Tài liệu Tuyển chọn, tách dòng và xác định trình tự gen cry1c mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy từ vi khuẩn bacillus thuringiensis subsp. aizawai phân lập từ một số mẫu đất tỉnh thái nguyên

  • Số trang: 65 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 683 |
  • Lượt tải: 1
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG TUYỂN CHỌN, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN cry1C MÃ HÓA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CÁNH VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG TUYỂN CHỌN, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN cry1C MÃ HÓA PROTEIN TINH THÊ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CÁNH ̉ VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH Thái Nguyên - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nghiên cứu khác. Tác giả luận văn Lê Thị Ngọc Thương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó. Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS. TS Ngô Đình Bính, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới CN Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán bộ phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập. Bên cạnh đó, sự tạo điều kiện và hỗ trợ của Khoa Sau đại học, BCN Khoa và các đồng nghiệp tại Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cũng là động lực rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn của mình. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua! Tác giả luận văn Lê Thị Ngọc Thương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục ......................................................................................................................... i Danh mục các chữ viết tắt ......................................................................................... iii Danh mục các bảng .................................................................................................... iv Danh mục các hình ...................................................................................................... v MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis .......................3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới ............. 3 1.1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam ......................... 5 1.2. Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ......................................7 1.2.1. Vị trí phân loại ........................................................................................... 7 1.2.2. Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis ................................................. 8 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ......... 9 1.3. Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ....................................................10 1.3.1. Độc tố Cry................................................................................................ 11 1.3.2. Độc tố Cyt ................................................................................................ 11 1.3.3. Độc tố Vip................................................................................................ 12 1.3.4. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể .................................................... 12 1.3.5. Cơ chế tác động của protein độc tố tinh thể ............................................ 14 1.4. Gen mã hóa protein độc tố tinh thể ................................................................16 1.4.1. Vị trí của các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis .... 17 1.4.2. Phân nhóm gen mã hóa độc tố ................................................................. 17 1.5. Tổng quan về dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai và gen cry1C ......19 1.5.1. Một số đặc điểm của dưới loài Bta .......................................................... 19 1.5.2. Gen cry1C ................................................................................................ 20 1.6. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm ..............................................................22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 1.6.1. Sâu tơ (Plutella xylostella) ...................................................................... 22 1.6.2. Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) .................................................... 23 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................................26 2.1. Vật liệu ...........................................................................................................26 2.2. Hóa chất và thiết bị .........................................................................................26 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................28 2.3.1. Phương pháp phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt ................. 28 2.3.2. Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis bằng phản ứng huyết thanh .. 28 2.3.3. Phương pháp định lượng mật độ bào tử .................................................. 29 2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính trên đối tượng sâu xanh và sâu tơ ................ 29 2.3.5. Phương pháp tách DNA plasmid ............................................................. 30 2.3.6. Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1C .......................................... 31 2.3.7. Phương pháp tách dòng gen cry1C .......................................................... 31 2.3.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotid của đoạn gen tách dòng .......... 34 2.4. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................35 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................36 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gen cry1C có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) .................................................................................................36 3.1.1. Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu ......................................................................................................... 36 3.1.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh ........... 38 3.1.3. Thử hoạt tính của các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai trên sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) ...... 40 3.1.4. Kết quả khuếch đại gen cry1C ở các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai bằng phương pháp PCR ............................................................ 43 3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1C .............................................................44 3.2.1. Tách dòng gen cry1C ............................................................................... 44 3.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1C ........................................................... 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Viết tắt STT Viết đầy đủ 1 Amp Ampicillin 2 bp Base pair 3 Bt Bacillus thuringiensis 4 Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai 5 DNA Deoxyribonucleotide acid 6 E . coli Escherichia coli 7 EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid 8 OD Optical density- mật độ quang học 9 PCR Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi 10 SDS Sodium dodecyl sulphate 11 Sol Solution 12 TE Tris EDTA 13 X- gal 5- Bromo- 4 Cloro- 3 indolyl ß- d galactoside 14 kDa Kilo Dalton 15 dH2O Nước deion 16 cs cộng sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu ......37 Bảng 3.2. Kết quả phân loại dưới loài của các chủng Bt sinh tinh thể .....................39 Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm........41 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta ...............42 sau 3 ngày thử nghiệm ..............................................................................................42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc nhóm B.cereus (nguồn: Phòng DTVS) ........................7 Hình 1.2. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bacillus thuringiensis với kháng nguyên lông roi H [6] ...................................................................................8 Hình 1.3. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [24] .......................................9 Hình 1.4. Bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi quang học khi nhuộm với fuchsin base (nguồn: Phòng DTVS) .............................................10 Hình 1.8. Cây phân loại của hai họ độc tố Cyt và Vip [42] .......................................12 Hình 1.6. Các block bảo thủ có mặt ở các loại độc tố Cry [26] .................................14 Hình 1.7. Mô hình cấu trúc chung của độc tố Cry [26] .............................................14 Hình 1.5. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc tố tới côn trùng đích [24]..........16 Hình 1.9. Hình ảnh sâu tơ và (Plutella xylostella) thiệt hại do sâu tơ gây ra [10] .....23 Hình 1.10. Vòng đời của sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [10] .......................25 Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 280C ...............................................................36 Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của chủng TN1.12 và TN 36.3 ....................37 Hình 3.3. Hình ảnh ngưng kết của chủng 4J4 (A) và TN 6.12 (B) với typ huyết thanh H7 dưới kính hiển vi quang học .......................................................39 Hình 3.4. Thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu ...........................41 Hình 3.5. Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu ..................................................................................................42 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu ...............44 Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh và trắng trên đĩa thạch LBA sau 14 giờ nuôi cấy ............45 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR với mồi M13 ............................46 Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ một số dòng khuẩn lạc trắng ..................................................................................47 Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 - p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 ..........................48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thái Nguyên là tỉnh trung du miền núi phía Bắc, nông nghiệp chiếm tỷ trọng lớn trong cơ cấu kinh tế. Cũng như nhiều vùng nông nghiệp khác, sâu hại cây trồng, đặc biệt là các loài thuộc bộ Cánh vảy như sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)…là một trong những nhân tố gây thiệt hại lớn tới năng suất và phẩm chất nông sản. Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học để diệt côn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera) là biện pháp có hiệu quả tức thời nhưng lại gây ra những tác hại rất lâu dài cho môi trường sinh thái, đồng thời việc tồn dư thuốc trừ sâu trong nông sản gây ngộ độc cho người và động vật, là những nguyên nhân khiến thuốc trừ sâu sinh học được coi như một giải pháp hiệu quả để dần thay thế thuốc trừ sâu hóa học trong nông nghiệp. Trên thị trường thuốc trừ sâu sinh học hiện nay, các chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis chiếm thị phần gần như tuyệt đối [8], [39]. Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, trong giai đoạn sinh bào tử có khả năng tạo ra các protein tinh thể gây độc một cách đặc hiệu với các côn trùng thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), bộ Hai cánh (Diptera), bộ Cánh cứng (Coleoptera) …. Các tinh thể là hỗn hợp của một hay nhiều loại protein thuộc 2 nhóm độc tố Cry và độc tố Cyt. Các độc tố có tính đặc hiệu với côn trùng đích nhưng không gây độc cho người, động vật có xương sống, thực vật. Các độc tố tinh thể được mã hóa bởi các gen cry nằm trên các plasmid [39]. Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) là một trong 82 dưới loài của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, có khả năng sinh nhiều loại protein tinh thể có tác dụng diệt côn trùng thuộc nhiều bộ khác nhau. Protein tinh thể độc Cry1C là một loại protein do Bta sinh ra trong quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ Cánh vảy rất mạnh. Việc sàng lọc và tuyển chọn dưới loài Bacillus thuringiensis có khả năng tiêu diệt nhiều loại côn trùng đích cũng như tiếp tục nghiên cứu về trình tự các gen cry 2 là những hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài “Tuyên chon, tách dòng ̉ ̣ và xác định trì nh tƣ gen cry1C mã hóa protein tinh thê diêt côn trung bô Cánh ̣ ̉ ̣ ̀ ̣ vảy tƣ vi khuân Bacillus thuringiensis subsp. aizawai phân lâp tƣ môt sô mâu ̀ ̉ ̣ ̀ ̣ ́ ̃ đât tỉnh Thái Nguyên”. ́ 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1. Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn được các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da lang ́ (Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) cao. - Xác định được trình tự gen cry1C từ các chủng Bta đã tuyển chọn. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Thu thập các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus phân lập tại một số địa điểm tại Thái Nguyên. - Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai bằng phương pháp huyết thanh học. - Xác định nồng độ bào tử của các chủng Bta đã phân loại được. - Sàng lọc các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) cao. - Phát hiện gen cry1C từ các chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh (Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella). - Tách dòng, đọc trình tự gen cry1C và so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới Khả năng diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis đã được biết đến từ rất lâu. Nhiều nghiên cứu còn cho rằng người Ai Cập cổ đã biết và sử dụng loại vi khuẩn này để tiêu diệt nhiều côn trùng gây hại. Tuy nhiên Bacillus thuringiensis mới chỉ được phân lập năm 1901 bởi Sigetane Ishiwata khi ông nghiên cứu bệnh dâu tằm, gọi là bệnh “sotto”. Năm 1915, vi khuẩn này được mang tên Bacillus thuringiensis do được phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringien của Đức [29]. Trải qua hơn 100 năm phát triển, lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã trải qua nhiều dấu mốc quan trọng, tập trung vào một số hướng chính như: Tìm kiếm và phát hiện các dưới loài Bacillus thuringiensis mới có khả năng diệt côn trùng thuộc nhiều bộ côn trùng khác nhau, từ đó sản xuất các loại chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Năm 1930, Bacillus thuringiensis lần đầu được đưa vào thử nghiệm để chống sâu đục thân ở ngô tại vùng Ostrinia Nubilalis ở châu Âu. Năm 1938, thuốc trừ sâu sinh học Bt đầu tiên đã được bán trên thị trường Pháp. Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sĩ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với số lượng lớn từ Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu Bt thực sự phát triển mạnh với việc phát hiện thêm các dưới loài Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1 (1970) và Bacillus thuringiensis var. israelensis diệt ấu trùng thuộc bộ Hai cánh (1977). Năm 1983, Krieg và cs phát hiện dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis diệt bọ Cánh cứng (Coleoptera) hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ. Các phát hiện này chứng tỏ hoạt tính diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis không chỉ giới hạn trong bộ Cánh vảy (Lepidoptera) như quan niệm trước đây [15]. Phổ tác dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis tiếp tục được mở rộng với các phát hiện về Bacillus thuringiensis diệt giun tròn thực vật (1988), 4 Bacillus thuringiensis diệt be, vét, mạt thuộc bộ Hrematoda hay Bacillus thuringiensis diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Đặc biệt năm 2003, Sakai và cs đã công bố protein tinh thể của Bacillus thuringiensis diệt tế bào ung thư ở người. Năm 2005, Ohba M., và Binh, N.D. đã phát hiện ra protein của 4 dưới loài Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam chống tế bào ung thư cổ tử cung của người [5], [7], [20]. Protein tinh thể độc tố của Bacillus thuringiensis cũng đã được nghiên cứu một các chi tiết đến mức độ phân tử. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử. Bằng kỹ thuật tia X và các kỹ thuật sinh học phân tử khác, trình tự amino acid và cấu trúc của các protein tinh thể độc tố đã được làm sáng tỏ. Qua đó góp phần làm rõ cơ chế tác động của độc tố Bacillus thuringiensis tới các côn trùng đích [26], [31]. Gen mã hóa độc tố tinh thể của Bacillus thuringiensis là hướng được tập trung nghiên cứu và đạt được nhiều kết quả. Năm 1981, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên được tách dòng và đọc trình tự. Từ đó, số lượng gen mã hóa protein tinh thể của Bt được tách dòng và nghiên cứu đặc tính không ngừng tăng lên. Những gen này chủ yếu thuộc 2 họ gen cry và cyt, được phân loại trong 30 nhóm khác nhau theo trình tự amino acid của protein mà chúng mã hóa. Năm 1996, Estruch và cs đã phát hiện ra gen mã hóa protein Vip3A và Vip3B, sinh tổng hợp ở tế bào sinh dưỡng. Crick More và cs đã xây dựng khóa phân loại gen mã hóa độc tố của vi khuẩn Bt, danh sách các gen cry, cyt được cập nhật từ các nghiên cứu trên khắp thế giới, đồng thời liên kết với các trình tự công bố trên Gene Bank [36], [41], [42]. Những nghiên cứu về gen cry là cơ sở quan trọng cho công nghệ chuyển gen, tạo ra hàng loạt các cây trồng biến đổi gen có mang gen Bacillus thuringiensis, trong đó nhiều loại đã được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới. Năm 1985 các gen cry1Ab và gen cry1Ac đã được chuyển thành công vào cây ngô và bông. Năm 1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản xuất. Đến năm 2001, tính riêng tại Mỹ, 26% tổng diện tích ngô, 69% tổng diện tích bông là giống cây 5 chuyển gen Bacillus thuringiensis. Năm 2005, ở Trung Quốc đã có 3,3 triệu ha bông chuyển gen, đem lại nhiều lợi ích về kinh tế, môi trường, giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học [14], [29]. Tình hình dịch bệnh, sâu hại trong nông nghiệp diễn biến ngày càng phức tạp với nhiều loại bệnh mới phát sinh, nhiều côn trùng biểu hiện kháng với các sản phẩm Bacillus thuringiensis. Điều này đòi hỏi lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis phải có những thay đổi phù hợp. Dự báo trong những năm tới, các nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis sẽ tập trung vào các vấn đề như: - Nghiên cứu phát triển Bacillus thuringiensis thành một loại thuốc trừ sâu có tác dụng bảo vệ kép (Dual control), vừa trừ sâu lại vừa chống bệnh cho cây trồng. - Nghiên cứu sâu và có hệ thống hơn về cơ chế kháng của côn trùng với các protein tinh thể độc tố của Bacillus thuringiensis, từ đó tạo ra các loại thuốc Bacillus thuringiensis có độc lực mạnh hơn, cũng như khắc phục các loại chế phẩm đã bị côn trùng kháng lại. - Tiếp tục sàng lọc tuyển chọn thêm các dưới loài Bacillus thuringiensis mới. - Tiếp tục tách dòng và đọc trình tự các gen cry mới làm cơ sở phục vụ cho công nghệ chuyển gen. 1.1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt Nam được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác giả như Nguyên Công Bì nh , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu tiên ̃ mở đường nghiên cứu về Bacillus thuringiensis tại Việt Nam [5]. 1.1.2.1. Thời kỳ mở đầu nghiên cứu Các công bố khoa học về nghiên cứu Bacillus thuringiensis ở thời kỳ này còn rất ít. Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất Bacillus thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm Bacillus thuringiensis 6 này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả tốt. Tuy nhiên từ năm 1984 đến năm 1993, việc sản xuất chế phẩm Bacillus thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm Bacillus thuringiensis sản xuất ra có chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [5]. 1.1.2.2. Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994) Ở thời kỳ này, các chế phẩm Bacillus thuringiensis sản xuất theo phương pháp dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có giá thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc các trường đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm Bacillus thuringiensis theo phương pháp lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt [5]. 1.1.2.3. Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay) Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm Bacillus thuringiensis kém chất lượng không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng Bacillus thuringiensis bước vào thời kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy các nhà khoa học đã chuyển việc nghiên cứu Bacillus thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các chủng Bacillus thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu Bacillus thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển gen Bacillus thuringiensis phục vụ sản xuất [5]. Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [2]. Năm 2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen của vi khuẩn Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được 22 dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [3], [13]. Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng [4]. 7 Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Đã nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông...[7], [9], [12]. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen. Năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [15]. 1.2. Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1. Vị trí phân loại Bacillus thuringiensis thuộc chi Bacillus, gồm hơn 20 loài khác nhau, trong đó có nhiều loài rất quan trọng như Bacillus subtilis là nguồn cung cấp enzyme trong công nghiệp, Bacillus cereus gây bệnh tiêu chảy và Bacillus anthracis, tác nhân gây bệnh than. Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus hầu hết là Gram dương, có khả năng tạo bào tử và thường sống trong đất [29], [49], [50]. Nhóm Bacillus cereus gồm có Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium. Khả năng sinh tinh thể là một đặc điểm phân biệt Bacillus thuringiensis với các vi khuẩn khác thuộc nhóm Bacillus cereus [29], [49], [50]. Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc nhóm B.cereus (nguồn: Phòng DTVS) 1. B. mycoides 2. B. cereus 3. B. thuringiensis 4. B. megaterium 5. B. anthracis 8 1.2.2. Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis Khóa phân loại vi khuẩn Bt được sử dụng phổ biến và được trung tâm quốc tế Bacillus thuringiensis đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm trên thế giới từ năm 1982 là khóa phân loại của de Barjac và Bonnefoi [16],[17]. Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis của de Barjac và Bonnefoi dựa vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể, các tác giả đã mô tả 27 typ huyết thanh chính có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ Cánh vảy, Hai cánh, Cánh cứng…phương pháp này được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao [16],[17]. Nguyên lý: Khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết. Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng ở đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Khi quan sát dưới kính hiển vi quang học có thể thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được [16], [17]. Ngày nay, phương pháp phân loại này đã được các nhà nghiên cứu Bacillus thuringiensis và Bacillus subtilis công nhận và là điều kiện bắt buộc khi muốn công bố một trình tự gen mới trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế về Bacillus thuringiensis và Bacillus subtilis. Tế bào vi khuẩn với kháng nguyên bề mặt Phân tử kháng thể với 2 vị trí liên kết đặc hiệu. Phản ứng ngưng kết. Hình 1.2. Phản ứng ngƣng kết của vi khuẩn Bacillus thuringiensis với kháng nguyên lông roi H [6] 9 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.3.1. Đặc điểm hình thái Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, tế bào dạng hình que, kích thước 0,8-1,4 μm × 2,5 - 10μm, có thể tồn tại riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào [24]. (hình 1.3). Mỗi tế bào Bacillus thuringiensis khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc diệt côn trùng (hình 1.3). Bào tử hình thành trong điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng…khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng. Bào tử có hình oval, kích thước khoảng 0,5-1,2μm × 1,5 – 2,6μm, quá trình hình thành bào tử không làm biến đổi hình dạng tế bào [24], [49]. Các tinh thể độc tố được tổng hợp trong quá trình tạo bào tử. Tinh thể có kích thước 0,6-2μm, có nhiều hình dạng như hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương hoặc có hình dạng không xác định … Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể được giải phóng ra ngoài (hình 1.3). Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bacillus thuringiensis bằng thuốc nhuộm fushin base và quan sát dưới kính hiển vi ta thấy tinh thể Bacillus thuringiensis bắt màu tím sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt (hình 1.4) [49]. Bào tử Tinh thể Hình 1.3. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [24] 10 Hình 1.4. Bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis dƣới kính hiển vi quang học khi nhuộm với fuchsin base (nguồn: Phòng DTVS) 1.2.3.2. Đặc điểm sinh hóa Bacillus thuringiensis có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao động từ 15 – 450C. Nhiệt độ tối ưu là 20-30 0C. Bacillus thuringiensis không lên men acid trong môi trường có chứa đường arrabinose, xylose, manitol nhưng tạo acid trong môi trường có chứa glucose, có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà [49], [50]. Bacillus thuringiensis không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bacillus thuringiensis là pH = 7. Bacillus thuringiensis có khả năng oxy hóa hydrocacbon đến acid hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden – Meyerhoff – Panas [49], [50]. 1.3. Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là độc tố Cry (Crystal δ endotoxin), Cyt (Cytolytic) và Vip (Vegetative Insecticidal Protein). Trong đó, độc tố Cry và độc tố Cyt thuộc loại độc tố tinh thể. Dựa vào tính tương đồng của trình tự acid min, các họ độc tố này lại được chia thành các lớp khác nhau. Ngoài 3 họ độc tố trên Bacillus thuringiensis còn sinh ra một số độc tố khác như hemolysin, enterotoxin, chitinase, phospholipase…[19], [20], [24], [35]. 11 1.3.1. Độc tố Cry Đây là họ độc tố có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất, có bản chất là một protein trong đó các amino acid như glutamic acid , asparaginic, chiếm trên 20% tổng số amino acid trong phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân làm cho nội độc tố có điểm đẳng điện thấp. Lượng cysteine nhỏ hơn 20% tổng số amino acid, quy định sự không hòa tan của tinh thể, ngoài ra còn có các amino acid: arginine, threonine, leucine, isoleucine. Xét về thành phần hóa học thì độc tố tinh thể chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn, nguyên tố P hầu như không có [38], [26], [31]. Độc tố Cry không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ tan trong môi trường có pH kiềm cao, không tan trong nước, rất bền nhiệt. Khi đun nóng ở 65 0C trong 1 giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 1000C trong 30 – 40 phút thì protein tinh thể bị mất tính độc [38], [26], [31]. 1.3.2. Độc tố Cyt Độc tố Cyt có bản chất là protein và cũng hình thành tinh thể như độc tố Cry. Tuy nhiên, tính tương đồng của trình tự amino acid giữa 2 nhóm độc tố Cry và Cyt hầu như không đáng kể. Khi nghiên cứu 3 protein tinh thể: Cry3A, Cry1Aa và Cyt2A thấy rằng Cry3A và Cry1Aa có tới 36% amino acid tương đồng trong khi Cyt2A chỉ có độ tương đồng chưa đến 20% so với 2 độc tố Cry. Điểm khác biệt lớn nữa giữa 2 nhóm độc tố thể hiện ở cấu trúc phân tử protein. Trong khi các độc tố Cry có cấu trúc chung gồm 3 vùng, độc tố Cyt2A chỉ có 1 vùng đơn gồm có 2 chuỗi xoắn α, bao bên ngoài là một tấm β [26]. Độc tố Cyt đầu tiên được Waallwijk phát hiện năm 1985 là Cyt1Aa1. Hiện nay người ta đã phát hiện 40 độc tố Cyt thuộc 3 nhóm Cyt1, Cyt2 và Cyt3. Các độc tố này có khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa [42]. Độc tố Cyt được phát hiện chủ yếu ở các dưới loài B. isralensis, morrisoni, medellin, terebrinois...[41].
- Xem thêm -