Tài liệu Tổng quan về các kỹ thuật phân tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn gốc (primary standard)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ TÚ QUYÊN TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC (PRIMARY STANDARD) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ TÚ QUYÊN Mã sinh viên: 1301348 TỔNG QUAN VỀ CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC (PRIMARY STANDARD) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS.ThS. Nguyễn Lâm Hồng Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Đến nay khi khóa luận đã hoàn thành, tôi xin phép được bày tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và sự kính trọng đến NCS.ThS. Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất, người thầy đã trực tiếp tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn HVCH. Đào Tú Anh vì đã dành thời gian tra cứu, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình tìm tài liệu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, toàn thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã luôn tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại đây. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè - những người đã luôn đồng hành, cổ vũ và động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Võ Thị Tú Quyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM VỀ CHẤT CHUẨN GỐC...................................................2 1.1. Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu .................................................................... 2 1.2. Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học:............................................................ 2 1.2.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (primary chemical reference standards PCRS) ....................................................................................................................2 1.2.2. Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference standards - SCRS) .................................................................................................3 1.3. Hướng dẫn quy trình thiết lập chất chuẩn gốc ................................................... 4 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN DẠNG CHẤT CHUẨN GỐC .......................................................................................10 2.1. Mô tả vật lý ...................................................................................................... 10 2.1.1. Kiểm tra cảm quan ....................................................................................10 2.1.2. Kính hiển vi quang học .............................................................................10 2.1.3. Xác định điểm chảy ...................................................................................10 2.1.4. Góc quay cực riêng....................................................................................10 2.2. Bộ phổ nhận dạng về cấu trúc.......................................................................... 11 2.2.1. Kỹ thuật quang phổ hồng ngoại (IR) .........................................................11 2.2.2. Kỹ thuật quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) ........................12 2.2.3. Kỹ thuật phổ khối lượng (MS) ..................................................................13 2.2.4. Kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ..........................................15 2.2.5. Phân tích nguyên tố ...................................................................................16 2.2.6. Nhiễu xạ tia X............................................................................................16 CHƯƠNG 3. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỘ TINH KHIẾT NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC ....................................................................17 3.1. Nguồn gốc và phân loại tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc . 17 3.1.1. Nguồn gốc tạp chất ....................................................................................17 3.1.2. Phân loại tạp chất ......................................................................................17 3.2. Các kỹ thuật xác định tạp chất trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc .... 19 3.2.1. Kỹ thuật xác định gián tiếp: ......................................................................19 3.2.2. Kỹ thuật xác định độ tinh khiết trực tiếp ...................................................37 3.2.3. Kết hợp cả 2 kỹ thuật xác định độ tinh khiết trực tiếp và gián tiếp ..........39 CHƯƠNG 4. TÌNH HÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN GỐC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ................................................................................................................40 4.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc trên thế giới .............................................. 40 4.2. Tình hình thiết lập chất chuẩn gốc tại Việt Nam ............................................. 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................................... 43 1.1. Kết luận ............................................................................................................ 43 1.2. Đề xuất ............................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt AAS Atomic Absorption Spectrometry Quang phổ hấp thụ nguyên tử ACN Acetonitrile Acetonitril APCI Atmospheric Pressure Chemical Ion hóa hóa học ở áp suất khí Ionization quyển Association of Southeast Asian Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Nations Á ASEAN CCĐC Chất chuẩn đối chiếu CE Capillary Electropherosis Điện di mao quản CEC Capillary Electrochromatography Điện sắc ký mao quản CIEF Capillary Isoelectric Focusing Điện di mao quản hội tụ đẳng điện CITP Capillary Isotachophoresis Điện di mao quản đẳng tốc CZE Capillary Zone Electrophoresis Điện di mao quản vùng DAD Diode Array Detector Detector mảng diod DMF N,N-dimethylformamide N,N-dimethylformamid DMI 1,3-dimethyl- 2-imidazolidinone 1,3-dimethyl- 2-imidazolidinon DSC Differential Scanning Calorimetry Quét nhiệt vi sai EDQM European Directorate for the Hội đồng Châu Âu về chất lượng Quality of Medicine -HealthCare thuốc EI Electron Impact Ion hóa bằng dòng electron EOF Electroendosmotic Flow Dòng điện thẩm EPRS European Pharmacopeia Reference Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Substances Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa bằng tia điện FAAS Flame Atomic Absorption Nguyên tử hóa bằng ngọn lửa Spectrometry GC Gas Chromatography Sắc ký khí GMP Good Manufacturing Practices Thực hành tốt sản xuất thuốc HL Hàm lượng HĐDĐ Hội đồng Dược điển HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography ICH International Conference on Hội nghị quốc tế về hài hòa các Harmonisation of Technical yêu cầu kỹ thuật để đăng ký dược Requirements for Registration of phẩm sử dụng cho con người Pharmaceuticals of Human Use ICP-MS ICRS Inductively Coupled Plasma- Mass Quang phổ plasma cảm ứng kết nối Spectroscopy phổ khối lượng International Chemical Reference Chất chuẩn đối chiếu quốc tế Substances IP International Pharmacopoeia Dược điển quốc tế IR Infrared Radiation Quang phổ hồng ngoại ISO International Organization for Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế Standardization LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MEKC Micellar Electrokinetic Sắc ký mixen điện động Chromatography MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hật nhân NP-HPLC Normal Phase-High Performance PCRS Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha Liquid Chromatography thuận Primary Chemical Reference Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc Standards PDE Permitted daily exposure Liều phơi nhiễm cho phép mỗi ngày Ph.Eur PTN European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu Phòng thí nghiệm qNMR Quantitative Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân định Resonance lượng RP-HPLC Reversed Phase-High Performance Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo Liquid Chromatography S SCRS Diện tích Secondary Chemical Reference Chất chuẩn đối chiếu thứ cấp Standards Tiêu chuẩn cơ sở TCCS TGA Thermogravimetric Analysis Phân tích nhiệt trọng lượng TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TOF Time- of- Flight Analyser Bộ phân tích thời gian bay USPRS United States Pharmacopeia Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Reference Substances Mỹ Ultraviolet - Visible Spectroscopy Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả UV-VIS kiến VKNTTƯ Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 So sánh kết quả độ tinh khiết thu được thông qua DSC với kết quả độ tinh khiết thu được thông qua sắc ký và các kỹ thuật phân tích khác ..................................11 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 3.1 Hình ảnh phân tích MEKC của một mẫu muối natri amoxicillin .............PL-2 Hình 4.1 Phổ IR của 1,5 mg Indinavir số kiểm soát 105231 ……………………...PL-3 Hình 4.2 Phổ UV của Indinavir số kiểm soát 105231……………………………...PL-4 Hình 4.3 Sắc ký đồ của Indinavir số 105231 được theo dõi ở bước sóng 220 nm....PL-7 ĐẶT VẤN ĐỀ Chất chuẩn nói chung và chất chuẩn gốc nói riêng có vai trò rất quan trọng trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng, giám sát chất lượng nguyên liệu làm thuốc và chế phẩm thuốc của ngành Dược. Ngoài ra nó còn được dùng để đánh giá thử nghiệm thành thạo cho các kiểm nghiệm viên của các PTN muốn đăng kí tham gia làm PTN thành viên trong các chương trình hợp tác thiết lập chất chuẩn của Trung tâm hợp tác về CCĐC của WHO hay Hội đồng Dược điển Mỹ, Ủy ban đối chiếu của ASEAN, Hội đồng Dược điển Châu Âu [41]. Hiện nay, các chất chuẩn sử dụng cho công tác kiểm nghiệm và nghiên cứu ở Việt Nam thường được mua từ các nguồn chất chuẩn nước ngoài như Hội đồng Dược điển Mỹ, Anh, Châu Âu,… (USPRS, BPCRS, EPCRS, ICRS), các hãng hóa chất lớn (Merck, Sigma Aldrich,…); chất chuẩn quốc gia được thiết lập trong nước tại VKNTTƯ và Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM, chất chuẩn làm việc do các phòng thử nghiệm tự thiết lập. Nhu cầu sử dụng chất chuẩn trong nước ngày càng lớn, tuy nhiên chất chuẩn được thiết lập trong nước chủ yếu là chuẩn thứ cấp được nối với chuẩn quốc tế và công tác thiết lập chất chuẩn gốc trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới và chất chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu trong trường hợp không có chuẩn gốc để nối đang còn rất hạn chế. Do vậy, công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc đặc biệt thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đang gặp khó khăn do thiếu chất chuẩn. Để chủ động hơn trong thiết lập chất chuẩn và trong trường hợp nghiên cứu phát triển thuốc mới, chưa có chất chuẩn nối, khóa luận “Tổng quan về các kỹ thuật phân tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn gốc (Primary Standard)” được thực hiện với mong muốn đem đến một cái nhìn tổng quan về thiết lập chất chuẩn gốc cũng như cung cấp những hiểu biết cơ bản, khả năng phát triển và ứng dụng của nó trong ngành Dược tại Việt Nam với ba mục tiêu chính sau: 1. Khái niệm về chất chuẩn gốc và các bước trong quy trình thiết lập chất chuẩn gốc. 2. Tổng quan các kỹ thuật xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc. 3. Tổng quan các kỹ thuật xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc. 1 CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM VỀ CHẤT CHUẨN GỐC 1.1. Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu Nguyên liệu đối chiếu là những nguyên liệu có sự đồng nhất và ổn định về một hoặc một số tính chất, được thiết lập để phù hợp với một quá trình sử dụng hoặc đo lường đã định sẵn [12], [43], [45], [59]. Thuật ngữ “chất chuẩn đối chiếu hóa học” hay còn gọi là “chất chuẩn đối chiếu” hay “chất đối chiếu hóa học” được WHO định nghĩa như sau: “Chất chuẩn đối chiếu hóa học là nguyên liệu đồng nhất, xác thực, được sử dụng trong các phép thử vật lí, hóa học mà ở đó các tính chất của nó được so sánh với các tính chất của chất cần thử, với độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng” [5], [83]. Trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng của ngành Dược, các phương pháp phân tích trong các Dược điển hiện hành có thể yêu cầu CCĐC trong các phép thử sau [14], [69], [73], [80], [85]: Đo phổ IR để định tính, đo phổ UV để định lượng, định lượng bằng các phương pháp so sánh màu, các phương pháp sắc ký để định tính và định lượng, các kỹ thuật tách để định lượng, các phương pháp định lượng vi sinh, các thử nghiệm hóa học - miễn dịch, hiệu chuẩn thiết bị. 1.2. Phân loại chất chuẩn đối chiếu hóa học: 1.2.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc (primary chemical reference standards PCRS) Khái niệm: “Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc là chất được công nhận rộng rãi, có các chỉ tiêu chất lượng phù hợp với tài liệu công bố, cụ thể và giá trị ấn định của nó được sử dụng làm tiêu chuẩn phân tích mà không cần phải so sánh với chất hóa học khác” [83], [85]. Theo ICH Guideline Q7 định nghĩa: Chất chuẩn gốc là một chất được đưa ra bởi một loạt các phân tích để trở thành nguyên liệu đáng tin cậy có độ tinh khiết cao. Chất chuẩn này có thể: • Thu được từ nguồn được công nhận chính thức; • Được bào chế bằng tổng hợp độc lập (independent synthesis); 2 – • Thu được từ nguyên liệu sản xuất có độ tinh khiết cao; • Được bào chế bằng cách tinh chế tiếp các nguyên liệu sản xuất có sẵn [37]. Các chuẩn gốc - PCRS chính thức: Các chất chuẩn gốc chính thức có thể tìm được từ các nguồn sau: Trung tâm hợp tác về chất chuẩn đối chiếu của WHO, Hội đồng Dược điển Châu Âu, các phòng thí nghiệm trực thuộc của Hội đồng Dược điển Anh và Mỹ [21], [67], [81]. Chất chuẩn quốc tế (ICRS) là một chất chuẩn gốc được thiết lập tại Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) về tiêu chuẩn chất lượng của các chế phẩm dược dụng. Các tổ chức tham gia hợp tác đánh giá ICRS do WHO chỉ định. ICRS được sử dụng chủ yếu trong các phép thử vật lý, hóa học, định lượng của các chuyên luận dược phẩm được công bố trong IP [40], [85]. Chuẩn theo Dược điển Châu Âu (EPRS): Được thiết lập và cung cấp bởi Ban thư ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu [26]. Chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS): Được thiết lập và phân phối bởi Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ [80]. – Các chuẩn gốc-PCRS tiêu chuẩn nhà sản xuất: Trong trường hợp chưa có chất chuẩn gốc chính thức, nhà sản xuất có thể được xây dựng chất chuẩn gốc của cơ sở (in-house primary reference standard) bao gồm số lô và đầy đủ đặc tính của chất chuẩn gốc. 1.2.2. Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference standards - SCRS) Khái niệm: Chất chuẩn thứ cấp là một chất chuẩn đối chiếu hóa học mà các tính chất hay chỉ tiêu chất lượng của nó được xác định bằng cách so sánh với một chất chuẩn gốc. Chuẩn thứ cấp được dùng làm chất chuẩn đối chiếu cho các phân tích thường ngày của phòng thí nghiệm [37], [83], [85]. Phân loại chất chuẩn thứ cấp: – Chuẩn thứ cấp - SCRS “chính thức” là một chuẩn thứ cấp khu vực hay quốc gia. • Chuẩn thứ cấp - SRCS ASEAN: do các PTN của các HĐDĐ, viện kiểm nghiệm quốc gia thiết lập, trong quá trình thiết lập chuẩn có sử dụng chuẩn gốc PCRS để 3 so sánh. Quá trình thiết lập, phân phối chất chuẩn Dược điển do các HĐDĐ thực hiện và tuân theo các hướng dẫn của ISO guide 35 – 2017 [44]. • Chuẩn quốc gia - VNRS: Được thiết lập tại Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương - Bộ Y tế hoặc Viện Kiểm Nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh - Bộ Y tế; được đánh giá bởi ít nhất hai khoa thử nghiệm là khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu và một khoa thử nghiệm khác trong Viện; được liên kết với chất chuẩn gốc. – Chuẩn làm việc (Working standard): Là một chuẩn thứ cấp do một nhà sản xuất hoặc một PTN tự thiết lập [66]. 1.3. Hướng dẫn quy trình thiết lập chất chuẩn gốc Chất chuẩn gốc được công nhận rộng rãi do đó quy trình thiết lập chất chuẩn gốc phải được ban hành bởi các tổ chức có thẩm quyền và tuân thủ nghiêm ngặt. Quy trình thiết lập chất chuẩn gốc gồm 6 bước như sau [20], [83]:  Bước 1: Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn gốc Sản xuất, xác nhận, duy trì và phân phối các chất chuẩn gốc là việc tốn nhiều chi phí và thời gian, do đó vấn đề đầu tiên cần được đánh giá là liệu có một quy trình nào đó có thể thay thế bởi một quy trình khác thỏa mãn yêu cầu tương đương mà không cần phải dùng đến chất chuẩn gốc hay không.  Bước 2: Thu thập nguyên liệu nguồn Nguyên liệu nguồn có chất lượng đạt yêu cầu có thể được lựa chọn từ lô nguyên liệu sản xuất có chất lượng tốt nhất và được cung cấp bởi các nhà sản xuất dược phẩm. Các kỹ thuật tinh chế là cần thiết để nguyên liệu được chấp nhận sử dụng như một chất chuẩn gốc. Các yêu cầu về độ tinh khiết cho một chất chuẩn gốc phụ thuộc vào mục đích sử dụng: • Một chất chuẩn gốc đề xuất cho một phép thử định tính không đòi hỏi sự tinh khiết quá cao, bởi sự hiện diện của một tỷ lệ nhỏ tạp chất thường không ảnh hưởng đáng chý ý đến phép thử. • Các chất chuẩn gốc được sử dụng trong các phép định lượng nên có độ tinh khiết cao. Theo nguyên tắc cơ bản hướng dẫn, độ tinh khiết 99,5% trở lên là cần thiết, 4 tính trên nguyên liệu dạng khan hoặc không chứa các chất dễ bay hơi. Khi nguyên liệu nguồn sử dụng làm chất chuẩn gốc được lấy từ nhà cung cấp, cần cung cấp các tài liệu sau: • Chứng chỉ phân tích với đầy đủ thông tin về các phương pháp thử, giá trị được tìm thấy và số lượng bản sao được sử dụng (nếu có), và quang phổ và/hoặc sắc ký đồ thích hợp; • Kết quả của bất kỳ nghiên cứu độ ổn định nào; • Thông tin về điều kiện bảo quản tối ưu cần thiết để đảm bảo độ ổn định (cân nhắc về nhiệt độ và độ ẩm); • Kết quả của bất kỳ nghiên cứu về tính hút ẩm và/hoặc công bố về tính hút ẩm của nguyên liệu nguồn; • Sự xác định của các tạp chất được phát hiện và/hoặc thông tin cụ thể về hệ số đáp ứng liên quan được xác định bằng những phương pháp rút gọn liên quan đến thành phần chính, và/hoặc phần trăm khối lượng tạp chất; • Bảng dữ liệu an toàn nguyên liệu cập nhật.  Bước 3: Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc Cơ quan ban hành cần phải xem xét tất cả các dữ liệu thu được từ những kiểm tra nguyên liệu thiết lập chuẩn bằng nhiều phương pháp phân tích khác nhau. Mức độ và phạm vi phân tích được yêu cầu phụ thuộc vào mục đích sử dụng chất chuẩn gốc. i. Sử dụng trong phép thử định tính Để sử dụng cho phép thử định tính, một lô nguyên liệu có chất lượng tốt (đạt yêu cầu về độ tinh khiết) được lựa chọn từ một quy trình sản xuất. Điều quan trọng nhất là kiểm tra được năng lực của nguyên liệu thông qua việc thử nghiệm trên các phép thử dự định. Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn [83]. ii. Sử dụng trong các phép thử tinh khiết Yêu cầu về độ tinh khiết của chất chuẩn gốc sử dụng với mục đích thử độ tinh khiết sẽ cao hơn so với mục đích định tính. Nếu sử dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC), độ tinh khiết tối thiểu có thể là 90%, tuy nhiên đối với kỹ thuật sắc ký lỏng (LC) hoặc sắc ký khí (GC) thì ít nhất là 95%. Thông thường chỉ cần một phòng thí nghiệm 5 tham gia đánh giá chất chuẩn gốc dùng cho phép thử tinh khiết. Nếu chất chuẩn gốc được phân lập lần đầu tiên, phải áp dụng các phép thử hóa học và vật lý thích hợp như cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS) và phân tích nguyên tố để mô tả đặc tính cấu trúc [85]. iii. Sử dụng trong các phép định lượng Nếu chất chuẩn gốc được sử dụng trong một phép định lượng, mức độ và phạm vi kiểm tra sẽ rộng và nghiêm ngặt hơn. Tối thiểu ba phòng thí nghiệm cần hợp tác để đánh giá chất đề xuất, sử dụng nhiều kỹ thuật được thiết lập và thẩm định bao gồm cả phương pháp được quy định trong Dược điển. Khi áp dụng phương pháp không đặc hiệu như đo quang phổ UV hay so màu, cần phải kiểm tra đáp ứng tương đối giữa hoạt chất và tạp chất có mặt. Khi sử dụng một phương pháp chọn lọc điều quan trọng là xác định chính xác số lượng tạp chất. Trong trường hợp này, tốt nhất nên kiểm tra chất chuẩn đề xuất bằng nhiều phương pháp nhất có thể, bao gồm phương pháp tuyệt đối [83], [85]. iv. Sử dụng trong hiệu chuẩn dụng cụ, thiết bị Mức độ kiểm tra tương tự như đối với chất chuẩn sử dụng trong các phép định lượng. Một số phòng thí nghiệm cần hợp tác để đánh giá chất chuẩn được đề xuất bằng cách sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích để xác nhận độ tinh khiết của chất chuẩn đề xuất là phù hợp.  Bước 4: Các phương pháp hóa học và vật lý được sử dụng để đánh giá chất chuẩn gốc Các phương pháp lựa chọn được chia thành hai nhóm lớn:  Nhóm các phương pháp nhận dạng: • Các mô tả vật lý: Cảm quan, kính hiển vi quang học, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng. • Bộ phổ: Nếu chất chuẩn gốc được đề xuất có cấu trúc đã được xác định rõ ràng thì có thể nhận dạng thông qua bộ dữ liệu phổ IR, NMR, MS, UV bằng cách so sánh. Nếu chất chuẩn được đề xuất là chất có cấu trúc mới hoặc thiếu dữ kiện mô tả về tính chất thì ngoài việc sử dụng bộ phổ (IR, NMR, MS, UV) thì cần phải sử dụng thêm các kỹ thuật phân tích hiện đại dùng để mô tả các hợp chất mới như phân tích nguyên tố, nghiên cứu tinh thể học, phân tích nhóm chức,… để mô tả 6 đầy đủ đặc tính của chất chuẩn được đề xuất [85].  Nhóm các kỹ thuật xác định độ tinh khiết: • Xác định tạp chất liên quan bằng các kỹ thuật: HPLC/DAD, LC/MS, CE. • Xác định tạp chất vô cơ bằng phương pháp: tro toàn phần, tro sulfat, AAS, ICPMS. Xác định lượng nước và các chất dễ bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô, • phân tích nhiệt trọng lượng TGA; ngoài ra lượng nước có thể được xác định bằng kỹ thuật chuẩn độ Karl Fischer, lượng dung môi dễ bay hơi xác định bằng GC [80]. Xác định độ tinh khiết trực tiếp bằng các kỹ thuật: qNMR, DSC. • Theo hướng dẫn của USP một số phương pháp phân tích thường được sử dụng [79]: - Cảm quan; - Kiểm tra nhận dạng (NMR, IR, UV,…); - Kiểm tra độ tinh khiết gián tiếp (khoảng nóng chảy, góc quay cực riêng,…); - Kiểm tra độ tinh khiết trực tiếp (Độ tinh khiết sắc ký, xác định tạp chất vô cơ, xác định tạp chất bay hơi gồm nước và dung môi bay hơi); - Phân tích nhóm chức (chuẩn độ, UV/VIS, phân tích nguyên tố,…); - Định lượng dựa vào lô chất chuẩn đặc tính tốt khác trước đó.  Bước 5: Xác định giá trị ấn định Giá trị ấn định được xác định dựa trên kết quả đánh giá liên phòng trong đó các PTN sử dụng phương pháp phân tích khác nhau. Thông thường các giá trị này được tập hợp từ ít nhất 3 PTN độc lập tham gia thiết lập chuẩn gốc. Giá trị thực nghiệm thu được này đại diện tốt nhất cho ước tính giá trị thực [83]. Khi tất cả các phép thử độ tinh khiết đã được hoàn thành và các phương pháp đã được thẩm định đầy đủ, độ tinh khiết của chất chuẩn gốc được tính theo công thức sau: Độ tinh khiết = 100% – % tạp chất hữu cơ - % tạp chất vô cơ - % nước - % dung môi tồn dư [79], [85]. Hay: Độ tinh khiết = [100% - (nước + dung môi tồn dư + tạp chất vô cơ) × độ tinh khiết sắc ký/điện di] (%) [75]. Giá trị ấn định được xác lập bằng cách so sánh kết quả phân tích giữa các PTN thông qua việc sử dụng phương pháp kiểm định thống kê ANOVA [7], [42]. 7  Bước 6: Xử lý và phân phối các CCĐC Sự nguyên vẹn (về mặt đặc tính) phải được đảm bảo và duy trì trong suốt thời gian sử dụng. Hoạt động đóng gói: Phải tuân thủ các yêu cầu GMP. Lọ chứa chất chuẩn gốc phải tránh độ ẩm, ánh sáng, oxy và phải được kiểm tra tính thấm ẩm. Các chất đắt tiền hoặc chỉ có sẵn với lượng rất nhỏ có thể được pha thành dung dịch sau đó đông khô hoặc bay hơi. Một số chất chuẩn gốc phải được đóng gói trong khí trơ hoặc trong điều kiện độ ẩm được kiểm soát. Bảo quản: Thông tin về các điều kiện bảo quản thường có thể lấy từ nhà sản xuất nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc và nên được yêu cầu thường xuyên khi một chất chuẩn mới được thiết lập. Lưu trữ ở nhiệt độ khoảng 2℃ - 8℃ với các biện pháp chống hấp thụ độ ẩm thích hợp đã được chứng minh phù hợp cho hầu hết các chất chuẩn [83]. Độ ổn định: Độ ổn định của các chất chuẩn gốc nên được theo dõi bằng cách kiểm tra lại thường xuyên và nên được thay thế ngay khi xuất hiện một sự thay đổi đáng kể một đặc tính. Việc lựa chọn phương pháp phân tích thích hợp để theo dõi sự ổn định phụ thuộc vào tính chất và mục đích sử dụng của chất chuẩn. Thông tin được cung cấp với các chất chuẩn gốc: Trên nhãn của chất chuẩn gốc cần cung cấp các thông tin sau [41], [83]: • Tên thích hợp: tên quốc tế (International Nonproprietary Name – INN); • Tên của cơ quan ban hành; • Số lượng của nguyên liệu trong bao bì; • Số lô hoặc số đăng ký. Phân phối và cung cấp: việc phân phối trong cùng một quốc gia thường không gây ra vấn đề tuy nhiên khi các mẫu được gửi đi các nước khác, cả bên gửi và bên nhận đều có thể gặp khó khăn do sự khác nhau về quy định bưu chính, hải quan. Vì vậy cần phải tìm cách giải quyết các rào cản đối với phân phối chất chuẩn gốc. Thời hạn sử dụng: Các chất chuẩn gốc không có “hạn sử dụng” theo nghĩa thông thường. Để tránh việc loại bỏ lãng phí các chất đạt yêu cầu, cơ quan ban hành có thể sử dụng cơ chế kiểm soát chung của mẻ chất chuẩn gốc. Nếu đặc biệt cần thiết phải xác 8 định ngày hết hạn hoặc ngày kiểm tra lại, cần ghi lại trên nhãn và/hoặc trong một số tài liệu kèm theo chất chuẩn gốc và phải lưu lại hồ sơ [83]. 9 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN CÁC KỸ THUẬT XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN DẠNG CHẤT CHUẨN GỐC 2.1. Mô tả vật lý 2.1.1. Kiểm tra cảm quan Các đặc điểm nhìn thấy được như màu sắc, kết cấu (texture), hình thái học (morphology) cũng như sự nhiễm bẩn nhìn thấy được. Các chất hầu như sẽ thay đổi màu sắc hoặc kết cấu khi tiếp xúc với các tác nhân như ánh sáng hoặc độ ẩm. Do đó, kiểm tra cảm quan là một biện pháp quan trọng để kiểm tra các chất chuẩn [66]. 2.1.2. Kính hiển vi quang học Kính hiển vi quang học liên quan đến việc kiểm tra nguyên liệu thiết lập chuẩn và xác định sự kết tinh dưới kính hiển vi. Một đánh giá ban đầu về hình thái chất chuẩn, tính đồng nhất, một khía cạnh định tính của khúc xạ ánh sáng bằng tinh thể có thể dễ dàng quan sát bằng kỹ thuật này. Các hạt tinh thể sẽ xuất hiện sự thay đổi từ sáng đến tối (hoặc thay đổi màu sắc), dạng vô định hình sẽ không thay đổi khi xoay bàn soi của kính hiển vi phân cực [71]. 2.1.3. Xác định điểm chảy Điểm chảy của một chất là nhiệt độ đã hiệu chỉnh, tại đó hạt chất rắn cuối cùng của chất thử nghiệm chuyển thành trạng thái lỏng, bắt đầu biến màu, hóa than hoặc sủi bọt. Để xác định điểm chảy, tùy theo tính chất lý học của từng chất mà áp dụng phương pháp xác định điểm chảy phù hợp [5]. Điểm chảy là một hằng số vật lý biểu thị sự nhận dạng và độ tinh khiết của nguyên liệu [14], [85]. 2.1.4. Góc quay cực riêng Theo Dược điển Việt Nam V- PL 6.4: Góc quay cực là góc của mặt phẳng phân cực khi bị quay đi khi ánh sáng phân cực đi qua chất đó nếu là chất lỏng hoặc qua dung dịch chất đó nếu là chất rắn. Nếu không có hướng dẫn riêng, góc quay cực α được xác định ở nhiệt độ 20℃ và với chùm tia đơn sắc có bước sóng ứng với vạch D (589,3 nm) của đèn natri qua lớp chất lỏng hay dung dịch có bề dày 1 dm. Góc quay cực riêng [α]20 𝐷 của một chất lỏng là góc quay cực đo được khi chùm ánh sáng D truyền qua lớp chất lỏng ddó có bề dày là 1 dm ở 20℃ chia cho tỷ trọng tương đối của chất ở cùng nhiệt độ. 10