Tài liệu Trích ly và tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn dd9

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRÍCH LY VÀ TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN DD9 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN TRẦN NGỌC QUÍ PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3112527 LỚP: CNSH K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRÍCH LY VÀ TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN DD9 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN TRẦN NGỌC QUÍ PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3112527 LỚP: CNSH K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1 SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Ths. Võ Văn Song Toàn Trần Ngọc Quí CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 2 (ký tên) PGs. Ts. Trần Nhân Dũng XÉT DUYỆT CỦA BỘ MÔN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 TRƢỞNG BỘ MÔN (ký tên) LỜI CẢM TẠ Sau thời gian học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp Đại học chuyên nghành Công nghệ sinh học tại viện NC&PT CNSH, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng với sự giúp đỡ nhiệt tình của bạn bè để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Cám ơn thầy Võ Văn Song Toàn, thầy Trần Nhân Dũng đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin gửi lời cám ơn đến Ban lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học và quý thầy cô của Viện đã tạo điều kiện và truyền đạt những kiến thức kinh nghiệm quý báu giúp tôi có những kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực hiện đề tài. Cám ơn tổ bảo vệ của Viện đã giúp đỡ, hỗ trợ cho tôi làm việc ngoài giờ ở phòng thí nghiệm để hoàn thành luận văn đúng thời hạn. Xin chân thành cám ơn các bạn sinh viên, anh chị học viên cao học ở phòng thí nghiệm Sinh hóa và phòng Công nghệ Enzyme và toàn thể lớp Công nghệ sinh học khóa 37 đã nhiệt tình ủng hộ chia sẻ kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Cần thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2014 Trần Ngọc Qúi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Enzyme cellulase được tổng hợp nhiều ở Bacillus subtilis và có nhiều ứng dụng quan trọng. Đề tài “Trích ly và tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn dạ cỏ dê DD9” được thực hiện nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9. Dòng vi khuẩn DD9 đồng hình với Bacillus subtilis RC24 ở mức độ 94% . Dịch vi khuẩn DD9 được nuôi cấy trong môi trường có cơ chất là bã mía sau đó ủ kỵ khí trong 5 ngày ở 380C để thu nhận enzyme ngoại bào. Từ một lít dịch enzyme thô ban đầu có hàm lượng protein tổng 54,3 mg, hoạt tính tổng 4311 U, đánh giá qua ba phương pháp tinh sạch: tủa phân đoạn với ammonium sulphate, tủa với ethanol và tủa với acetone. Endoglucanase thể hiện hàm lượng và hoạt tính protein cao nhất (1,012 mg và 908 U) khi tủa với 40-80% ammonium sulphate. Bốn phân đoạn tủa 4070% ammonium sulphate được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion trên gel Uno Sphere Q. SDS-PAGE kết hợp với phương pháp nhuộm bạc xác định được hai endoglucanase với trọng lượng phân tử xấp xỉ nhau (có thể là hai đồng phân) 51 kDa và 53 kDa với hiệu suất tinh sạch 6% và độ tinh sạch 7 lần. Từ khóa: Vi khuẩn dạ DD9, endoglucanase, tủa phân đoạn, sắc ký trao đổi ion. ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC ....................................................................................................................i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................................ vii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU...........................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ..............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................2 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................3 2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis ..............................................................................3 2.1.1. Lịch sử phát hiện .........................................................................................3 2.1.2. Phân loại ......................................................................................................3 2.2. Tổng quan về Endoglucanase ..............................................................................4 2.2.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của endoglucanase .......................................4 2.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của endoglucanase ................6 2.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ......................................................................6 2.2.2.2. Ảnh hưởng của pH ..............................................................................6 2.2.2.3. Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase ...........................................7 2.2.2.4. Ảnh hưởng của một số chất ức chế và hoạt hóa .................................7 2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu ..............................................................................7 2.3.1. Phương pháp kết tủa protein .......................................................................7 2.3.1.1. Phương pháp tủa bằng muối ...............................................................7 2.3.1.2. Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ ............................................9 2.3.1.3. Phương pháp tủa bằng điểm đẳng điện ...............................................9 2.3.1.4. Tủa bằng ion kim loại .......................................................................10 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 2.3.3. Trường ĐHCT Một số phương pháp sắc ký ......................................................................11 2.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion.............................................................................11 2.3.3.2 Sắc ký lọc gel ....................................................................................12 2.3.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) ...................................................13 2.3.4.1. Điện di trên gel trong điều kiện có chất gây biến tính SDS và βmercaptoethanol ...............................................................................................14 2.3.5. Một số phương pháp khác .........................................................................15 2.3.5.1. Phương pháp Bradford ......................................................................15 2.3.5.2. Phương pháp Nelson Smogyi ............................................................17 2.3.5.3. Phương pháp định tính bằng đường kính vòng tròn thủy phân ........17 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ......................................................17 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................17 2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước .................................................................18 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................20 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu .....................................................................................20 3.1.1. Thời gian và địa điểm................................................................................20 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................20 3.1.3. Nguyên vật liệu .........................................................................................20 3.1.4. Hóa chất.....................................................................................................20 3.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật ............................................21 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................22 3.2.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp kết tủa ................................22 3.2.1.1. Kết tủa phân đoạn endoglucanase với Ammonium Sulfate bãohòa .22 3.2.1.2. Kết tủa endoglucanase với ethanol ...................................................22 3.2.1.3. Kết tủa endoglucanase với acetone ...................................................23 3.2.2. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion .............23 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................25 4.1. Tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9 ..............................25 4.1.1 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate ...................................................................................................................25 4.1.2 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với ethanol ......................27 4.1.3 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa evới acetone ....................28 4.1.4 Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm ..........30 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................35 5.1. Kết luận .................................................................................................................35 5.2. Kiến nghị ...............................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................36 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Thành phần môi trường cải tiến (M1) ..............................................................21 Bảng 2. Thành phần môi trường cải tiến (M2) ..............................................................21 Bảng 3. Kết quả tủa phân đoạn với ammonium sulphate ..............................................25 Bảng 4. Kết quả tủa với ethanol ....................................................................................27 Bảng 5. Kết quả tủa với acetone ....................................................................................28 Bảng 6. So sánh hiệu quả của ba phương pháp tủa .......................................................30 Bảng 7. Kết quả sắc ký trên gel Uno Sphere Q .............................................................31 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1.Vi khuẩn Bacillus subtilis ....................................................................................3 Hình 2. Mô hình một cấu trúc của endoglucanase ..........................................................5 Hình 4. Tủa phân đoạn protein với Ammonium sulfate ..................................................8 Hình 5. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của prtotein biến thiên theo nồng độ muối .........................................................................................................................................8 Hình 6. Tỷ lệ protein tủa theo pH ..................................................................................10 Hình 7. Các quá trình của phương pháp sắc ký sinh học ..............................................12 Hình 8. Sắc ký lọc Gel ...................................................................................................13 Hình 9. Sự phân tách protein bằng phương pháp điện di SDS-PAGE ..........................14 Hình 10. Minh họa phản ứng của Coomassie G-250 với protein ..................................16 Hình 11. Kết quả đường kính vòng halo giữa các phân đoạn tủa AS ...........................26 Hình 12. Kết quả đường kính vòng halo giữa các tỷ lệ tủa ethanol ..............................27 Hình 13. Kết quả đường kính vòng halo giữa các tỷ lệ tủa acetone ..............................29 Hình 14. Sắc ký đồ trên gel Uno Sphere Q ...................................................................30 Hình 15. Kết quả định tính endoglucanase đã tinh sạch phân đoạn sắc ký ...................31 Hình 16. Kết quả điện di SDS-PAGE phân đoạn tủa AS ..............................................32 Hình 17. Kết quả điện di SDS-PAGE phân đoạn sắc ký .............................................33 ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate BSA Ammonium sulfate Bovine serum albumin CD Catalytic domain CBM Carbohydrate-binding molecule CMC Carboxy methyl cellulose DTT Dithiotheitol IEF Isoelectric focusing pI Isoelectric point SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel SDS Sodium dodecyl sulfate TCA Trichloroacetic acid TEMED Tetramethylethylenediamine OD Optical density ĐC Đối Chứng ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Cellulose được xem là hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trên thế giới, chủ yếu là từ thực vật, là sản phẩm cơ bản của quá trình quang hợp trong lượng sinh khối thực vật, là nguồn carbon và năng lượng tái tạo dồi dàu. Theo ước tính hằng năm có khoảng 4,0x107 tấn cellulose được sản xuất (Singh et al, 1995). Các chất thải nông nghiệp bao gồm rác thực vật, phân động vật và chất thải cây trồng chế biến, lượng lớn được tạo ra trong khai thác gỗ, mùn cưa tạo ra một lượng dư thừa sản phẩm cellulose. Vì vậy việc tận dụng nguồn phế phẩm cellulose, đặc biệt là ứng dụng nguồn enzyme phân giải cellulose đã và đang được nghiên cứu. Nhiều vi sinh vật bao gồm nấm và vi khuẩn đã được nghiên cứu để phân hủy cellulose và vách tế bào thực vật khác. Trong tự nhiên, sự phân hủy của sinh khối cellulose được thực hiện bởi hỗn hợp các enzym thủy phân được gọi chung là cellulase. Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết β-1,4glycoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác, là một enzyme đa thành phần xúc tác chuyển hóa cellulose thành glucose qua một chuỗi các phản ứng với sự tham gia của endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase, Cellulase là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng nhất thu hút sự quan tâm vì sự đa dạng trong các ứng dụng của nó. Thị trường tiêu thụ cellulase ở Hoa Kỳ ước tính khoảng 400 USD mỗi năm (van Beilen và Li, 2002; Wolfson, 2005; Zhang et al., 2006), chiếm khoảng 33% thị trường enzyme công nghiệp của Hoa Kỳ. Các ứng dụng của cellulase đã được nghiên cứu, trong lĩnh vực nông nghiệp các chế phẩm của cellulase, hemicellulase và pectinase có tiềm năng ứng dụng trong việc kích thích sự tăng trưởng và kiểm soát dịch bệnh cho cây trồng (Bhat, 2000; Chet et al., 1998), cải thiện nguồn dinh dưỡng trong đất bằng cách thúc đẩy nhanh sự phân hủy của rơm rạ trong đất, trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp, phá vở thành tế bào thực vật giúp cho việt ly trích các chất từ thực vật được dể dàng. Điều này còn giúp việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào “trần” lai tạo những tế bào khác nhau tạo ra tế bào mới theo mong muốn (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Trong công nghiệp cellulase có nhiều ứng dụng ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT trong các lĩnh vực công nghiệp dệt, công nghiệp sản xuất giấy, công nghiệp chất tẩy rửa bột giặt (Kuhad et al., 2011), đặc biệt là trong chuyển đổi vật liệu cellulose thành ethanol có nhiều ứng dụng trong công nghiệp năng lượng và công nghiệp sản xuất hàng tiêu dùng, ngoài ra cellulase còn có nhiều ứng dụng trong quá trình lên men cải thiện malt trong bia, chất lượng, mùi vị của rượu, cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm, sản xuất dược liệu có nguồn gốc thực vật… Nguồn enzyme cellulase sử dụng thu được từ vi sinh vật chủ yếu trên vi khuẩn và nấm (Lynd et al., 2002). Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, tốc độ tăng sinh khối ở vi sinh vật cao gấp ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật và thực vật, vì vậy lượng enzyme do vi sinh vật tổng hợp được là rất lớn. Trong lịch sử nghiên cứu, các vi khuẩn Bacillus là một nguồn phong phú sản xuất các enzyme công nghiệp (Horikoshi và Alkaliphiles, 1999; Priest, 1977), Bacillus subtilis là một trong các loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào khá cao có khả năng phân hủy cellulose (Tjalsma et al., 2004; Yamane et al., 2004; Schumann, 2007; Zhang và Zhang, 2010). Nhưng trên thực tế các nghiên cứu về cellulase từ Bacillus vẫn còn hạn chế so với các nghiên cứu được thực hiện trên nấm. Các enzyme chỉ thể hiện đầy đủ hoạt tính và chức năng sinh học khi không có lẫn tạp chất, tinh sạch là bước đầu cần thiết trong việc tìm hiểu chức năng của protein (Berg et al., 2002). Do đó đề tài “trích ly tinh sạch endoglucanase từ Bacilus subtilis RC24” được thực hiện, mở ra hướng nghiên cứu mới về cellulase trên đối tượng vi khuẩn. 1.2. Mục tiêu đề tài Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn DD9 bằng sắc ký trao đổi ion âm. ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên bởi C.G. Ehrenberg vào năm 1835 với tên gọi là Vibrio subtilis, sau đó được đổi tên thành Bacillus subtilis vào năm 1872 bởi F.Cohn. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như loài vi sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy… Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường… 2.1.2. Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc Giới (Kingdom) : Bacteria Nghành (Division) : Firmicutes Lớp (Class) : Bacilli Bộ (Oder) : Bacillales Họ (Family) : Bacillaceae Giống (Genus) : Bacillus Hình 1.Vi khuẩn Bacillus subtilis (*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Bacillus_subtilis_Gram.jpg ngày 11/03/2014) Bacillus subtilis thuộc nhóm trực khuẩn, hình que Gram dương, có kích thước khoảng 3-5 μm tùy vào môi trường nuôi cấy (Sargent, 1975). Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật ưa khí bắt buộc, nhưng cũng có thể hoạt động kỵ khí khi có sự hiện diện của nitrat hoặc glucose. Bacillus subtilis được xem là loài vi sinh vật không độc hại, không phải là một tác nhân gây bệnh. phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT thường trong đất trồng trọt, đất nghèo dinh dưỡng ở vùng xa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì, bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao…Bacillus subtilis phát triển trong phạm vi nhiệt độ vừa phải, nhiệt độ tối ưu là 30-37oC (Korsten và Cook, 1996). Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (trong môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ khắc nghiệt…) (Tô Minh Châu, 2000). B.subtilis có thể sản xuất và tiết ra một lượng lớn enzyme vào môi trường nuôi cấy. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis có những đặc tính vượt trội hơn hẳn các enzyme của vi sinh vật khác như khả năng chịu được nhiệt độ tương đối cao, pH hoạt động từ trung tính đến kiềm, khả năng thủy phân cơ chất cao…(http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tong-quan-veenzyme-ngoai-bao-bacillus-subtislis-11277/ngày 11/02/2014). Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase. Do đó, sinh vật này được coi là một "nhà máy sản xuất di động" phong phú cho các enzyme công nghiệp và sinh dược học (Westers et al., 2004). Bacillus subtilis có khả năng sử dụng hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và acid amin cho sự sinh trưởng. Bacillus subtilis được ứng dụng trong lĩnh vực, bao gồm cả nghiên cứu di truyền, các ứng dụng công nghiệp và làm thuốc diệt nấm. Hơn nữa Bacillus subtilis có thể dễ dàng phân lập và phát triển trong phòng thí nghiệm. Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase... Đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của Bacillus subtilis trong chế biến thực phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc… (Phạm Thi Hồng Thắm, 2013). 2.2. Tổng quan về Endoglucanase 2.2.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của endoglucanase Còn được gọi là β-1,4-endoglucan hydrolase, β-1,4-glucanase, Carboxymethyl cellulase, Celludextrinase, Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4-β-D-glucanohydrolase, Endo-1,4-β-glucanase thuỷ phân lên kết β-1,4-glycoside trong vùng vô định hình của ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT phân tử cellulose để tạo ra các đoạn oligosaccharide với kích thước khác nhau và tạo ra các đầu mút mới có thể lần lượt bị tấn công bởi exoglucanase. Các endoglucanase là các enzyme đơn phân với trọng lượng phân tử khác nhau khoảng 22-45 kDa, mặc dù có các biến thể lớn hơn trên nấm như Sclerotium rolfsii và Gloeophyllum sepiarium có endoglucanases gấp hai lần kích thước này (Sadana et al., 1984), pH tối ưu trong khoảng 7-8 và nhiệt độ tối ưu 50- 70oC (Valásková et al., 2006; Ding et al., 2001). Endoglucanase điển hình có cấu trúc gồm hai tiểu đơn vị (sub-domains): domain xúc tác (catalytic domain-CD), domain bám vào gốc đường (carbohydrate binding molecule-CBM), một đoạn peptide nối hai domain này với nhau (linker pepride). Hình 2. Mô hình một cấu trúc của endoglucanase (*Nguồn: http://www.nrel.gov/continuum/deliberate_science/biofuels.cfm) Domain CD chịu trách nhiệm thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic trong vùng vô định hình của phân tử cellulose để tạo ra các đoạn oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Domain CBM có vai trò tương tác với cơ chất thông qua sự tham gia của các acid amin nhân vòng thơm như tryptophan (Kawaminami et al., 1998). Domain này cải thiện khả năng bám và hỗ trợ hoạt tính của CD trên các cơ chất không hòa tan nhưng không tác động trên các cơ chất hòa tan (Linder và Teeri, 1997). Các CBM, thường là các O-glycosyl hóa có từ 30 đến khoảng 200 acid amin, có cấu tạo gồm 1, 2 hoặc 3 tiểu domain trong một protein. Các domain bám có thể ở cả hai đầu mút C hoặc N và đôi khi là vị trí trung tâm của protein. Đoạn peptide liên kết là một chuỗi các acid amin kết nối domain xúc tác và domain bám, đoạn này có từ 6-59 acid amin và có chức năng như một bản lề linh hoạt cho phép các domain CBM và CD hoạt động với ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT chức năng độc lập (Wilson và Irwin, 1999). Hình 3. Cơ chếphân cắt của endoglucanase (*Nguồn: http://discovery.kcpc.usyd.edu.au/9.2.2-short/9.2.2_CellulosetoEthene.html) 2.2.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hoạt tính của endoglucanase 2.2.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến enzyme theo hai hướng: ảnh hưởng trực tiếp hằng số tốc độ phản ứng và ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme. Tùy vào từng chủng loài vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy cụ thể mà nhiệt độ tối ưu của endoglucanase có thể khác nhau. Nhiệt độ tố ưu của endoglucanase khảo sát ở dòng Bacillus phân lập từ phân bò khoảng 50oC (Sadhu et al., 2013), ở Bacillus circulans là 45oC (Nirmala et al., 2011), trong khi ở dòng Bacillus M-9 endoglucanase có hoạt tính tốt nhất ở 60oC (Bajaj et al., 2009). 2.2.2.2. Ảnh hƣởng của pH pH ảnh hưởng đến các hoạt tính của enzyme, pH tối ưu cho các hoạt động của enzyme từ 5-9, một số yếu tố bị ảnh hưởng bởi pH như liên kết của cơ chất với enzyme, trạng thái ion hóa của các acid amin tham gia vào hoạt động xúc tác của enzyme, khả năng ion hóa của cơ chất, làm thay đổi cấu trúc phân tử của enzyme. Endoglucanase từ các loài Bacillus khác nhau thường có hoạt tính cao nhất trong khoảng pH dao động 5-9, ví dụ, endoglucanase của Bacillus licheniformis có hoạt tính cao nhất ở pH 6 (Bischoff et al., 2006), trong khi ở Bacillus cereus endoglucanase có ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT hoạt tính cao nhất ở pH 8 (Yang et al., 2011) và pH 9 ở Bacillus circulans (Nirmala et al., 2011). 2.2.2.3. Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase Endoglucanase thể hiện hoạt tính cao nhất với carboxmethyl cellulose (CMC) và β-glucan. Ngoài ra, endoglucanase cũng thể hiện hoạt tính với một số cơ chất khác như avicel, cotton, giấy lọc, xylan nhưng hoạt tính không cao (Yin et al., 2010; Mawadza et al., 2000). 2.2.2.4. Ảnh hƣởng của một số chất ức chế và hoạt hóa Hoạt tính của endoglucanase được tăng cường bởi một số chất hoạt hóa như ion Mn2+, Co2+ và β-Mercaptoethnol, và bị ức chế bởi Hg2+, Fe3+, Cd2+, Sodium dodecyl sulfate hay Iodoacetic acid làm giảm hoạt tính của endoglucanase. Các ion K+, Na+, Ca2+, NH4+ không ảnh hưởng đến hoạt tính của endoglucanase khi được thêm vào phản ứng (Yin et al., 2010; Mawadza et al., 2000). 2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp kết tủa protein Phương pháp tủa được sử dụng tương đối phổ biến để thu nhận protein. Protein có thể được kết tủa theo nhiều cách khác nhau như: tủa bằng muối, tủa bằng dung môi hữu cơ, thay đổi pH của dung dịch có chứa protein hay có thể tủa bằng nhiệt. 2.3.1.1. Phƣơng pháp tủa bằng muối Phương pháp này dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của protein ở nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu các protein tạp chất trong dung dịch enzyme. Nồng độ muối tăng cao sẽ là nguyên nhân gây kết tủa protein mà không gây biến tính. Phần lớn các phân tử protein có tính lưỡng cực, một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước, phần ưa nước trên bề mặt phân tử tạo thành lớp áo nước bao quanh, phần kỵ nước co cụm lại bên trong lòng phân tử. Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in) do lượng muối được thêm vào làm trung hòa các điện tích bề mặt của protein, làm giảm tính trật tự của lớp áo nước bên ngoài nên sẽ làm tăng entropy của hệ thống. Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out). Lượng ion dư thừa trong giai đoạn salting out sẽ tranh giành dung môi với protein và làm giảm hiện tượng solvat ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT hóa, đồng thời trung hòa các điện tích trái dấu trên protein nên sẽ cho phép protein kết tủa. a) Protein hòa tan trong nƣớc b) Protein tủa trong Ammonium sulfate Hình 4. Tủa phân đoạn protein với Ammonium sulfate (*Nguồn:http://biocadmin.otago.ac.nz/fmi/xsl/bioc2/learnbitslecture.xsl?-db=BIOC2web.fp7&lay=Lectures&-recid=5450&-find=) Hình 5. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của prtotein biến thiên (*Nguồn: http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?cateid=8&id=32) theo nồng độ muối Các muối thường được dùng để tủa protein (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4...Tuy nhiên, người ta đã nhận thấy muối Ammonium Sulfate (AS) là tốt nhất vì phần lớn protein kết tủa ở nồng độ bão hòa (4M, AS), không tạo nhiệt khi hòa tan, tỷ trọng thấp ở nồng độ bão hòa (1,25 g/cm3) (Dương Thị Hương Giang, 2013), có thể thu nhận ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 - 2014 Trường ĐHCT protein kết tủa bằng ly tâm, protein tủa bằng AS không bị nhiễm khuẩn, protein không bị biến tính, các protein khác nhau kết tủa ở các nồng độ AS bão hòa khác nhau. 2.3.1.2. Phƣơng pháp tủa bằng dung môi hữu cơ Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ chủ yếu dựa vào hằng số điện môi của dung dịch, quá trình solvate hóa của nước đối với những protein mang điện tích và ưa nước sẽ giảm khi nồng độ dung môi tăng do sự giảm hằng số điện môi của dung dịch. Do các dung môi hữu cơ thường có đặc tính háo nước vì vậy các phân tử nước xung quanh vùng kỵ nước của protein sẽ bị thay thế bởi các phân tử dung môi, protein bị mất lớp áo nước sẽ có xu hướng tương tác với nhau do ảnh hưởng của các lực tương tác tĩnh điện và các vùng kỵ nước nằm gần bề mặt của protein. Lực đẩy do các nhóm kỵ nước trên phân tử protein không đáng kể do chúng bị bao quanh bởi các phân tử dung môi. Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi: ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D) Trong đó S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ Sw: độ hòa tan của protein trong nước D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào Dw: hằng số điện môi của nước R: hằng số khí lý tưởng T: nhiệt độ tuyệt đối A: là một hằng số Dung môi hữu cơ thường dùng là etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu. Khi tủa bằng dung môi hữu cơ nhiệt độ thường phải giữ thấp hơn 5oC. 2.3.1.3. Phƣơng pháp tủa bằng điểm đẳng điện Điểm đẳng điện (pI) của protein là pH mà tại đó protein không mang điện tích do nồng độ của cation bằng với nồng độ của anion. Ở pH < pI protein tích điện dương, pH> pI protein tích điện âm. Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu ___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học