Tài liệu Tổng quan một số ứng dụng của quang phổ Raman trong kiểm nghiệm dược phẩm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MAI LINH TỔNG QUAN MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA QUANG PHỔ RAMAN TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MAI LINH TỔNG QUAN MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA QUANG PHỔ RAMAN TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Đặng Thị Ngọc Lan Bùi Việt Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến: ThS. Đặng Thị Ngọc Lan DS. Bùi Việt Phương là thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và chia sẻ cho tôi những kinh nghiệm vô cùng quý báu để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉnh sửa quý báu và kịp thời của DS. Bùi Văn Trung, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, để hoàn chỉnh nghiên cứu này một cách tốt nhất. Tôi xin cảm ơn bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã tạo điều kiện cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng suốt 5 năm học dưới mái trường này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp N1K64 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Linh MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ và đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ RAMAN................................... 3 1.1. Giới thiệu quang phổ Raman ................................................................... 3 1.1.1. Lịch sử phát triển .............................................................................. 3 1.1.2. Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn .... 4 1.2. Nguyên lý cơ bản của phổ Raman ........................................................... 5 1.2.1. Thuyết cổ điển của hiệu ứng Raman.................................................. 8 1.2.2. Thuyết lượng tử của hiệu ứng Raman ............................................. 12 1.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman ................................ 13 1.3.1. Nguyên tắc hoạt động ..................................................................... 13 1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo cơ bản .............................................................. 14 1.4. Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman ............................ 24 1.4.1. Ưu điểm .......................................................................................... 24 1.4.2. Nhược điểm và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình đo phổ ......... 27 CHƯƠNG II. ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC ..................................... 29 2.1. Phân tích định tính ............................................................................... 29 2.2. Phân tích định lượng ............................................................................. 30 2.3. Ứng dụng chung của phương pháp phân tích phổ Raman trong ngành dược………………………………………………………………………… .. 35 2.4. Ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc. ............................................................................................ 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................. 46 1. Kết luận.................................................................................................... 46 2. Đề xuất..................................................................................................... 46 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT API Active Pharmaceutical Ingredients Dược chất có hoạt tính CCD Charge-coupled device Thiết bị tích điện kép FT Fourier Transform Biến đổi Fourier MS Mass spectrometry Khối phổ NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NIR Near Infrared Hồng ngoại gần IR Infrared Hồng ngoại S/N Signal-to-noise Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu TLTK UV-VIS Tài liệu tham khảo Ultraviolet–visible Tử ngoại-khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số loại nguồn laser sử dụng trong công nghệ dược phẩm…………………………………………………………………………16 Bảng 2.1. Tổng quan về một số quy trình định lượng dược phẩm bằng phổ Raman đã được công bố từ năm 2002-2006…………………………………31 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu………………………………………………………………………..…..6 Hình 1.2 .Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng lượng………………………………………………………………………..…7 Hình 1.3. Tán xạ Stokes và đối Stokes của CCl4………………………….....10 Hình 1.4. Sự thay đổi của các ellip phân cực trong quá trình dao động của phân tử CO2………………………………………………………………….11 Hình 1.5. Sự thay đổi momen lưỡng cực α bởi các kiểu dao động 1, 2, 3 trong phân tử CO2……………………………………………………………11 Hình 1.6. Cơ chế thay đổi mức năng lượng của tán xạ Stokes và tán xạ đối Stokes………………………………………………………………………..12 Hình 1.7. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman…………………………….14 Hình 1.8. Đầu đo kéo dài giúp đo mẫu bên trong các bao bì đựng lớn, trong môi trường độc hại…………………………………………………………..17 Hình 1.9. Đầu đo nhanh giúp đo trực tiếp các mẫu đơn giản………………..17 Hình 1.10. Bộ phận đựng mẫu hỗ trợ đo các mẫu dạng lỏng, mẫu viên…….18 Hình 1.11. Sơ đồ một detector CCD………………………………………...20 Hình 1.12. Cấu hình 90o(a) và cấu hình 180o(b)…………………………….21 Hình 1.13.Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng Renishaw…………………………………………………………………….22 Hình 1.14. Máy quang phổ Raman cầm tay hãng NanoRam®………………23 Hình 1.15. Máy quang phổ Raman cầm tay TruScan RM của hãng Thermo Scientific…………………………………………………………………….23 Hình 1.16. Kết quả định tính của một mẫu từ máy Raman cầm tay………...24 Hình 2.1. Công thức hóa học và phổ Raman của một số tá dược thường dùng, và một số API………………………………………………………………..30 Hình 2.2. Tỷ lệ cường độ tín hiệu của hợp chất……………………………..34 Hình 2.3. Phổ Raman shift Ibuprofen chuẩn………………………………...40 Hình 2.4. Phổ Raman Shift Ibuprofen mẫu thử……………………………...41 Hình 2.5. Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Ibuprofen trên thị trường………………………………………….…………………………42 Hình 2.6. Phổ Raman shift Sildenafil chuẩn………………………………...43 Hình 2.7. Phổ Raman Shift Sildenafil mẫu thử……………………………...44 Hình 2.8. Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Sildenafil trên thị trường…………………………………………………………………….45 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bên cạnh các phương pháp phân tích quang phổ thông thường được sử dụng như phổ UV - VIS, phổ IR, khối phổ... có một phương pháp phân tích quang phổ còn khá mới mẻ trong ngành Dược, đó là quang phổ Raman. Quang phổ Raman được ra đời từ những năm 30 của thế kỷ trước, nhưng do hạn chế về khoa học kỹ thuật mà nó phát triển khá chậm. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhất là kỹ thuật laser, quang phổ Raman đang ngày càng phát triển và cho thấy nhiều ưu thế. Trên thế giới, phương pháp phân tích phổ Raman được áp dụng một cách hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau như hải quan, pháp y, khảo cổ học… trong đó có trong ngành Dược. Với ưu điểm nổi bật là phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng đã mang lại nhiều tiềm năng lớn để khai thác kỹ thuật phổ này trong công tác phân tích, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và công tác phòng chống thuốc giả với độ an toàn và hiệu quả cao. Vậy nên, những nghiên cứu trong khóa luận này được thực hiện với mong muốn đưa lại một cái nhìn tổng quan về phổ Raman và khả năng ứng dụng trong ngành Dược và đặc biệt trong kiểm nghiệm Dược phẩm, nhằm tạo một nền tảng cơ bản cho việc ứng dụng của quang phổ Raman trong điều kiện thực tế tại Việt Nam. Mục tiêu của khóa luận: 1. Tìm hiểu nguyên lý tổng quan về quang phổ Raman, nguyên tắc hoạt động, nguyên tắc cấu tạo và các bộ phận chính của máy quang phổ Raman. 2. Phân tích ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman so với các phương pháp phân tích quang phổ khác. 2 3. Phân tích khả năng ứng dụng thực tế của quang phổ Raman trong ngành Dược và khả năng áp dụng phương pháp quang phổ này trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc. 3 Chương I. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ RAMAN 1.1. Giới thiệu quang phổ Raman 1.1.1. Lịch sử phát triển Năm 1928, chỉ với các thiết bị đo đạc thô sơ, sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn kích thích, kính hiển vi làm bộ phận hội tụ ánh sáng tán xạ, “detector” bằng mắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra một hiệu ứng tán xạ ánh sáng yếu, hiệu ứng này sau đó được đặt theo tên ông, hiệu ứng Raman. Với điều kiện thiếu thốn như thế, sự phát hiện ra một hiện tượng yếu như tán xạ Raman là một thành quả rất đáng khâm phục và nó đã giúp ông đạt được giải Nobel vật lý năm 1930. [11] Theo thời gian, đã có những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị đo đạc tán xạ Raman. Những nghiên cứu đầu tiên được tập trung phát triển là nguồn ánh sáng kích thích. Các loại đèn từ các nguyên tố khác nhau được nghiên cứu (như heli, chì, kẽm) nhưng không đạt yêu cầu bởi vì cường độ ánh sáng tán xạ thu được vẫn rất yếu. Nhiều năm sau đó, người ta nghiên cứu áp dụng và phát triển nguồn kích thích bằng đèn thủy ngân, nhưng nó vẫn không mang lại hiệu quả như mong muốn. Cho tới tận năm 1962, đã có bước ngoặt lớn trong công nghệ Raman, đó là người ta đã đưa laser vào làm nguồn kích thích cho tán xạ Raman. Các loại nguồn Laser sử dụng phổ biến thời đó chủ yếu là laser thuộc vùng UV-VIS như Laser Ar+ (351,1-514,5nm); Kr (337,4674,4nm) và cho đến gần đây các nguồn laser IR và NIR được đưa vào sử dụng làm hạn chế rất nhiều hiện tượng huỳnh quang (một hiện tượng tác động mạnh đến việc thu phổ Raman). [28] Nhưng vẫn có nhiều hạn chế khiến cho quang phổ Raman phát triển tương đối chậm. Đầu tiên là khó khăn trong việc điều khiển hệ thống quang học. Thứ hai là huỳnh quang trong chất mẫu ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát 4 hiện Raman. Thứ ba, tán xạ Raman là tán xạ yếu, tản mát, muốn ghi được chính xác phổ của nó thì cần phải chiếu xạ laser kích thích trong một thời gian dài, điều này dẫn đến sự phân hủy và biến tính của mẫu. Vậy nên, mặc dù bản chất là một phương pháp phân tích không phá hủy mẫu, nhưng một vài trường hợp, phổ Raman lại được nhận định là một phương pháp phá hủy mẫu chất. [28] Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ Raman. Nhờ sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng rãi hơn. Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát tại thực địa các mẫu cần phân tích. 1.1.2. Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn Với sự phát triển mạnh mẽ như vậy, ngày nay quang phổ Raman không chỉ còn là phương pháp phân tích cơ bản sử dụng trong phòng thí nghiệm mà còn được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học khác nhau. Trong khoa học vật liệu, quang phổ Raman giúp xác định cấu trúc vật liệu, xác định thành phần cấu tạo trong hỗn hợp rắn. Trong pháp y, người ta sử dụng quang phổ Raman như một công cụ hiệu quả để tìm ra các chất độc hại, gây tử vong hoặc dùng phương pháp phổ Raman để bổ sung khẳng định kết luận pháp y. Trong khảo cổ học, người ta dùng phổ Raman để tìm ra các kim loại, đá quý, xác định nguồn gốc các cổ vật... Trong hải quan, phổ Raman dùng để kiểm tra nhanh phát hiện các chất cấm như ma túy, chất gây nghiện, hướng thần, chất 5 kích thích…Và đặc biệt trong ngành Dược có rất nhiều ứng dụng quan trọng sẽ được đề cập đến ở phần sau. 1.2. Nguyên lý cơ bản của phổ Raman [1], [11], [28] Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ ánh sáng, thì quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ. Tán xạ này xảy ra do va chạm giữa các photon và các phân tử. Ánh sáng tới với tần số 0 trên một phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h 0. Ví dụ nguồn laser có bước sóng 500 nm và công suất 1W chứa khoảng 2,5x1018 photon trong một giây. Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử. Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là tán xạ Rayleigh. Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số với ánh sáng tới. Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử và trao đổi năng lượng sau va chạm. Nếu phân tử nhận năng lượng h từ photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h( của photon tán xạ khi đó là 0– 0 – ), và tần số . Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng h từ phân tử, các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h( và tần số của photon tán xạ là 0 0 + ) + . Tán xạ mà có sự trao đổi năng lượng của photon với một phân tử như trên được gọi là tán xạ Raman. Và các tán xạ có tần số 0 – và có tần số “tán xạ đối Stokes”. 0 + được gọi tương ứng là “tán xạ Stokes” và 6 Hình 1.1. Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu Khi chiếu bức xạ điện từ h vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu hoặc phát xạ  Tán xạ Rayleigh xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với nguyên tử.  Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết trong phân tử. Cũng như các phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman, ta khảo sát sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử. Quá trình trao đổi năng lượng có thể xảy ra giữa các mức năng lượng của điện tử, các mức năng lượng của dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang phổ Raman chúng ta chỉ khảo 7 sát năng lượng dao động phân tử, cụ thể hơn đó là dao động dọc theo trục của các liên kết. Hình 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes. Tán xạ Stokes xảy ra khi một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng kích thích. Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số. Vì vậy, trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes. Hình 1.2. Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng lượng Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman đặc trưng cho sự thay đổi tần số trong hiệu ứng Raman được gọi là “Raman shift”. Đối với một chất, cường độ của các bức xạ tương ứng trên Raman shift là khác nhau, chúng tạo nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm chức thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau. Vì vậy, phân tích phổ Raman, chúng ta có thể xác định được chính xác một chất và nghiên cứu cấu trúc của chất ấy. 8 1.2.1. Thuyết cổ điển của hiệu ứng Raman [1], [11] Khi một phân tử nào đó được đặt trong điện trường E của bức xạ điện từ có tần số 0, dưới tác dụng của điện trường có sự phân bố lại electron trong phân tử và làm xuất hiện momen lưỡng cực P. Khi điện trường E đủ nhỏ, độ lớn của momen lưỡng cực P và của E tỷ lệ thuận với nhau và được biểu diễn bởi công thức sau P = αE (1.1) Trong đó, α là hệ số phân cực. Trạng thái phân cực có thể tạo thành dễ dàng như là khi một đám mây electron nào đó biến dạng. Trong hệ tọa độ không gian Oxyz, phương trình (1.1) được viết lại như sau (1.2) Để đơn giản, chúng ta giả sử P và E là các giá trị trong cùng một trục tọa độ. Thay E = E0 cos 2πv0t vào phương trình (1.1) ta được: P = α E0 cos 2πv0t (1.3) Hệ số phân cực α không phải là một hằng số mà nó có thể thay đổi trong suốt quá trình dao động của phân tử. Chúng ta có thể chia hệ số phân cực này thành hai thành phần, thành phần α0 không đổi khi phân tử không dao động và một thành phần Q (Q = Q0 cos 2πv0t). Khi đó ta có: α = α0 + ( )0 Q = α0 + ( Thay (1.4) vào (1.3) ta được )0 Q0 cos 2πvt (1.4) 9 Phương trình trên chỉ ra momen lưỡng cực P gồm có ba tần số dao động là 0, 0 – và 0+ . Số hạng đầu tiên chỉ ra tán xạ cùng tần số 0 với ánh sáng tới, đó là tán xạ Rayleigh. Số hạng thứ hai biểu thị sự thay đổi tần số so với ánh sáng tới và như được biết đó là tán xạ Stokes và đối Stokes (tán xạ Raman). Phương trình (1.5) chỉ ra điều kiện tiên quyết để có tán xạ Raman là yếu tố(∂α/∂Q)0Q0E0 không thể là 0. Tức là Q0 hay E0 đều không thể là 0, điều kiện quan trọng là (∂α/∂Q)0 ≠ 0. Theo phương trình trên, hoạt động Raman chỉ là những dao động mà có sự thay đổi độ phân cực kết hợp với dao động trong phân tử. Hai số hạng trong phương trình (1.5) cho ta thấy sự liên quan giữa các tán xạ Raman (tán xạ Stokes và đối Stokes) và tỷ lệ giữa tán xạ Raman với tán xạ Rayleigh. Bởi vì cường độ của tán xạ đối Stokes phụ thuộc vào số lượng của những phân tử ở trạng thái kích thích ban đầu, mặt khác các phân tử này ở trạng thái kích thích thường có nhiệt độ cao mà phân bố Boltzmann lại giảm khi nhiệt độ của chất tăng. Chính vì vậy, tán xạ đối Stokes là ít hơn, khó thu thập hơn và có cường độ nhỏ hơn tán xạ Stokes. Phương trình (1.5) không chỉ ra tỷ lệ giữa ba loại tán xạ này, nhưng thực nghiệm cho thấy cả hai loại tán xạ Raman này đều yếu hơn tán xạ Rayleigh (thường là nhỏ hơn 0,1%). 10 Hình 1.3. Tán xạ Stokes và đối Stokes của CCl4 Để minh họa cho các hoạt động Raman, chúng ta cùng tìm hiểu về các trạng thái dao động của phân tử CO2. Hình 1.4 miêu tả ba trạng thái dao động của phân tử CO2 và hình 1.5 chỉ ra sự thay đổi độ phân cực α theo các trạng thái dao động 1, 2, 3. Trong quá trình dao động IR, độ phân cực của phân tử là không đổi, còn theo phương trình (1.5) để có hoạt động Raman thì tỷ số (∂α/∂Q)0 ≠ 0 (độ phân cực thay đổi) nên trạng thái dao động Raman, còn trạng thái dao động 2 và 3 là dao động IR. [28] 1 là dao động 11 Hình 1.4.Sự thay đổi của các ellip phân cực trong quá trình dao động của phân tử CO2 Hình 1.5. Sự thay đổi momen lưỡng cực α bởi các kiểu dao động 1, 2, 3 trong phân tử CO2 Ví dụ trên minh họa mối quan hệ loại trừ lẫn nhau giữa các dao động IR và Raman trong các phân tử, tuy nhiên, vẫn có sự chồng chéo giữa phổ IR và phổ Raman. Vì vậy việc lựa chọn dải phổ đặc trưng cho các loại dao động này là rất quan trọng. Tóm lại dao động đối xứng kéo dài hoặc thu hẹp của các đám mây điện tử là dao động Raman mà không phải IR. Còn các dao động uốn, rung động