BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ VĂN HẢI
TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƢ
CỦA CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số: 9.44.01.14
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HÀ NỘI, 2020
Công trình đƣợc hoàn thành tại:
Viện Hoá học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Trần Văn Lộc
Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2. TS. Trần Văn Chiến
Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ tại: Học
viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam - Số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội.
Vào hồi........ giờ, ngày......... tháng....... năm .......
Có thể tìm hiểu Luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Các hợp chất thiên nhiên được xem là nguồn cung cấp vô hạn
các lớp chất có hoạt tính sinh học lý thú, phục vụ cho nghiên cứu và ứng
dụng trong y học. Sự phong phú và đa dạng về các lớp khung chất có
hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là cơ chế tác dụng của mỗi lớp khung
chất này, đã thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu từ trước
đến nay. Để phục vụ cho mục đích nghiên cứu phát triển thuốc, các hợp
chất từ các nguồn vi sinh vật thường đạt được bằng cách tổng hợp toàn
phần hoặc sẽ được biến đổi về cấu trúc hóa học nhằm tạo ra lượng lớn
sản phẩm cũng như các dẫn xuất mới.
Tubulysin là lớp chất tetrapeptide (Hình 1.8) được phân lập lần
đầu tiên năm 2000 từ 2 dòng niêm khuẩn là Angiococcus disciformis An
d48 và Archangium gephyra Ar 315. Các nghiên cứu đã cho thấy
tubulysin là lớp chất kháng phân bào tốt nhất được biết đến cho tới nay.
Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của các tubulysin thể hiện trong phạm vi
rộng trên nhiều dòng tế bào ung thư người như: ung thư buồng trứng,
ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ruột kết, phổi và ung thư máu.
Nghiên cứu in vitro và in vivo cho thấy các tubulysin ức chế sự
phát triển tế bào ung thư vượt trội khoảng 20-1000 lần so với các thuốc
chống ung thư đang sử dụng như vinblastine, epothilone hay taxol.
Hình 1.8. Công thức hóa học của các tubulysin
Từ quan điểm của các nhà hóa dược, tubulysin thiên nhiên là
lớp chất hàng đầu cho nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thư
mới. Tuy nhiên, hàm lượng của chúng trong niêm khuẩn rất thấp không
đủ cho các nghiên cứu chuyên sâu, do đó hướng nghiên cứu tổng hợp
1
toàn phần tubulysin và các dẫn xuất của chúng là rất cần thiết và có ý
nghĩa khoa học.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Luận án tập trung tổng hợp một số dẫn xuất và chất tương tự
tubulysin với sự thay thế nhóm N,O-acetyl bằng nhóm methyl, thay đổi
cấu trúc của amino acid Methylpipecolic (Mep) ở đầu N-terminal và
amino acid tubuphenylalanine (Tup) ở đầu C-terminal.
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các tetrapeptide tổng hợp
được trên một số dòng tế bào ung thư người nhằm góp phần làm rõ thêm
tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc của các tubulysin, đồng thời tìm
kiếm các hợp chất mới có hoạt tính đáng chú ý.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
+ Nghiên cứu tổng quan về niêm khuẩn.Tổng quan về tubulysin: Hoạt
tính sinh học, sinh tổng hợp các tubulysin, tương quan hoạt tính-cấu trúc
+ Nghiên cứu tổng quan về phương pháp tổng hợp các ɤ-amino acid
tubuphenylalanine (Tup) và tubuvaline (Tuv)
+ Nghiên cứu tổng hợp ɤ-amino acid Tuv
+ Nghiên cứu tổng hợp ɤ-amino acid Tup
+ Tổng hợp các dipeptide .
+ Tổng hợp các tripeptide.
+ Tổng hợp các tetrapeptide ( dẫn xuất và chất tương tự tubulysin)
+ Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các tetrapeptide tổng hợp được
Bố cục của luận án
Luận án gồm 133 trang: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (28
trang), Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm (37 trang),
Chương 3: Kết quả và thảo luận (55 trang), kết luận (1 trang), danh mục
các công trình công bố liên quan luận án (1 trang).
Phần tài liệu tham khảo có 97 tài liệu về lĩnh vực liên quan đến luận
án được cập nhật đến năm 2020.
Phần phụ lục 81 trang gồm phổ của các chất tổng hợp được.
2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Niêm khuẩn, các hoạt chất và hoạt tính sinh học
1.2. Vi ống và vai trò trong nghiên cứu thuốc
1.3. Tubulysin: Phân lập, xác định cấu trúc, hoạt tính sinh học
Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của các tubulysin thiên nhiên
3
1.4. Tổng hợp các ɤ-amino acid của tubulysin
1.5. Tƣơng quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các dẫn
xuất tubulysin
Hình 1.17. Tương quan hoạt tính - cấu trúc của các tubulysin
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ
THỰC NGHIỆM
2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Phương pháp tổng hợp hữu cơ
2.1.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ
2.1.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Hóa chất và dung môi
2.2.2. Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide
4
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide
2.2.3. Tổng hợp tubuphenylalanine
2.2.4.. Tổng hợp tubuvaline
2.2.5. Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của Tup và Tuv
2.2.6. Tổng hợp dipeptide
2.2.7. Tổng hợp tripeptide
2.2.8. Tổng hợp dẫn xuất tubulysin
2.2.9. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin
2.2.10. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các tetrapeptide.
5
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Định hƣớng tổng hợp các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin
Sơ đồ 3.1. Định hướng tổng hợp các dẫn xuất và chất tương tự
tubulysin
3.2. Tổng hợp tubuphenylalanine
Phản ứng tổng hơp tubuphenylalanine acid (Tup) 47a được bắt
đầu từ L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (68), thông qua quy
trình 7 bước phản ứng như được mô tả trong sơ đồ 3.2. Đầu tiên, nhóm
amino của chất 68 được bảo vệ bằng nhóm tert-butoxycarbonyl qua
phản ứng với Boc2O trong dung môi THF và NaHCO3 ở nhiệt độ phòng
trong 16 h thu được sản phẩm 45 (94%). Sự chuyển hóa ester 45 thành
aldehyde 52 được tiến hành qua hai bước phản ứng liên tục, bằng phản
ứng khử hóa với NaBH4 trong dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng trong
6
thời gian 20h thu được hợp chất trung gian N-Boc-phenylalaninol (45a)
mà không cần tinh chế qua cột sắc ký silica gel, với hiệu suất 96%.
Sơ đồ 3.2. Phản ứng tổng hợp Tup 47a
Sự chuyển hóa nhóm hydroxyl về aldehyde được tiến hành với
tác nhân oxy hóa DMP (Dess Martin Periodinane) dưới điều kiện hồi
lưu trong các dung môi DCM, EtOAc hoặc dung môi DMSO ở nhiệt độ
phòng. Tuy nhiên, quá trình oxy hóa với tác nhân DMP đều không có sự
chuyển hóa hoàn toàn thành aldehyde. Sản phẩm thu được đạt hiệu suất
khoảng 74%. Bằng cách sử dụng tác nhân oxi hóa IBX
(2-iodoxybenzoic acid) trong dung môi DCM hoặc EtOAc dưới điều
kiện đun hồi lưu, sản phẩm aldehyde 52 đã thu được hiệu suất cao hơn.
Kết quả cho thấy phản ứng sử dụng IBX và đun hồi lưu trong EtOAc
cho hiệu suất cao nhất (94%) và sản phẩm có thể dùng trực tiếp cho
phản ứng bước tiếp theo mà không cần tinh chế qua cột sắc ký silica gel.
Từ sản phẩm aldehyde 52, alkene 42 dễ dàng thu được qua phản
ứng ngưng tụ theo Horner-Wadsworth-Emmons giữa hợp chất 52 với
triethyl-2-phosphonopropionate và NaH ở nhiệt độ từ 0-25 oC trong thời
gian 14h (0 oC 5 phút, nhiệt độ thường 14h). Phản ứng tạo sản phẩm
alkene 42 (75%) với cầu hình E ưu tiên (tỷ lệ E/Z 75/25). Cấu hình E
7
của sản phẩm 42 được xác định dựa trên phân tích dữ liệu của phổ 1H-,
13
C-NMR và phổ hai chiều NOESY, kết hợp so sánh với các phổ của
chất đã được công bố.
Sản phẩm 42 được chuyển thành acid 69 và gắn mạch ester với
menthol qua phản ứng Steglich giữa 69 và menthol, sau đó hydro hóa
sản phẩm tạo thành nhận được các đồng phân lập thể không đối quang
với tỷ lệ 47a/47b = 4,5/1, có thể tách được sản phẩm mong muốn 47a
bằng phương pháp sắc ký cột thông thường .
Cấu trúc của hợp chất 47a được khẳng định thông qua phân tích
các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR, kết hợp so sánh phổ đã
được công bố.
3.3. Tổng hợp tubuvaline
3.3.1. Tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)
methyl)thiazole (14)
Để tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)
thiazole (14) chúng tôi lựa chọn thiourea làm tác nhân ban đầu theo
phản ứng Hantzsch. Phản ứng được tiến hành giữa thiourea với ethyl
bromopyruvate dưới điều kiện hồi lưu 4 h trong dung môi ethanol thu
được hợp chất thiazole 70 ở dạng tinh thể sau khi sử lý phản ứng, với
hiệu suất 75% (Sơ đồ 3.6). Sự chuyển hóa nhóm amine của chất 70
thành 2-bromothiazole 71 thông qua phản ứng Sandmeyer bằng cách xử
lý với các tác nhân NaNO2, CuSO4 và KBr trong môi trường 30%
H2SO4 ở 0 oC trong 1 h; sau đó được đưa về nhiệt độ phòng và khuấy
thêm 15h, xử lý thu được sản phẩm 71 với hiệu suất 65%.
Ester 71 được khử hóa thành hợp chất hydroxyl bằng phản ứng
với NaBH4 trong MeOH hoặc NaBH4 và CaCl2 trong hỗn hợp dung môi
EtOH/THF (với tỷ lệ 2/1) 16h ở nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy, sử
dụng tác nhân NaBH4 trong hỗn hợp dung môi EtOH/THF và CaCl 2 cho
sản phẩm (2-bromothiazol-4-yl)methanol (72) đạt hiệu suất cao nhất
(95%).
8
Sơ đồ 3.6. Tổng hợp dẫn xuất thiazole 14.
Từ sản phẩm 72 thu được, sự bảo vệ của nhóm hydroxyl với
TBSCl với xúc tác imidazole/DMAP trong dung môi DCM ở nhiệt độ
phòng nhận đươc sản phẩm 14 với hiệu suất 97%.
3.3.2. Tổng hợp N-methyltubuvaline-OMe (79)
Quy trình tổng hợp Tuv-OMe 79 được thực hiện qua 10 bước
phản ứng, sử dụng L-valine amino acid làm nguyên liệu đầu, như trình
bày trong sơ đồ 3.14. Chất tert-butoxycarbonyl-L-valine được tăng
mạch thêm 1 nhóm methylene qua phản ứng Arndt-Eistert. Hợp chất NBoc-Val-OH trước hết được xử lý với ethyl chloroformate ở 0 oC trong
1h, sau đó sử lý với diazomethane trong ether. Sản phẩm diazoketone 21
tạo thành được phản ứng với với N,O-dimethylhydroxylamine với xúc
tác C6H5COOAg trong dung môi THF thu được sản phẩm chính
Weinreb amide 22a, với tổng hiệu suất đạt 54 %. Phản ứng N-methyl
hóa của chất 22a được xử lý với NaH và MeI trong 24 h nhận được 73
với hiệu suất 95% . Phản ứng gắn mạch carbon-carbon giữa Weinreb
amide 73 và dẫn xuất thiazole 14 tạo thành sản phẩm 74 là phản ứng
quan trọng nhất trong quy trình tổng hợp dẫn xuất tubuvaline. Phản ứng
được tiến hành dưới các điều kiện yêu cầu nghiêm ngặt về nhiệt độ cũng
như độ khan, dưới tác dụng của tác nhân nBuLi.
9
Sơ đồ 3.14: Phản ứng tổng hợp hợp chất 79
Hợp chất thiazole 14 trước hết được xử lý với nBuLi ở -78 oC
trong 1h, sau đó Weinreb amide 73 được thêm vào. Phản ứng được
khuấy ở -78 oC thêm 1h sau đó khuấy ở nhiệt độ phòng 12h. Ketone 74
thu được ở dạng chất lỏng màu vàng nhạt đạt hiệu suất 55%. Sản phẩm
74 được xác định qua phân tích phổ 1H- và 13C-NMR.
Phản ứng khử hóa ketone 74 thành hợp chất hydroxyl 15a được
khảo sát với các tác nhân khử khác nhau như: sử dụng NaBH4 trong hỗn
hợp dung môi MeOH/THF; tác nhân LiAlH4 trong THF hoặc tác nhân
khử chọn lọc BH3.Me2S/CBS. Kết quả cho thấy, sử dụng sử dụng 1 eq
BH3.Me2S và 10% mol xúc tác CBS trong dung môi THF thu được chất
15a với độ chọn lọc lập thể lên đến 85% và hiệu suất chuyển hóa đạt
90%. Hợp chất alcohol 15a được bảo vệ với nhóm acetyl bằng phản ứng
với acetic anhydride trong TEA và xúc tác DMAP ở nhiệt độ phòng sau
14 h thu được sản phẩm 75 với hiệu suất đạt 97%.
10
Các dung môi dùng cho phản ứng acetyl hóa như dichlomethan,
acetonitrile hay tetrahydrofuran được sử dụng. Kết quả cho thấy, phản
ứng với dung môi DCM sản phẩm 75 thu được sạch, không cần tinh chế
trên cột sắc ký silica gel và được sử dụng để thực hiện phản ứng tiếp
theo. Từ hợp chất 75, nhóm bảo vệ tert-butyl-dimethylsilan (TBS) được
loại bỏ bằng phản ứng với tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF)
trong dung môi dichloromethane tạo thành hydroxyl 76. Tiếp theo, hợp
chất 76 được chuyển hóa thành aldehyde trung gian bằng phản ứng đun
hồi lưu với tác nhân Dess-Martin (IBX) trong dung môi ethylacetate.
Acid 78 thu được bằng phản ứng với các tác nhân oxi hóa khác nhau.
Dưới các điều kiện của phản ứng Pinnick, sử dụng các tác nhân
NaOCl2/NaH2PO4 trong dung môi DCM đã thu được sản phẩm đạt hiệu
suất thấp và phải tinh chế sản phẩm trên cột sắc ký silica gel. Bằng cách
thay đổi các điều kiện của phản ứng oxi hóa sử dụng tác nhân oxone
trong dung môi DMF ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 12h.
Sản phẩm acid 78 thu được đạt hiệu suất 95% mà không cần tinh chế
trên cột silica gel. Hợp chất 78 được xử lý với diazomethane trong dung
môi diethylete ở 0 oC trong thời gian 3h và giữ thêm ở nhiệt độ phòng
12 h thu được methyl ester 79 với hiệu suất 96%.
Cấu trúc của các sản phẩm trung gian, các ɤ- amino acid được
khẳng định thông qua phân tích các phổ 1H-, 13C-NMR.
3.4. Loại bỏ nhóm bảo vệ boc của tuv và tup
Các sản phẩm 79, 47a, 42 được xử lý với lượng dư TFA trong
dung môi DCM với sự có mặt của triisopropylsilane (TIPS) và nước
theo tỷ lệ thể tích TFA/TIPS/H2O = 95/2,5/2,5 (Sơ đồ: 3.15). Phản ứng
được thực hiện ở 0 oC trong 2h, nhận được các muối trifluoroacetic 80,
81, 82 với hiệu suất cao (95%).
11
Sơ đồ 3.15. Phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của 42, 47a, 79
Công thức các muối 80, 81, 82 được khẳng định bằng các
phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- và 13C-NMR.
3.5. Tổng hơp dipeptide
Dipeptide 84 được tổng hợp từ muối 80 với một đương lượng
chất
Boc-Ile-OH
trong
dung
môi
DMF
có
mặt
bazơ
diisopropylethylamin và tác nhân ghép mạch amide HATU (1.2 eq).
Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h (Sơ đồ 3.17).
Sản phẩm 84 được khẳng định qua phân tích phổ cộng hưởng từ
hạt nhân 1H và 13C-NMR. Ester 84 tạo thành được loại bỏ nhóm methyl
thu được acid 85 bằng phản ứng với LiOH 5% trong hỗn hợp dung môi
THF/H2O (2/1) ở nhiệt độ phòng trong 12h. Trong quá trình này nhóm
bảo vệ acetyl cũng dễ dàng bị thủy phân và sản phẩm 85 thu được với
hiệu suất 90%. Sản phẩm 85 được khẳng định qua phổ cộng hưởng từ
hạt nhân 1H và 13C. Phổ 1H-NMR chất 85 có các tín hiệu cộng hưởng
tương tự phổ chất 84, ngoài ra phổ chất 85 đã mất tín hiệu singlet cộng
hưởng tại tại 3,73 ppm là tín hiệu đặc trưng của ba proton methoxy
(OMe-3H), và mất tín hiệu singlet tại 2,19 ppm tín hiệu đặc trưng
proton nhóm acetyl (OAc, 3H).
Để tránh tạo thành sản phẩm phụ cho các phản ứng tiếp theo,
nhóm hydroxyl trong sản phẩm 85 được acetyl hóa với acetic anhydride
nhận được sản phẩm acetyl hóa 86.
12
Sơ đồ 3.17: Quy trình tổng hợp dipeptide 84, 85, 86
3.6. Tổng hợp tripeptide
3.6.1. Tổng hợp tripeptide 88
Dipeptide 84 được loại bỏ nhóm bảo vệ bằng phản bằng TFA
trong sự có mặt của TIPS/H2O thu được muối trifluoroacetic. Phản ứng
giữa muối trifluoroacetic với N-methylpipecolinic acid (Mep) trong
dung môi DMF, dưới tác dụng tác nhân ghép nối HATU (1.2 eq) và
DIPEA (10 eq) ở nhiệt độ phòng trong 14h (Sơ đồ 3.18) thu được sản
phẩm 88 với hiệu suất đạt 55% sau khi tinh chế trên cột silica gel.
Sơ đồ 3.18: Phản ứng tổng hợp tripeptide 88
Sản phẩm 88 được khẳng định nhờ các phương pháp phổ cộng
hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR.
3.6.2. Tổng hợp tripeptide 89
Hợp chất 89 được tổng hợp bằng phản ứng acyl hóa giữa
dipeptide 86 với hợp chất 82 (1 eq) trong dung môi DMF, dưới tác dụng
của tác nhân HATU (1.2 eq) và DIPEA (10 eq) (Sơ đồ 3.19). Sau 14 h
13
khuấy ở nhiệt độ phòng, sản phẩm sạch thu được bằng cách tinh chế
trên cột sắc ký silica gel nhận được chất 89 với hiệu suất 60%.
Trên phổ 1H-NMR chất 89 ở vùng trường thấp thể hiện tín hiệu
cộng hưởng đặc trưng của proton vòng thiazole ở 8,05 ppm singlet (1H,
H-9), các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của proton vòng phenyl ở 7,29
-7,21 ppm (5H). Tín hiệu doublet đặc trưng của proton E-olefin (H-4)
cộng hưởng tại 6,67 ppm (J = 9 Hz). Tín hiệu singlet của CH3-N tại
3,01 ppm (3H). Tín hiệu singlet cộng hưởng tại 2,16 ppm của 3 proton
nhóm acetyl (OAc). Tín hiệu singlet tại 1,41 ppm cuản nhóm Boc (9H)
Sơ đồ 3.19: Phản ứng tổng hợp tripeptide 89
3.6.3. Tổng hợp tripeptide 90, 90b
Để tổng hợp các dẫn xuất mà sự thay thế của nhóm Mep ở đầu
N của tetrapeptide bằng các acid khác, các tripeptide 90 và 90b được
tổng hợp từ phản ứng ngưng tụ giữa các hợp chất 85/86 với hợp chất 81
trong dung môi DMF, dưới tác dụng của HATU và DIPEA ở nhiệt độ
phòng trong 14 h (Sơ đồ 3.20). Sản phẩm tripeptide 90, 90b thu được
với hiệu suất phản ứng đạt 60-65%.
Sản phẩm 90, 90b được khẳng định qua phân tích các phổ cộng
hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR.
14
Sơ đồ 4.20: Phản ứng tổng hợp tripeptide 90, 90b
3.6.4. Tổng hợp các tripeptide 91, 92
Tương tự, từ dipeptide 85 và 86 các tripeptide 91 và 92 đã được
tổng hợp bằng phản ứng với phenylalanine methyl ester hydrochloride
trong dung môi DMF, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 14h (Sơ đồ
3.21). Các sản phẩm được tinh chế trên cột sắc ký silica gel (nHexan/EtOAc; 1/1) thu được sản phẩm sạch tương ứng 91 và 92 với
hiệu suất 55- 60%.
Sơ đồ 3.21: Phản ứng tổng hợp các tripeptide 91, 92
Các sản phẩm 91, 92 được khẳng định nhờ các phương pháp
phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR.
3.7. Tổng hợp dẫn xuất tubulysin
N-Methyltubulysin U (95) được tổng hợp qua 4 phản ứng (Sơ đồ 3.22).
Tripeptide 90b, 90 được loại bỏ nhóm bảo vệ Boc trong TFA tiếp sau là
phản ứng amide hóa với N-methylpipecolinic acid trong dung môi DMF
và HATU có mặt DIPEA thu được các tetrapeptide 93 và 93a. Sản
phẩm ester 93 sau đó được thủy phân nhóm menthyl để tạo ra các dẫn
xuất tubulysin. Để có cơ sở cho phản ứng thủy phân các dẫn xuất ester
chứa nhóm menthyl, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện phản
ứng thủy phân trên dẫn xuất 93, với tác nhân LiOH và KOH trong hỗn
hợp dung môi THF/H2O. Kết quả cho thấy nhóm menthyl chỉ bị thủy
phân dưới tác dụng của bazơ mạnh KOH ở nhiệt độ 45-50 oC trong thời
gian từ 48 giờ, sản phẩm 94 (N-Methyltubulysin V) thu được với hiệu
suất 92 %. Cấu trúc của 94 được xác định dựa trên phân tích phổ
HRMS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh với phổ các chất đã
được công bố [11,48]. Tetrapeptide 94 tiếp tục được acetyl hóa nhóm
15
OH tự do bằng phản ứng với acetic anhydride trong DCM, TEA và 1%
mol DMAP thu được sản phẩm N-Methyltubulysin U (95) với hiệu suất
phản ứng đạt 90%.
Phổ khối lượng HRMS-ESI chất 95 xuất hiện ion giả phân tử
m/z = 728.4051 [M+H]+, (Tính cho C38H58N5O7S: 728.4057), kết quả
này phù hợp với CTPT C38H57N5O7S.
Sơ đồ 3.22: Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất 93a,93,94,95
Trên phổ 1H-NMR chất 95 thể hiện đầy đủ các tín hiệu của
các proton tương ứng. Ở vùng trường thấp tín hiệu proton của vòng
thiazole cộng hưởng singlet tại 8,10 ppm (H-9), các tín hiệu proton
của vòng phenyl ở 7,26-7,17 ppm (5H). Tín hiệu cộng hưởng
doubtlet-doublet tại 5,73-5,70 ppm đặc trưng của proton H-11 liên
kết OAc. Tín hiệu singlet của proton nhóm CH3-N trên Tuv tại 3,10
ppm (H-17), và CH3-N trên vòng pipecolinic (H-6’) tại 2,40 ppm.
Ngoài ra, tín hiệu singlet đặc trưng của nhóm CH3-acetyl tại 2,15
ppm. Phổ 1H-NMR chất 95 có các tín hiệu tương đồng với phổ các
chất đã được công bố trước đó [11,48,49].
3.8. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin
3.8.1. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế isoleucine bằng
leucine.
16
Phản ứng được thực hiện từ tripeptide 87 qua phản ứng loại bỏ
nhóm bảo vệ Boc trong TFA và hai phản ứng ghép nối liên tiếp với Nmethylpipecolinic và muối trifluoroacetic 81, sản phẩm ester tạo thành
được acetyl hóa nhóm OH tự do thu được 96 với hiệu suất chung đạt
45%. Sản phẩm 96 được xác định qua phân tích phổ ESI-MS, 1H, 13CNMR
Sơ đồ 3.24: Phản ứng tổng hợp hợp chất 96
3.8.2. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở
đầu N-terminal.
Các hợp chất 97, 98 được tổng hợp từ tripeptide 90 qua 4 phản ứng liên
tiếp (Sơ đồ 3.25). Các phản ứng được thực hiện tương tự như tổng hợp
N-Methyltubulysin U (95). Các sản phẩm 97, 98 được khẳng định thông
qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-, 13C-NMR.
17
Sơ đồ 3.25: Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất 97, 98
Phổ 1H-NMR chất 97, 98 có các tín hiệu cộng hưởng tương tự
phổ chất 95 (N-Methyltubulysin U), ngoài ra trên phổ chất 97, 98 xuất
hiện thêm các tín hiệu proton của các dị vòng picolinic hoặc
isoquinoline ở vùng trường thấp, đồng thời mất đi tín hiệu đặc trưng của
3 proton nhóm methyl liên kết nitơ ở 2,21 ppm và các tín hiệu của
proton methylene no của vòng pipecolinic ở 1,2-1,7 ppm.
Các hợp chất 99, 100, 101 là ester của menthol tạo thành trong
phản ứng ghép mạch tripeptide 90 hoặc 90b với 5-methylpyrazine-1carboxylic và N- allylpipecolinic acid (Sơ đồ 3.26, 3.27).
Sơ đồ 3.26. Phản ứng tổng hợp hợp chất 99
Sơ đồ 3.27. Phản ứng tổng hợp hợp chất 100, 101
Cấu trúc của 99, 100, 101 được khẳng định dựa vào phân tích
phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR chất 100
thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của các proton dị
vòng thơm, proton vòng thiazole và nhóm phenyl. Các tín hiệu cộng
hưởng trong vùng trường thấp gồm: tín hiệu proton của vòng pyrazine
tại 9,11 ppm (singlet) được quy cho proton H-4’, tín hiệu proton H-2’
singlet tại 8,59 ppm. Tín hiệu proton của vòng thiazole cộng hưởng tại
8,10 ppm (H-9). Các tín hiệu proton của vòng phenyl cộng hưởng tại
7,27-7,18 ppm.
18
- Xem thêm -