Tài liệu Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A H5N1 và A H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------------- LÊ THỊ THANH TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI TỪ VIRÚT CÚM A/H5N1 VÀ A/H3N2 BẰNG KĨ THUẬT DI TRUYỀN NGƢỢC Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ THỊ QUỲNH MAI Nội - 2012 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... I DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... II CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................ III MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ..................................................................................... 3 1.1. Khái quát về virút cúm ............................................................................. 3 1.2. Hệ gen của virút cúm A ............................................................................ 4 1.3. Quá trình nhân lên của virút cúm A ........................................................ 9 1.4. Vai trò của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền trong các vụ đại dịch cúm trên thế giới. ........................................................................ 12 1.5. Ứng dụng kĩ thuật di truyền ngƣợc tổng hợp virút cúm A. .................. 14 1.6. Cơ sở khoa học để thiết kế và thực hiện nghiên cứu. ............................ 16 1.7. Vấn đề đạo đức và An toàn sinh học trong nghiên cứu ......................... 19 CHƢƠNG 2 - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 20 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.............................................................................. 20 2.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 20 2.2.1. Plasmid pHW2000 và hệ thống plasmid chứng dương ....................... 20 2.2.2. Sinh phẩm và hóa chất ....................................................................... 21 2.2.3. Hệ thống cảm nhiễm virút cúm .......................................................... 25 2.2.4. Trang thiết bị và dụng cụ .................................................................... 26 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 27 2.3.1. Lựa chọn chủng virút gốc ................................................................... 28 2.3.2. Chuẩn bị vector nhân dòng ................................................................. 28 2.3.3. Chuẩn bị ADN nhân dòng .................................................................. 28 2.3.4. Nhân dòng ADN đích vào plasmid pHW2000 .................................... 30 2.3.5. Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence) ..................... 31 2.3.6. Chuẩn bị plasmid cho quá trình chuyển nhiễm ................................... 32 2.3.7. Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào ...................................................... 33 2.3.8. Khuếch đại virút ................................................................................. 33 2.3.9. Xác định hiệu giá virút ....................................................................... 34 2.3.10. Xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) ................... 36 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................. 38 3.1. TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI TỪ VIRÚT A/H5N1 VÀ A/H3N2. ... 38 3.1.1. Lựa chọn chủng virút gốc ................................................................... 39 3.1.1.1. Virút A/H5N1.............................................................................. 39 3.1.1.2. Virút A/H3N2.............................................................................. 39 3.1.2. Chuẩn bị vector nhân dòng và ADN đích ........................................... 40 3.1.2.1. Chuẩn bị vector nhân dòng .......................................................... 40 3.1.2.2. Chuẩn bị ADN đích ..................................................................... 41 3.1.3. Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid tạo virút cúm ................... 45 3.1.3.1. Nhân dòng ADN đích .................................................................. 45 3.1.3.2. Hệ thống chuyển nhiễm tám plasmid tổng hợp virút cúm rgA/H5N1 ...................................................................................... 50 3.1.4. Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid. . 55 3.1.4.1.Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 ................................................... 55 3.1.4.2. Hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1. ............................................... 58 3.2. Tìm hiểu đặc tính của virút cúm rg-A/H5N1 (gia cầm – ngƣời) ........... 61 3.2.1. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK và trứng gà có phôi. ............................................................................................. 61 3.2.2. Định lượng virút rg-A/H5N1 bằng kỹ thuật plaque (tạo đám hoại tử). 64 3.2.3. Khả năng gây bệnh của virút cúm rg-A/H5N1 trên động vật thí nghiệm .......................................................................................................... 66 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 68 ĐỀ XUẤT.................................................................................................................. 69 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN và protein của virút cúm A . ........................................ 5 Bảng 2.1. Hệ thống mồi dùng khuếch đại các phân đoạn gen đích .............................. 22 Bảng 2.2. Hệ thống mồi dùng cho quá trình giải trình tự nucleotide ........................... 23 Bảng 3.1. Kết quả giải trình tự các đoạn ADN đích trước nhân dòng. ......................... 44 Bảng 3.2. Kích thước các plasmid được kiểm tra. ....................................................... 49 Bảng 3.3. Tám plasmid lựa chọn cho hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm rg-A/H5N1 ................................................................................................................................... 50 Bảng 3.4. Kết quả so sánh trình tự ADN đích sau nhân dòng với trình tự ADN đích trước nhân dòng.......................................................................................................... 51 Bảng 3.5. Đánh giá chức năng mỗi plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm.................. 54 Bảng 3.6. Phát hiện virút rg-A/H5N1 tổng hợp từ hệ thống tám plasmid thông qua khả năng ngưng kết hồng cầu. ........................................................................................... 56 Bảng 3.7. Mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1 ...................................... 58 Bảng 3.8. Nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N160 Bảng 3.9. Hiệu giá (HA) virút rg-A/H5N1 khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà có phôi........................................................................................................................ 62 Bảng 3.10. Định lượng virút rg-3 và rg-4 bằng kĩ thuật plaque. .................................. 65 Bảng 3.11. Kết quả thí nghiệm xác định LD50 của virút rg-4 trên chuột Swiss. .......... 66 i DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Mô hình cấu trúc virion virút cúm ................................................................. 4 Hình 1.2. Chu trình nhân lên của virút cúm. ............................................................... 10 Hình 1.3. Nguồn gốc các chủng virút cúm gây đại dịch. ............................................. 13 Hình 2.1. Mô hình cấu trúc vector pHW2000. ............................................................ 21 Hình 2.2. Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A và quy trình tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2. ......... 27 Hình 3.1. Quy trình tổng hợp virút cúm mới rg-A/H5N1 từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược ...................................................................... 38 Hình 3.2. Sự lưu hành các phân típ virút cúm mùa theo năm. ..................................... 40 Hình 3.3. Kiểm tra plasmid trên gel agarose. .............................................................. 41 Hình 3.4. Tổng hợp ADN đích bằng PCR ................................................................... 42 Hình 3.5. Sản phẩm ADN đích sau tinh sạch .............................................................. 43 Hình 3.6. Xác định vi khuẩn chứa plasmid trên môi trường chọn lọc. ........................ 46 Hình 3.7. Kiểm tra kích thước plasmid trên gel agarose .............................................. 48 Hình 3.8. Kiểm tra mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1 ........................ 59 Hình 3.9. Khả năng nhân lên của virút rg-A/H5N1 trong hệ thống cảm nhiễm. .......... 63 ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN DeoxyRibonucleic Acid ARN Ribonucleic Acid HA Haemagglutination Assay (Phương pháp ngưng kết hồng cầu) HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza (virút cúm gia cầm độc lực cao) MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells (tế bào thận chó thường trực) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PTN Phòng thí nghiệm rg Reverse genetic (di truyền đảo ngược) RNP Ribonucleoprotein (phức hệ ribonucleoprotein) TCTTTG Tổ chức Y tế thế giới TPCK L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone vRNA ARN của virut vRNP phức hệ ribonucleoprotein của virút iii MỞ ĐẦU Trong lịch sử y học, các đại dịch cúm xảy ra đều có căn nguyên là virút cúm A (Infuenza A virus). Virút cúm gây đại dịch / dịch là do có sự thay đổi đặc tính kháng nguyên. Sự thay đổi này có thể theo kiểu biến thể kháng nguyên (antigenic drift) do đột biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho haemagglutinin (HA) hoặc hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) [3] do trao đổi và tích hợp di truyền (reassortment) giữa các chủng virút cúm khác nhau. Từ đầu thế kỷ XX đến nay đã có 5 đại dịch cúm được ghi nhận, trong đó 3 đại dịch (các năm 1957, 1968 và 2009) xảy ra do xuất hiện virut cúm mới nhờ hiện tượng trao đổi và tích hợp di truyền [2, 7, 14, 17, 25]. Trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền (reassortment) là một trong những đặc điểm của virút cúm A. Nhờ đó, khi có hai hay nhiều chủng virút, khác biệt về mặt di truyền, cùng lúc xâm nhiễm vào một tế bào sẽ tạo ra chủng virút mới có cấu trúc hệ gen pha trộn giữa hệ gen virút “bố” và “mẹ” chúng. Virút mới (đặc tính kháng nguyên mới) sẽ kháng lại kháng thể đã được hình thành trong đáp ứng miễn dịch lần trước và có khả năng lây nhiễm vào vật chủ mới mà chủng “bố - mẹ” chúng không có khả năng gây nhiễm. Chủng virút mới có thể là nguyên nhân gây dịch / đại dịch cúm [3]. Ở Việt Nam, ngoài các phân típ virút cúm A lưu hành ở người theo mùa (A/H3N2, A/H1N1) đã ghi nhận nhiều bệnh nhân nhiễm virút cúm gia cầm độc lực cao H5N1 (HPAI H5N1) [10, 12]. Sự xuất hiện virút cúm A/H5N1 thường xuyên trong đàn gia cầm cùng với tập quán chăn nuôi gia cầm tại hộ gia đình của người Việt Nam có thể sẽ làm tăng nguy cơ trao đổi và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm và virút cúm người. Ngoài ra, tần suất thay đổi đặc tính kháng nguyên của virút cúm A/H3N2 (4 lần) nhiều hơn so với virút cúm A/H1N1 (2 lần) tại miền Bắc Việt nam (giai đoạn 2001-2008) [1,31], cho phép nghĩ đến khả năng dễ trao đổi và tích hợp giữa virút cúm A/H3N2 với virút cúm A khác khi có điều kiện thuận lợi. 1 Trên cơ sở tiến bộ khoa học trong lĩnh vực sinh học phân tử, rất nhiều các phương pháp mới đã được áp dụng trong nghiên cứu virút cúm, một trong số đó là di truyền ngược (reverse genetic). Kỹ thuật di truyền ngược cho phép chủ động tổng hợp virút cúm có đặc điểm hệ gen mong muốn nhằm tìm hiểu khả năng xuất hiện trong tự nhiên, khả năng gây bệnh cho người của virut này, từ đó chủ động xây dựng các biện pháp phòng chống hữu hiệu. Trên thế giới, di truyền ngược đã được áp dụng nhiều trong việc nghiên cứu độc lực virút cũng như phát triển vaccine cúm [30, 38, 45, 48, 51]. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc” với mục đích: 1. Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A. 2. Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 (cúm gia cầm) và A/H3N2 (cúm người) bằng hệ thống chuyển nhiễm plasmid. 3. Tìm hiểu đặc tính cơ bản của virút cúm mới. 2 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về virút cúm Đặc điểm chung Họ Orthomyxoviridae gồm năm chi: virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, virút Isa và virút Thogoto [21]. Virút cúm A lưu hành phổ biến trên người, gia cầm, chim hoang dại và một số động vật khác như lợn, ngựa, hải cẩu…, là căn nguyên gây các đại dịch cúm trên toàn cầu. Virút cúm B và C lưu hành chủ yếu ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Virút cúm A được chia thành các phân típ (subtype) dựa trên hai glycoprotein bề mặt là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). HA được chia thành 16 phân típ (từ H1 đến H16) và NA được chia thành 9 phân típ (từ N1 đến N9). Các loài chim thủy sinh là ổ chứa tự nhiên của tất cả các phân típ virút cúm A. Các phân típ gây bệnh cho người chủ yếu là H1, H2, H3 và N1, N2 [5]. Danh pháp quốc tế được quy định cho virút cúm gồm những thông tin sau: típ virút/viết tắt vật chủ (nếu là động vật)/nơi phân lập/mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập. Với virút cúm A, có thể bao gồm thêm thông tin về phân típ HA và NA của chủng virút [53]. Ví dụ: A/swine/Taiwan/l/70 (H3N2). B/EnglADN/5/66. C/Paris/l/67. Hình thái và cấu trúc virion virút cúm Virion virút cúm đa hình, có thể hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm. 3 Hình 1.1. Mô hình cấu trúc virion virút cúm Nguồn: http://www.nature.com/nrg/journal/v8/n3/full/nrg2053.html [36] [20] Virút cúm có hệ gen là ARN đơn, âm, phân đoạn. Mỗi sợi ARN liên kết với các protein NP, PA, PB1, PB2 để tạo thành phức hệ ribonucleoprotein (vRNP) (mô hình a hoặc b hình 1.1) có chức năng sao chép và phiên mã. Phức hệ này được bao bọc bởi màng protein nền và lớp vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào chủ. Trên vỏ có 2 gai glycoprotein là haemagglutinnin và neuraminidase. 1.2. Hệ gen của virút cúm A Hệ gen virút cúm A gồm tám phân đoạn ARN có chiều dài không giống nhau, đoạn ngắn nhất là 890 nucleotide (phân đoạn 8) và đoạn dài nhất là 2341 nucleotide (phân đoạn 1 và 2). Trên tám phân đoạn ARN của virút cúm đều có những trình tự nucleotide bảo tồn. Đầu tận cùng của tất cả các đoạn ARN đều có chung một trình tự gồm 13 nucleotide ở đầu 5’ và một trình tự gồm 12 nucleotide ở đầu 3’. Hai vùng bảo tồn này có trình tự ngược nhau và bổ sung một phần cho nhau. Đặc điểm này có vai trò trong quá trình phiên mã và sao chép ARN: polymerase có thể nhận biết trình tự bảo tồn ở đầu 3’của sợi ARN(-) và ở đầu 3’của sợi ARN(+) để khởi đầu quá trình tổng hợp. Một trình tự phổ biến thứ ba có ở cả tám phân đoạn ARN là trình tự uridine cách đầu 4 5’ khoảng 15-21 nucleotide, đây là tín hiệu khởi đầu cho quá trình gắn chuỗi polyA trong quá trình tổng hợp sợi ARN thông tin [27, 33, 52]. Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN và protein của virút cúm A [8, 9, 24, 26]. Phân đoạn ARN Nucleotide Protein Axit amin 1 2341 Polymerase cơ bản 2 (PB2) 759 2 2341 Polymerase cơ bản 1 (PB1) PB1 – F2 757 87 / 90 3 2233 Polymerase acid (PA) 716 4 1778 Haemagglutinin (HA) 566 5 1565 Nucleoprotein (NP) 498 6 1413 Neuraminidase (NA) 454 Protein matrix 1 (M1) 252 7 1027 Protein matrix 2 (M2) 97 Protein không cấu trúc (NS1) 230 Protein không cấu trúc (NS2) 121 8 890 5 Phân đoạn 1, 2 và 3: protein PB2, PB1, PB1-F2 và PA Phân đoạn ARN 1, 2 và 3 mã hóa cho các protein PB2, PB1, PB1-F2 và PA. Phân đoạn ARN 1 và 2 có chiều dài 2341 nucleotide. Phân đoạn 1 mã hóa cho protein tương ứng gồm 759 axit amin; phân đoạn 2 mã hóa cho hai protein là PB1 gồm 757 axit amin và PB1-F2 (87 hoặc 90 axit amin) [8, 26]. Phân đoạn 3 có chiều dài 2233 nucleotide và mã hóa cho protein gồm 716 axit amin. Kết quả từ một số nghiên cứu in vitro về quá trình phiên mã và sao chép ARN đã gợi ý rằng PB2 tham gia vào quá trình tổng hợp ARN thông tin, gắn vào cấu trúc mũ của ARN thông tin của tế bào chủ; PA liên quan đến quá trình tổng hợp sợi ARN virút (vRNA); PB1 có vai trò khởi đầu quá trình sao chép; PB1-F2 làm chết các tế bào miễn dịch đáp ứng quá trình nhiễm virút [8]. Phân đoạn 4: Hemagglutinin (HA) HA là một glycoprotein gắn trên màng virút, có vai trò trong quá trình hấp phụ và xâm nhập vào tế bào của virút. Tên gọi của protein này bắt nguồn từ khả năng ngưng kết hồng cầu bằng cách gắn vào glycoprotein đặc hiệu chứa acid neuraminic trên bề mặt tế bào hồng cầu. HA là kháng nguyên virút quan trọng nhất chống lại các kháng thể trung hòa, sự thay đổi về tính kháng nguyên của HA là nhân tố tạo thành vụ dịch cúm. Chuỗi polypeptide HA tiền thân (HA0) có thể tạo thành hai chuỗi polypeptide HA1 và HA2 nếu liên kết disµlfide bị cắt. Sự phân cắt này không ảnh hưởng đến hoạt tính gắn vào thụ cảm thể mà ảnh hưởng đến quá trình dung hợp với màng tế bào để virút xâm nhập vào tế bào vật chủ. HA1 chứa phần tận cùng N của HA, HA2 chứa phần tận cùng C, là vùng kị nước, gắn vào màng virút và có tính bảo tồn cao giữa các chủng virút. HA2 được cho rằng có vai trò giúp virút xâm nhập vào tế bào. Phân đoạn ARN 4 dài 1765 nucleotide, HA1 gồm 328 axit amin, HA2 gồm 221 axit amin. 6 Phân đoạn 5: protein nucleocapsid (NP) Protein NP tương tác không chỉ với chính nó và ARN trong phức hệ nucleocapsid mà còn tương tác với các protein PB2, PB1 và PA để hình thành đơn vị sao chép. Phân đoạn 5 có chiều dài 1565 nucleotidetide, chuỗi polypeptide gồm 498 axit amin. Nucleoprotein có vai trò bảo vệ vRNA khỏi sự phân huỷ của các enzyme phân huỷ ribonucleotide (ribonuclease). Phân đoạn 6: Neuraminidase (NA) Phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase - protein gắn màng. Neuraminidase sẽ phân cắt liên kết glycosidic gắn với nhóm keto của acid N-acetylneuraminic (acid sialic) thành D-galactose hoặc D-galactosamine. NA có dạng hình nấm, gồm 4 chuỗi polypeptide giống nhau, gắn với nhau bằng liên kết disµlfide. Trong quá trình nhân lên của virút, NA giúp giải phóng các hạt virút đang nảy chồi ra khỏi màng tế bào vật chủ. NA có thể cũng giúp bộc lộ vị trí phân cắt của phân tử HA. Hoạt tính neuraminidase cũng cho phép virút tránh các sialoglycoprotein ức chế có mặt trong đường hô hấp, cho phép virút tìm đường đến các tế bào biểu mô đích. Kháng thể kháng NA không trung hòa hoạt tính lây nhiễm của virút mà hạn chế chu trình nhân lên của virút và làm suy giảm triệu chứng bệnh. Trình tự nucleotide của đoạn ARN 6, với phân típ N1 và N2, có chiều dài 1413 nucleotide, protein gồm 453 axit amin. Phân đoạn 7: protein M1 và M2 Phân đoạn 7 mã hóa cho hai protein là M1, M2 và có thể protein thứ ba là M3. Trong đó một phân tử được phiên mã trực tiếp từ đoạn ARN, hai phân tử còn lại là kết quả của quá trình chế biến nhờ bộ máy cắt ghép (splicing) ARN thông tin của tế bào chủ. 7 Protein M1 tạo thành một lớp vỏ protein bao bọc bên ngoài để bảo vệ ribonucleoprotein. Lớp vỏ protein này có khả năng tương tác với lipid để tạo thành lớp vỏ ngoài (envelope). Protein M1 có thể nhận biết các glycoprotein virút và hình thành nên một vùng ở bề mặt bên trong của màng tế bào chất, cung cấp vị trí gắn cho các ribonucleoprotein trong quá trình đóng gói virút. M1 quyết định độ nhạy của virút với thuốc kháng virút amatidine. M2 là kênh ion xuyên màng, có vai trò trong quá trình dung hợp, cởi vỏ virút. Chiều dài của đoạn 7 là 1027 nucleotide. Protein M1 gồm 252 axit amin, M2 gồm 97 axit amin. Phân đoạn 8: protein không cấu trúc NS1 và NS2 Phân đoạn ARN nhỏ nhất mã hóa cho 2 protein là NS1 và NS2. Trong tế bào chủ, NS1 được tạo thành với lượng lớn hơn, liên kết với polysome và hạch nhân. Chức năng của NS1vẫn chưa rõ ràng, song người ta cho rằng có liên quan đến quá trình tổng hợp vRNA và đến việc ngừng tổng hợp protein của tế bào chủ. NS2 được tổng hợp trong giai đoạn nhiễm muộn, tham gia vào quá trình vận chuyển các vRNP từ nhân ra tế bào chất [43]. Đoạn ARN 8 dài 890 nucleotide, protein NS1 gồm 230 – 237 axit amin (phụ thuộc vào chủng virút), NS2 gồm 132 axit amin. 8 1.3. Quá trình nhân lên của virút cúm A Quá trình nhân lên của virút cúm A có thể chia thành các giai đoạn sau: (1) gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ, (2) phiên mã và sao chép ARN, (3) giải phóng vRNP ra khỏi nhân và (4) đóng gói, nảy chồi và giải phóng virút thế hệ mới [20, 24, 44]. (1) Gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ Gai HA của virút sẽ phát hiện và liên kết với thụ cảm thể của nó trên bề mặt tế bào chủ. Phân tử HA tiền thân, HA0, được tạo thành từ hai dưới đơn vị: HA1, có vùng gắn thụ cảm thể và HA2 có peptide dung hợp; HA1 và HA2 liên kết với nhau bằng liên kết disµlfide. Thụ cảm thể của virút cúm là axit sialic liên kết với đường galactose của glycoprotein / glycolipid bằng liên kết alpha 2,6 (virút cúm người) hoặc alpha 2,3 (virút cúm gia cầm). Hai dạng liên kết này rất quan trọng đối với tính đặc hiệu của liên kết HA – thụ cảm thể ở những loài khác nhau. Sau quá trình gắn màng, virút sẽ xâm nhập vào tế bào bằng cách tạo bọng (endosome). Trong endosome, ở điều kiện pH thấp (khoảng 5,5), phân tử HA0 sẽ bị thay đổi cấu trúc giúp bộc lộ peptide dung hợp HA2. Peptide dung hợp gắn vào màng endosome khiến cho màng virút và màng endosome hoà vào nhau. Môi trường acid trong endosome không những tạo điều kiện để quá trình dung hợp diễn ra mà còn tác động đến kênh ion M2. Ion H+ sẽ đi vào virút qua kênh M2, làm axit hoá lõi virút, giải phóng vRNP khỏi M1, các phân tử vRNP tự do này đi vào tế bào chất của tế bào chủ [11]. Các protein cấu thành vRNP là NP, PA, PB1 và PB2 đồng thời là các tín hiệu định vị nhân (NLS) [37]. Các tín hiệu định vị nhân này liên kết với các thành phần của hệ thống xâm nhập vào nhân tế bào và do đó vRNP đi vào nhân tế bào chủ. 9 (2)Phiên mã vào sao chép Hình 1.2. Chu trình nhân lên của virút cúm. Nguồn: http://varuncnmicro.blogspot.com/2012/05/influenza-hush-bush.html [34] Virút cúm có hệ gen là RNA(-), quá trình sao chép để tạo các sợi vRNA(-) mới sẽ được tổng hợp thông qua cRNA(+). cRNA(+) là sợi ARN có trình tự bổ sung với vRNA(-), có chiều dài bằng sợi vRNA(-). Quá trình sao chép hệ gen virút cúm không cần đến mồi mà thay vào đó, các ARN polymerase phụ thuộc ARN (RdRp) sẽ khởi đầu quá trình tổng hợp ARN ngay trên sợi vRNA. Đầu 5’ và 3’ của mỗi sợi vRNA có trình tự đảo ngược và bổ sung một phần với nhau do đó hình thành cấu trúc mở nút chai, cho phép khởi đầu quá trình sao chép mà không cần sử dụng mồi. Khác với nhiều virút khác có hệ gen là ARN(-), quá trình phiên mã của virút cúm diễn ra trong nhân. Người ta nhận thấy rằng trong quá trình phiên mã của virút 10 cúm có cơ chế được gọi là “dành giật mũ” (cap-snatching): PB2 của virút có hoạt tính endonuclease sẽ cắt các sợi ARN đã được gắn mũ (7-methylguanosine) của tế bào chủ ở một gốc purin cách đầu tận cùng 5’ 10 – 13 nucleotide, đoạn ARN này sẽ được sử dụng để khởi đầu quá trình phiên mã. Quá trình khởi đầu, kéo dài, kết thúc và gắn polyA đều được xúc tác bởi phức hệ protein PB2, PB1, PA và NP. Các sợi mRNA có chiều dài ngắn hơn các đoạn vRNA(-). mRNA sau khi được tổng hợp trong nhân tế bào sẽ được vận chuyển ra tế bào chất để tổng hợp các protein của virút. Các protein màng HA, NA M1 và M2 sẽ được vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào trong khi các protein NP, PA, PB1 và PB2 được chuyển vào trong nhân để cùng với vRNA(-) tạo thành vRNP(-) mới [44]. Hệ gen của virút cúm gồm 8 phân đoạn ARN mã hoá cho 11 protein đã biết. Mỗi phân đoạn 2, 7 và 8 mã hoá cho 2 protein; các phân đoạn còn lại mỗi phân đoạn mã hoá cho 1 protein. (3)Giải phóng vRNP(-) ra khỏi nhân tế bào Trong nhân tế bào, chỉ các vRNP (-) được vận chuyển qua lỗ màng nhân ra tế bào chất thông qua con đường vận chuyển phụ thuộc CRM1. Protein CRM1 là một thụ cảm thể cho các tín hiệu vận chuyển từ nhân ra tế bào chất. Đầu tận cùng C của protein M1 liên kết với vRNP, đầu tận cùng N của M1 liên kết với NS2; NS2 liên kết với protein CRM1. Phức hệ gồm M1, vRNP (-) và NS2 sẽ được vận chuyển từ nhân ra tế bào chất nhờ khả năng liên kết của NS2 với CRM1 [13]. (4)Đóng gói, nảy chồi và giải phóng virút thế hệ mới. Virút cúm sử dụng màng sinh chất của tế bào chủ để tạo thành các hạt virút hoàn chỉnh rồi rời khỏi tế bào và tiếp tục gây nhiễm các tế bào lân cận. Quá trình đóng gói virút diễn ra tại vị trí màng sinh chất có các protein HA, NA và M2 của virút. 11 Người ta đưa ra hai mô hình giả thuyết cho quá trình đóng gói các đoạn ARN virút: mô hình đóng gói ngẫu nhiên và mô hình đóng gói đặc hiệu. Theo mô hình đóng gói ngẫu nhiên, các đoạn vRNA sẽ được đóng gói một cách ngẫu nhiên bên trong virion. Mô hình đóng gói đặc hiệu dựa trên cơ sở các tín hiệu đóng gói virút được xác định là các vùng mã hoá và không mã hoá ở đầu 5’ và 3’ trên đoạn vRNA. Protein M1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói và nảy chồi hạt virút. Hạt virút chỉ đươc giải phóng ra ngoài màng sinh chất tế bào chủ khi liên kết giữa acid sialic và glycoprotein / glycolipid được cắt đứt. Quá trình này được thực hiện nhờ neuraminidasa (NA) trên bề mặt virút. 1.4. Vai trò của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền trong các vụ đại dịch cúm trên thế giới. Thế kỉ XX và đầu thế kỉ XXI đã ghi nhận có 5 đại dịch cúm xảy ra vào các năm 1918, 1957, 1968, 1977 và 2009. Tìm hiểu căn nguyên gây đại dịch cho thấy đại dịch xảy ra khi xuất hiện chủng virút có tính kháng nguyên mới và cơ thể chưa có kháng thể trung hòa virút đó. Trong 5 đại dịch đã xảy ra, 3 đại dịch cúm có căn nguyên là những chủng virút được hình thành do hiện tượng trao đổi và tích hợp di truyền, đó là các đại dịch năm 1957, 1968 và 2009 [2, 15]. 12 Hình 1.3. Nguồn gốc các chủng virút cúm gây đại dịch. Nguồn:http://blogs.discovermagazine.com/notrocketscience/2009/06/29/from-spanishto-swine-how-h1n1-kicked-off-a-91-year-pADNemic-era/ [55] 13