÝnh kh¸ng nh«m lµ ®Æc ®iÓm tréi vµ di truyÒn qua thÕ hÖ sau. ViÖc chän c¸c dßng chèng chÞu víi nhiÖt ®é thÊp hoÆc cao còng ®· cã tiÕn bé: Preil vµ cs. (1983) ®· nhËn ®îc c¸c c©y cóc chÞu ®îc nhiÖt ®é thÊp. Nh×n chung phÇn lín c¸c nghiªn cøu tõ tríc ®Õn nay ®Òu tËp trung vµo t×m c¬ chÕ cña tÝnh chÞu l¹nh vµ chÞu nãng. Nh÷ng kÕt qu¶ cña Chen vµ Gusta (198) nhËn ®îc trªn Triticum aetivum L, Secale cereale L, vµ Bromus inermis Leyss cho thÊy ABA lµm t¨ng kh¶ n¨ng chÞu l¹nh ®¸ng kÓ. C¸c t¸c gi¶ cho r»ng ABA lµ chÊt cÇn thiÕt ®Ó t¹o dßng chÞu l¹nh. Orr vµ cs còng nhËn ®îc nh÷ng kÕt qu¶ t¬ng tù vÒ t¸c dông cña ABA. C¶ tÝnh chÞu l¹nh vµ tÝnh chÞu nhiÖt ®Òu liªn quan ®Õn viÖc tæng hîp hµng lo¹t c¸c protein míi nhng vai trß cô thÓ cña tõng lo¹i protein míi nµy nh thÕ nµo? Chóng cã vai trß g× trong qu¸ tr×nh chÞu l¹nh vµ chÞu nhiÖt cao? §©y lµ nh÷ng c©u hái cßn ®ang ®Ó ngá. Chän dßng chèng chÞu stress m«i trêng lµ yªu cÇu chiÕn lîc trong c«ng t¸c gièng c©y trång nhng cho ®Õn nay phÇn lín c¸c c«ng tr×nh tËp trung vµo t×m kiÕm c¸c ph¬ng ph¸p chän läc vµ t×m ra c¬ chÕ cña lo¹i chèng chÞu nµy. Nh÷ng kÕt qu¶ nhËn ®îc míi chØ lµ nh÷ng c¬ së hÕt søc ban ®Çu. §Ó cã ®îc nh÷ng thµnh c«ng trong t¬ng lai vµ cã ®îc nh÷ng ¸p dông vµo thùc tiÔn nh÷ng nghiªn cøu thuéc hai híng trªn vÉn lµ ®iÒu quan t©m hµng ®Çu. 3.5. Chän dßng tÕ bµo cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 14 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ C¸c chÊt thø cÊp ë thùc vËt lµ nh÷ng hîp chÊt trong c¬ thÓ thùc vËt nhng kh«ng cã vai trß ®èi víi c¸c qu¸ tr×nh sèng c¬ b¶n, nh÷ng hîp chÊt nµy gi÷ vai trß thø cÊp trong c©y. Thùc ra vÒ mÆt tiÕn ho¸, c¸c chÊt thø cÊp ®ãng vai trß hÕt søc quan träng trong qu¸ tr×nh ®Êu tranh sinh tån v× ®©y lµ nh÷ng chÊt ®éc ®èi víi ®éng vËt vµ vi sinh vËt, c¸c chÊt cã t¸c dông quyÕn rò c«n trïng hoÆc cã mÇu s¾c vµ h¬ng vÞ ®Æc biÖt. Sù ph¸t triÓn cña kü thuËt nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y ®· më ra triÓn väng sö dông kü thuËt nµy ®Ó nu«i sinh khèi lín cã kh¶ n¨ng tæng hîp c¸c chÊt thø cÊp. HiÖn nay cã nhiÒu phßng thÝ nghiÖm ®· ký víi c¸c h·ng s¶n xuÊt ®Ó thu nhËn c¸c chÊt thø cÊp tõ tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy trªn quy m« c«ng nghiÖp. Mét trong nh÷ng yªu cÇu cña qu¸ tr×nh c«ng nghiÖp ho¸ tÕ bµo nu«i cÊy ®Ó thu nhËn c¸c chÊt thø cÊp lµ vÊn ®Ò t¹o c¸c dßng cho n¨ng suÊt cao vµ æn ®Þnh. VËt liÖu thêng dïng ®Ó chän dßng tÕ bµo cho n¨ng suÊt chÊt thø cÊp cao lµ m« hoÆc tÕ bµo nu«i cÊy dÞch láng. §èi víi c¸c chÊt thø cÊp cã mµu, cã thÓ chän b»ng m¾t. §èi víi c¸c chÊt thø cÊp kh«ng cã mµu tríc khi cÊy chuyÓn cÇn ®îc ph©n tÝch. §©y lµ viÖc lµm tèn kh¸ nhiÒu c«ng søc vµ thêi gian. §Ó kh¾c phôc, Ogino vµ cs (1978) ®· ®a ra ph¬ng ph¸p Ðp tÕ bµo. Theo ph¬ng ph¸p nµy, c¸c côm tÕ bµo hoÆc m« ®îc Ðp gi÷a hai tê giÊy läc, nhùa tÕ bµo sÏ ngÊm vµo giÊy läc sau ®ã dïng ph¬ng ph¸p nhuém ®Ó x¸c ®Þnh. §èi víi mét sè chÊt ®îc tÕ bµo tiÕt ra m«i trêng th× cã thÓ x¸c ®Þnh theo ph¬ng ph¸p dïng mµng phñ than ho¹t tÝnh ®Ó hÊp thô c¸c chÊt sau ®ã dïng tia cùc tÝm (UV) ®Ó x¸c ®Þnh (Knoop and Beiderback, 198). Ngoµi ra cã thÓ sö dông ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh dùa vµo tÝnh chÊt k×m h·m sù ph¸t triÓn cña vi khuÈn cña c¸c chÊt do tÕ bµo tiÕt ra nh berberine ch¼ng h¹n (Suzuki & cs, 1987). C¸c ph¬ng ph¸p kh¸c nh phãng x¹ hoÆc ph©n biÖt tÕ bµo b»ng huúnh quang còng ®· ®îc sö dông. §Ó thiÕt lËp mét hÖ thèng chän c¸c dßng tÕ bµo cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao thµnh c«ng, viÖc nghiªn cøu c¸c yÕu tè liªn quan ®Õn tÝch lòy c¸c chÊt trong tÕ bµo nu«i cÊy lµ rÊt quan träng, mÆc dï vÊn ®Ò nµy cho ®Õn nay vÉn cha ®îc s¸ng tá.Tuy nhiªn vai trß cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng vµ nång ®é ®êng ®· ®îc ghi nhËn. Hµm lîng c¸c chÊt thø cÊp trong tÕ bµo cßn phô thuéc vµo t¨ng trëng vÒ sinh khèi, tèc ®é tæng hîp vµ tiÕt ra m«i trêng cña c¸c chÊt nµy. Thêng thêng tÕ bµo nu«i cÊy tÝch lòy c¸c chÊt thø cÊp ë giai ®o¹n cuèi cña chu kú sinh trëng (Zenk & cs, 1977) v× thÕ tÕ bµo nu«i cÊy cã tèc ®é sinh trëng nhanh vµ kh«ng kÌm theo sù gia t¨ng tèc ®é tæng hîp c¸c chÊt thø cÊp. Nh÷ng tÕ bµo nu«i cÊy cã tèc ®é ph©n chia chËm th× cã u thÕ h¬n trong viÖc t¹o c¸c chÊt thø cÊp. VËt liÖu khëi ®Çu cho chän dßng cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao lµ mét vÊn ®Ò ®îc nhiÒu t¸c gi¶ quan t©m. Zenk (1978) nhËn thÊy tÕ bµo dÞch láng tõ c©y C.roseur cã n¨ng suÊt cao cho hµm lîng chÊt thø cÊp cao h¬n tÕ bµo dÞch láng tõ c©y cã n¨ng suÊt thÊp. Còng trªn ®èi tîng nµy Roller (1978) l¹i nhËn thÊy tÕ bµo nu«i cÊy tõ c©y cã n¨ng suÊt cao kh«ng ph¶i lóc nµo còng cho n¨ng suÊt chÊt thø cÊp cao. KÕt qu¶ nµy còng ®îc c«ng bè trªn nh÷ng loµi c©y kh¸c (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979). Cho ®Õn -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 15 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ nay vÉn cha cã chøng minh ch¾c ch¾n vÒ t¬ng quan gi÷a n¨ng suÊt cña c©y lµm nguyªn liÖu vµ n¨ng suÊt cña tÕ bµo nu«i cÊy. Theo Wilson (1990) nªn sö dông nh÷ng c©y ®a d¹ng vÒ di truyÒn ®Ó t¹o dßng tÕ bµo khëi ®Çu. Mét sè t¸c gi¶ thÊy r»ng c¸c bé phËn kh¸c nhau cña c©y dïng ®Ó t¹o ra c¸c dßng tÕ bµo kh«ng ¶nh hëng tíi n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp (Speake & cs, 1964). NhiÒu t¸c gi¶ kh¸c l¹i nhËn ®îc c¸c kÕt qu¶ cho thÊy c¸c dßng tÕ bµo tõ c¸c bé phËn kh¸c nhau cña c©y, thËm chÝ tõ cïng mét bé phËn còng cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp kh¸c nhau (Zenk & cs, 1975; Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982). Hall vµ Yeoman (1987) cßn cho biÕt trong quÇn thÓ tÕ bµo nu«i cÊy kh¶ n¨ng tæng hîp c¸c chÊt (®Æc biÖt lµ ®èi víi c¸c chÊt mµu) còng kh¸c nhau gi÷a c¸c tÕ bµo. Nh÷ng sù biÕn ®éng vÒ tÝch lòy c¸c chÊt thø cÊp nµy lµ nh÷ng c¬ së ®Ó t×m c¸c ph¬ng ph¸p phï hîp cho viÖc chän ra c¸c dßng cho n¨ng suÊt cao. Cho ®Õn nay ®· tån t¹i ba hÖ thèng chän läc, hÖ thèng thø nhÊt lµ sö dông c¸c tÕ bµo nu«i cÊy ®ång ®Òu vµ æn ®Þnh; hÖ thèng thø hai lµ sö dông hæn hîp tÕ bµo, nh ng c¸c tÕ bµo riªng rÏ æn ®Þnh; vµ hÖ thèng thø ba lµ sö dông hçn hîp tÕ bµo mµ tÕ bµo riªng rÏ kh«ng æn ®Þnh. HÖ thèng chän läc thø nhÊt t¹o ra c¸c dßng cho n¨ng suÊt æn ®Þnh cßn hÖ thèng thø hai vµ thø ba t¹o ra c¸c dßng æn ®Þnh vµ kh«ng æn ®Þnh. Mét vÊn ®Ò rÊt quan träng mµ cho ®Õn nay vÉn cha s¸ng tá lµ c¬ së cña nh÷ng thay ®æi kiÓu h×nh, qu¸ tr×nh ®iÒu khiÓn trao ®æi c¸c chÊt thø cÊp ë tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy in vitro. §Ó cã ®îc nh÷ng ph¬ng ph¸p chän c¸c dßng tÕ bµo cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao nh÷ng nghiªn cøu vÒ vÊn ®Ò nµy lµ rÊt quan träng. Ngoµi nh÷ng ph¬ng ph¸p chän läc c¸c dßng tÕ bµo cho n¨ng suÊt chÊt thø cÊp cao ®· nªu, øng dông c«ng nghÖ gen ®Ó t¹o c¸c dßng tÕ bµo nµy lµ mét híng cÇn ®îc tiÕn hµnh, tuy nhiªn ë ®©y còng cßn nhiÒu vÊn ®Ò liªn quan cha ®îc hiÓu biÕt ®Æc biÖt lµ nh÷ng c¬ së sinh ho¸ vµ ph©n tö trong chu tr×nh trao ®æi chÊt thø cÊp. MÆc dï cßn mét sè vÊn ®Ò cÇn gi¶i quyÕt nhng nh÷ng thµnh tùu ®¹t ®îc trong chän dßng tÕ bµo cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp cao ®· më ra triÓn väng lín trong viÖc ®a tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy vµo s¶n xuÊt c¸c chÊt thø cÊp cã ý nghÜa trong n«ng nghiÖp, c«ng nghiÖp vµ y häc. §Æc biÖt lµ sù ph¸t triÓn hÖ thèng c«ng nghiÖp ®Ó s¶n xuÊt s¾c tè ®á vµ chÊt diÖt khuÈn Shikonin ë NhËt (Curtin, 1983) ®· më ra triÓn väng c«ng nghiÖp ho¸ viÖc thu nhËn c¸c chÊt thø cÊp tõ tÕ bµo nu«i cÊy. ViÖn C«ng nghÖ sinh häc Canada vµ c¸c phßng nghiªn cøu cña h·ng Vipont ®· hîp ®ång nghiªn cøu ph¸t triÓn hÖ thèng c«ng nghiÖp s¶n xuÊt Sangninarine sö dông trong s¶n xuÊt thuèc ®¸nh r¨ng (Agricell Report, 1989). Thùc vËt lµ nguån cung cÊp nhiÒu chÊt sinh häc quan träng sö dông trong c«ng nghiÖp dîc, c«ng nghiÖp thùc phÈm vµ mü phÈm. C¸c chÊt nµy rÊt khã tæng hîp vµ hiÖn nay nguån cung cÊp chñ yÕu vÉn lµ tõ c©y trång. ViÖc sö dông tÕ bµo nu«i cÊy ®Ó t¨ng nguån cung cÊp hoÆc thay thÕ viÖc trång trät c¸c c©y cho nh÷ng chÊt nµy ®ang ®îc quan t©m ®Æc biÖt. VÊn ®Ò t×m ra c¸c ph¬ng ph¸p chän c¸c dßng cho n¨ng suÊt c¸c chÊt thø cÊp -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 16 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ cao lµ kh©u then chèt ®Ó ®a nu«i cÊy tÕ bµo thùc vËt lªn quy m« c«ng nghiÖp. Nh÷ng thµnh tÝch ®¹t ®îc trong lÜnh vùc nµy ®Æc biÖt lµ viÖc c«ng nghiÖp ho¸ s¶n xuÊt Shikonin b»ng tÕ bµo nu«i cÊy lµ nh÷ng tiÒn ®Ò cho viÖc sö dông tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy ®Ó nhËn c¸c chÊt thø cÊp cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao. ë ViÖt Nam c¸c nghiªn cøu liªn quan ®Õn vÊn ®Ò thu nhËn c¸c chÊt thø cÊp ®· ® îc b¾t ®Çu tõ nh÷ng n¨m 80 trªn c¸c ®èi tîng thuèc l¸, tam thÊt, thanh hao, taxus. N¨m 1988, Phan Huy B¶o vµ cs ®· th«ng b¸o chän ®îc dßng tam thÊt cho hµm lîng saponin cao. Nh÷ng thay ®æi vÒ hµm lîng nicotine liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh ph©n ho¸ m« vµ c©y t¸i sinh còng ®· ®îc c«ng bè (NguyÔn §øc Thµnh vµ cs, 1991 ). iv. lai tÕ bµo 4.1. Dung hîp protoplast vµ lai nh©n. Do kh«ng cã v¸ch xellul« nªn protoplast (tÕ bµo trÇn) trë thµnh mét ®èi tîng lý tëng trong viÖc nghiªn cøu biÕn ®æi di truyÒn ë thùc vËt. B»ng ph¬ng ph¸p dung hîp hai lo¹i protoplast cã thÓ t¹o ®¬c c¸c c©y lai s«ma (lai nh©n hoÆc lai tÕ bµo chÊt). Ngoµi ra cã thÓ sö dông kü thuËt dung hîp protoplast ®Ó chuyÓn c¸c bµo quan nh nh©n, lôc l¹p, ty thÓ hoÆc chuyÓn c¸c vect¬ mang c¸c gen m· ho¸ cho mét sè ®Æc ®iÓm biÕt tríc. Protoplast cã thÓ dung hîp tù nhiªn. HiÖn tîng nµy thêng x¶y ra sau khi t¸ch protoplast tõ mét lo¹i c©y. TÇn sè dung hîp tù nhiªn phô thuéc vµo c¸c gièng c©y Schieder & Vasil, 1980), ë cµ ®éc dîc tÇn sè nµy ®¹t tíi 8% (Schieder, 1974). §Ó dung hîp hai lo¹i protoplast kh¸c nhau thêng ph¶i xö lý mét sè t¸c nh©n. Mét sè t¸c gi¶ dïng níc biÓn (Hofmeister, 1954; Binding, 1966, 1974), hoÆc nitrat natri (Power & cs, 1970; Carlson, 1972), mét sè kh¸c sïng c¸c chÊt kÝch thÝch nh lectin nhng hiÖu suÊt dung hîp rÊt thÊp (Hartman & cs, 1973; Burges & Fleming, 1974; Glimelus & cs, 1974). HiÖu suÊt dung hîp kh¸ cao cã thÓ ®¹t ®îc b»ng c¸ch xö lý protoplast b»ng ion Ca2+ ë 37oC vµ m«i trêng kiÒm (pH=10,5) (Keller & Melchers, 1973; Binding, 1974; Schieder, 1974). HiÖn nay ph¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶ vµ ®îc sö dông réng r·i lµ ph¬ng ph¸p dung hîp cña Kao vµ ®ång nghiÖp (Kao & Michayluk, 1974; Constabel & Kao, 1974). C¸c t¸c gi¶ ®· dïng polyethylen glycol (PEG) cã ph©n tö lîng cao (6000) ®Ó g¾n c¸c protoplast víi nhau. Qu¸ tr×nh dung hîp x¶y ra khi lµm lo·ng dung dÞch PEG b»ng m«i trêng nu«i cÊy. Khi PEG bÞ lµm lo·ng th× protoplast dÇn dÇn trë l¹i b×nh thêng vµ ë phÇn tiÕp gi¸p gi÷a hai protoplast bÞ vì ra vµ qu¸ tr×nh dung hîp ®îc x¶y ra. Trong cïng thêi gian Wallin vµ cs. ®· sö dông thµnh c«ng ph¬ng ph¸p nµy (Wallin & cs, 1974). Nagata ®· thay PEG b»ng rîu polyvinyl ®Ó dung hîp protoplast cña thuèc l¸, cµ rèt vµ c©y hä ®Ëu (Nagata, 1978). Ph¬ng ph¸p sö dông PEG cã hiÖu qu¶ ®èi víi nhiÒu trêng hîp khi dung hîp protoplast cña c¸c c©y cïng loµi vµ kh¸c loµi, dung hîp tÕ bµo ®éng vËt vµ c¶ trêng hîp dung hîp protoplast thùc vËt víi tÕ bµo ®éng vËt (Pontecorvo, 1975; Jone & cs, 1976; Dudits & cs, 1976; Vasil, 1976; Vasil & cs, 1976). VÒ c¬ chÕ cña qu¸ tr×nh dung hîp ®· ®îc Nagata vµ Melchers nghiªn cøu tØ mØ (Nagata & Melchers, 1978). -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 17 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Cuèi nh÷ng n¨m 70 vµ ®Çu 80 mét sè t¸c gi¶ ®· ®a ra ph¬ng ph¸p dung hîp b»ng dßng ®iÖn (Sanda & cs, 1979; Zimmermann & Sheurich, 1981; Zimmermann, 1982; Zimmermann & Vienken, 1982; Vienken & cs, 1983). B»ng ph¬ng ph¸p nµy, c¸c t¸c gi¶ ®· ®¹t ®îc tÇn sè dung hîp tíi 60 vµ 80%. Tuy tÇn sè dung hîp cã cao nhng vÊn ®Ò t¸i sinh c¸c s¶n phÈm dung hîp l¹i gÆp khã kh¨n. ChØ gÇn ®©y mét sè t¸c gi¶ míi nhËn ® îc c©y t¸i sinh sau khi sö dông ph¬ng ph¸p dung hîp nµy (Kohn & cs, 1985). Khi dung hîp hai lo¹i protoplast víi nhau thêng cã ba nguån gen tham gia (nh©n, lôc l¹p, ty thÓ) ®îc kÕt hîp trong c¸c s¶n phÈm dung hîp. NÕu dung hîp hai lo¹i protoplast gièng nhau ta sÏ t¹o ®îc c¸c s¶n phÈm ®ång hîp gen (homogenome). Trong trêng hîp dung hîp hai lo¹i protoplast kh¸c nhau sÏ t¹o ra s¶n phÈm dÞ hîp gen (heterogenome). C¸c s¶n phÈm ®ång hîp gen sÏ t¹o ra c¸c kiÓu h×nh gièng nh bè mÑ nhng víi møc béi thÓ gÊp ®«i. C¸c s¶n phÈm dÞ hîp gen sÏ t¹o ra tÕ bµo dÞ nh©n víi hçn hîp lôc l¹p vµ ty thÓ. Mét trong hai nh©n cã thÓ bÞ tho¸i ho¸ hoÆc c¶ hai ®Òu ph©n ly trong qu¸ tr×nh ph©n chia tÕ bµo. Sù tho¸i ho¸ hoÆc ph©n ly cña mét nh©n trong tÕ bµo dÞ hîp gen sÏ t¹o ra nh÷ng tÕ bµo chøa tÕ bµo chÊt cña c¶ hai lo¹i protoplast vµ chØ cã mét nh©n. Nh÷ng tÕ bµo kiÓu nµy ®îc gäi lµ c¸c thÓ lai tÕ bµo chÊt. Muèn chän c¸c thÓ lai s«ma b»ng dung hîp protoplast cã thÓ sö dông c¸c ®Æc ®iÓm phèi hîp, c¸c ®Æc ®iÓm kh¸ng sinh ho¸ vµ c¸c ®ét biÕn s¾c tè, ngoµi ra cã thÓ sö dông c¸c ®Æc ®iÓm kh¸c nhau tù nhiªn gi÷a c¸c lo¹i protoplast. Melcher lµ ngêi ®Çu tiªn sö dông sù phèi hîp hai ®ét biÕn b¹ch t¹ng ®Ó chän s¶n phÈm dung hîp ë thuèc l¸ (Melchers & Labil, 1974). Mét sè t¸c gi¶ kh¸c ®· sö dông ph¬ng ph¸p t¬ng tù trong c¸c thÝ nghiÖm lai gi÷a c¸c c©y d¹i trªn cïng loµi nh P.innoxia (Schieder, 1977) vµ c¸c c©y kh¸c loµi nh P Parodii + P.Hybrida (Cocking 1978), N. Tabacum + N. Glauca (Evans & cs, 1978). Sù phèi hîp c¸c ®ét biÕn tù dìng nh thiÕu nitrate reductase, thiÕu c¸c axit amin vµ vitamin hoÆc mÉn c¶m víi nhiÖt ®é ®· ®îc nhiÒu t¸c gi¶ sö dông cã kÕt qu¶ (Schieder, 1974; Glimelius & cs, 1978; Muller & Grafe, 1978; Sidorov & cs, 1981; Sidorov & Maliga, 1982; Evola, 1983; Gebhardt & cs, 1983;Shimamoto & cs, 1983). §iÒu ®¸ng chó ý lµ c¸c ®ét biÕn sö dông ®Ó chän phèi hîp ph¶i lµ c¸c ®ét biÕn lÆn vµ kh¸c alen. §Æc ®iÓm kh¸ng c¸c chÊt øc chÕ trao ®æi chÊt còng ®îc sö dông réng r·i ®Ó chän thÓ lai. Power vµ cs (1976) ®· sö dông actinomyxin ®Ó chän thÓ lai gi÷a P. Parodii vµ P. Hybrida. Maliga vµ cs (1977, 1982) dïng kanamyxin vµ streptomyxin ®Ó chän thÓ lai trong c¸c thÝ nghiÖm dung hîp gi÷a c¸c loµi thuèc l¸ víi nhau. Mét sè dßng tÕ bµo vµ c©y lai cßn ®îc chän b»ng sù kh¸c nhau vÒ kh¶ n¨ng sinh trëng vµ t¸i sinh cña s¶n phÈm dung hîp vµ tõng lo¹i protoplast (Carlson & cs, 1972; Power & cs, 1977), b»ng u thÕ trong sù ph¸t triÓn cña c©y lai (Cocking & cs, 1977; Schieder, 1978; Schieder & cs, 1978; Krumbiegel & Schieder, 1979; Dudits & cs, 1979; Lonnerndoker & Schieder, 1980), hoÆc h×nh d¹ng kh«ng b×nh thêng cña m« vµ c©y lai (Melchers & cs, 1978; Binding & Nehls, 1978). -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 18 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ N¨m 1977 Kao ®a ra ph¬ng ph¸p t¸ch thÓ dung hîp b»ng c¬ häc. Ph¬ng ph¸p nµy ®îc Gleba vµ ®ång nghiÖp ph¸t triÓn vµ sö dông t¹i phßng thÝ nghiÖm cña m×nh (Gleba & Hofman, 1978; Gleba & cs, 1978; Gleba & Hofman, 1979). Cho ®Õn nay dung hîp protoplast lµ ph¬ng ph¸p hiÖu qu¶ nhÊt ®Ó t¹o c©y lai s«ma. Nã cho phÐp t¹o c¸c tæ hîp lai bÊt kú theo ý muèn. VÊn ®Ò lµ ph¶i nghiªn cøu c¶i tiÕn ph¬ng ph¸p dung hîp, kü thuËt nu«i cÊy vµ ph¬ng ph¸p chänläc. Tõ c«ng tr×nh lÞch sö cña Carlson (Carlson & cs, 1972) ®Õn nay b»ng ph¬ng ph¸p dung hîp protoplast c¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi ®· t¹o ®îc c©y lai s«ma tõ hµng tr¨m tæ hîp lai gi÷a c¸c c©y cïng loµi, kh¸c loµi vµ kh¸c chi. §©y lµ nh÷ng thµnh tùu hÕt søc lín lao mµ c¸c nhµ khoa häc ®· ®¹t ®îc trong lÜnh vùc lai s«ma b»ng dung hîp protoplast. GÇn ®©y c¸c nhµ nghiªn cøu ®· t¹o ®îc c©y lai s«ma ë c¶ nh÷ng gièng c©y trång cã ý nghÜa kinh tÕ nh khoai t©y, cµ chua vµ lóa (Handley & cs, 1986; O’Connell & Hasnon, 1986; Ausutin & cs, 1985, 1986; Terada & cs, 1987; Guri cs, 1988). Qua ®©y ta thÊy ®îc triÓn väng lín lao cña viÖc øng dông ph¬ng ph¸p nµy ®Ó c¶i biÕn di truyÒn ë thùc vËt nh»m t¹o ra gièng c©y ®¸p øng víi yªu cÇu ®ßi hái cña thùc tiÔn. 4.2. Lai tÕ bµo chÊt Ngoµi viÖc t¹o ra c¸c thÓ lai s«ma chøa dÞ hîp nh©n, dung hîp protoplast cßn cã thÓ t¹o ®îc c¸c thÓ lai tÕ bµo chÊt (hay cßn gäi lµ lai sinh chÊt). Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y nhiÒu phßng thÝ nghiÖm ë Ph¸p, Thôy §iÓn, Canada, Ixraen, Nga, Ucrain vµ Hungary ®· ®Çu t nhiÒu cho c¸c nghiªn cøu trong lÜnh vùc nµy, v× ®Õn nay mét sè c¸c ®Æc ®iÓm chèng chÞu cña thùc vËt ®îc chøng minh liªn quan ®Õn vËt chÊt di truyÒn tÕ bµo chÊt. Trong thêi kú ®Çu, c¸c nhµ nghiªn cøu ®· cè g¾ng t¹o c¸c thÓ lai tÕ bµo chÊt b»ng c¸ch ®a c¸c bµo quan t¸ch rêi vµo protoplast. Potrykus lµ ngêi ®Çu tiªn c«ng bè chuyÓn ®îc lôc l¹p vµo protoplast cña Petunia hybrida (c©y d¹ yªn) nhng kh«ng cã nh÷ng sè liÖu chøng minh ch¾c ch¾n sù tån t¹i cña lôc l¹p trong tÕ bµo (Potrykus, 1973). Nh÷ng c«ng tr×nh cña Carlson (1973), Bonnet & Erikson (1974 ) vµ Kung ( 1975) còng ë t×nh tr¹ng t¬ng tù. Vasil vµ vî cña «ng ®· c«ng bè kÕt qu¶ chuyÓn ty thÓ tõ c©y bÊt dôc ®ùc (BD§) ë c©y ng« vµ c©y D· yªn vµo protoplast cña c©y b×nh thêng vµ t¸i sinh ®îc c©y (Vasil & Vasil, 1974; Vasil, 1976). C¸c t¸c gi¶ cßn x¸c ®Þnh ®îc gen ®iÒu khiÓn tÝnh BD§ ë ng«. Nh÷ng c«ng tr×nh trªn ®· ®i vµo lÞch sö. Tõ ®ã ®Õn nay kh«ng cã nh÷ng c«ng bè tiÕp theo. Së dÜ nh vËy lµ do nh÷ng h¹n chÕ vÒ viÖc t¸ch nhËn c¸c bµo quan nguyªn vÑn vµ gi÷ nguyªn ho¹t ®éng cña chóng. §©y lµ vÊn ®Ò hÕt søc khã kh¨n v× trong qu¸ tr×nh t¸ch vµ lµm s¹ch, c¸c bµo quan bÞ gi¶m søc sèng. Ngoµi ra chóng cßn dÔ bÞ ¶nh hëng bëi c¸c t¸c nh©n trong qu¸ tr×nh dung hîp. MÆt kh¸c n÷a lµ trong c¸c c«ng tr×nh kÓ trªn hiÖu suÊt dung hîp cßn rÊt thÊp. B¾t ®Çu tõ n¨m 1978 ®Õn nay c¸c nhµ nghiªn cøu ®· sö dông kü thuËt dung hîp hai lo¹i protoplast, trong ®ã mét lo¹i cã c¸c ®Æc ®iÓm di truyÒn lôc l¹p vµ ty thÓ ®· ®îc x¸c ®Þnh ®Ó t¹o c¸c c©y lai tÕ bµo chÊt. Belliard vµ cs (1978) lµ nh÷ng ngêi ®Çu tiªn sö dông -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 19 Trường THPT Tiên Lữ … Đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” … ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ thµnh c«ng ph¬ng ph¸p nµy. Tuy nhiªn tû lÖ c©y lai tÕ bµo chÊt nhËn ®îc cßn thÊp vµ viÖc ph©n tÝch di truyÒn c¸c c©y lai nhËn ®îc bÞ gÆp nhiÒu khã kh¨n do sù h×nh thµnh c¶ c¸c thÓ lai nh©n. §Ó kh¾c phôc nh÷ng h¹n chÕ trªn, Zelcer vµ ®ång nghiÖp lÇn ®Çu tiªn sö dông ph¬ng ph¸p dung hîp “cho vµ nhËn“ (Zelcer & cs, 1978). ¤ng dïng tia X ®Ó giÕt nh©n cña mét lo¹i protoplast. Nh÷ng protoplast ®· bÞ chiÕu x¹ nµy kh«ng thÓ ph©n chia ®îc mµ chØ ®ãng gãp tÕ bµo chÊt trong qu¸ tr×nh t¹o c©y lai. Zelcer dung hîp protoplast ®· giÕt nh©n (protoplast cho tÕ bµo chÊ) cña N. Tabacum víi protoplast nguyªn vÑn (protoplast nhËn) cña N. Sylvestris. «âng ®· chuyÓn ®îc tÝnh BD§ (®Æc ®iÓm ty thÓ) tõ N. Tabacum sang N. Sylvestris. C¸c ®Æc ®iÓm liªn quan tíi lôc l¹p còng ®· ®îc chuyÓn thµnh c«ng nhê ph¬ng ph¸p trªn (Beversdorf & cs, 1980; Menczel & cs, 1982; Aviv & cs, 1984; Fluhr & cs, 1983, 1984, 1985; Kemble & Barsby, 1988). Ngoµi viÖc dïng tia phãng x¹ ®Ó giÕt nh©n cã thÓ dïng mét sè chÊt ho¸ häc nh iodoacetate (Medgyey & cs, 1980), hoÆc dïng ly t©m ®Ó lo¹i bá nh©n (Wallin & cs, 1977; Maliga & cs, 1982). Nhng trong c¸c trêng hîp nµy tû lÖ nh©n sèng sãt vÉn cßn ®¸ng kÓ. §èi víi c¸c ®Æc ®iÓm di truyÒn lôc l¹p rÊt dÔ dµng chän läc vµ theo dâi sau khi dung hîp b»ng c¸c chØ thÞ di truyÒn lôc l¹p nh c¸c ®ét biÕn l¹p thÓ (Gleba & cs,1978), c¸c ®ét biÕn kh¸ng sinh ho¸ nh kh¸ng mét sè ®éc tè nÊm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs, 1985), c¸c ®ét biÕn kh¸ng thuèc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo & Maliga, 1982; Cseplo & cs, 1984) vµ c¸c ®ét biÕn kh¸ng chÊt diÖt cá ( Gressel 1984). §¹i ph©n tö cña enzim ribulozo 1, 5 difotfat carbonxylase ®îc tæng hîp nhê th«ng tin di truyÒn lôc l¹p ®· ®îc sö dông ®Ó nghiªn cøu sinh ho¸ lôc l¹p (Kung & cs, 1975). Ph¬ng ph¸p ph©n tÝch sinh ho¸ chÝnh x¸c h¬n n÷a ®ã lµ ph¬ng ph¸p ph©n tÝch ®iÖn di ®å cña ADN lôc l¹p (cpADN) sau khi dïng c¸c enzim c¾t giíi h¹n, c¾t cpADN thµnh nh÷ng ®o¹n kh¸c nhau vµ ph©n lËp c¸c ®o¹n c¾t nµy b»ng ®iÖn di (Belliard & cs, 1978). HiÖn nay ph¬ng ph¸p nµy ®îc sö dông réng r·i ë nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi. Ngoµi kh¶ n¨ng sö dông víi bÊt kú tæ hîp lai nµo, phu¬ng ph¸p nµy cßn rÊt chÝnh x¸c nã cho phÐp x¸c ®Þnh ®îc 1% hçn hîp cña cpADN. Kh¸c víi lôc l¹p c¸c ®Æc ®iÓm liªn quan tíi ty thÓ kh«ng cã nh÷ng chØ thÞ ®Ó chän trong khi nu«i cÊy in vitro. Mét sè t¸c gi¶ ®· dïng chØ thÞ lôc l¹p ®Ó chän (Medgyesy & cs, 1980; Menczel & cs, 1982). Trêng hîp nµy chØ sö dông ®îc khi lôc l¹p vµ ty thÓ liªn kÕt víi nhau theo mét c¬ chÕ nµo ®ã. Nghiªn cøu h×nh th¸i cña hoa cã thÓ gÝup cho viÖc x¸c ®Þnh ty thÓ ngo¹i lai trong c¸c c©y lai. TÝnh BD§ còng ®· ®îc sö dông lµm chØ thÞ ®Ó chän ®Æc ®iÓm ty thÓ ë thuèc l¸ (Belliard & cs, 1979) vµ D· yªn (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980). Gièng nh lôc l¹p ph¬ng ph¸p ph©n tÝch ®iÖn di ®å cña ADN ty thÓ (mtADN) còng ®îc sö dông réng r·i ®Ó x¸c ®Þnh ty thÓ trong c©y lai tÕ bµo chÊt. Belliard vµ cs ®· dïng ph¬ng ph¸p nµy ®Ó nghiªn cøu ty thÓ ë nh÷ng c©y lai trong thÝ nghiÖm dung hîp protoplast thuèc l¸ vµ ®· ph¸t hiÖn thÊy sù t¸i tæ hîp cña mtADN trong c¸c c©y lai (Belliard & cs, 1979). TiÕp sau ®ã Nagy vµ cs (1981), Galun vµ cs (1982) vµ nhiÒu t¸c gi¶ -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái - 20 Trường THPT Tiên Lữ