Tài liệu Tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol hướng tác dụng chống ung thư.

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • • NGUYỄN THỊ PHƯỢNG TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT BENZIMIDẨZOL HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ • • Người hướng dẫn • : 1. ThS. Nguyễn Thị Thanh Hòa 2. HVCH. Vũ An Phượng Nơi thực hiện : Bộ môn Công nghiệp Dược Trườngơ Đai hoc Dươc Hà Nôi • • • • HÀ NỘI-2011 LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xỉn bày tỏ lòng kỉnh trọng và biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hướng dẫn, cho tôi những lời khuyên quí báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi ừ-ong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xỉn chân thành cảm ơn cô ThS. Lê Thị Thu Hòa và DS. HVCH. Vũ An Phượng, đã định hướng cho tôi trong quá trình tìm tài liệu cũng như hoàn thành khóa luận. Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Công Nghiệp Dược, đặc biệt là DS. Nguyễn Văn Giang và thầy Phan Tiến Thành, tổ môn Tổng hợp Hóa dược, đã nhiệt tĩnh giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhât để tói hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ Phòng Phân tích phô và Thử tác dụng sinh học- Viện Hóa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tôi xỉn chân thành cảm ơn! Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến bổ mẹ và bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sổng và học tập! Hà Nội, Ngày 10 tháng 5 năm 2011. Sinh viên Nguyễn Thị Phượng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1 • Chương 1. TỎNG QUAN.............................................................................. 2 1.1. Bệnh ung thư..........................................................................................2 1 .1.1. IChái niệm bệnh ung thư ................................................................. 2 1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh ung thư......................................................2 1.1.3. Hóa chất điều trị ung thư................................................................ 3 1.1.4. Phối họp hóa chất trong điều trị ung thư........................................ 5 1.2. Một số dẫn chất benzimidazol có tác dụng chống ung thư.................... 5 1.2.1. 2-methyl-5-nitrobenzimidazol và dẫn chất thế ở vịtrí N-1 của nó.5 1.2.2. Dần chất benzimidazol mang nhóm thế ở vị tríC-2và C -5.............7 1.2.3. Dan chất acid benzimidazol-5-carboxylic.................................... 10 1.3. Phưoíng pháp tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol........................13 1.3.1. Phương pháp tổng họp dẫn chất benzimidazol có nhóm thế ở vị trí C-2 13 1.3.2. Phương pháp tổng hợp dẫn chất 5-nitrobenzimidazol mang nhóm thế ở vị trí C-2.........................................................................................16 1.3.3. Phương pháp tổng hợp dẫn chất benzimidazol mang nhóm thế ở vị tríC -2 v à N -l..........................................................................................17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu............. 18 2.1. Nguyên vật liệu, thiết b ị......................................................................18 2.1.1. Hóa chất nghiên cứu..................................................................... 18 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu.................................................... 19 2.2. Nội dung nghiên cứu...........................................................................20 2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................20 2.3.1. Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết................................ 20 2.3.2. Xác định cấu trúc...........................................................................21 2.3.3. Thử tác dụng chống ung thư..........................................................22 Chương 3. THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.......................23 3.1. Thực nghiệm và kết quả.......................................................................23 3.1.1. Tổng hợp lH-benzimidazol( I)......................................................23 3.1.2. Tổng hợp 5-nitro-lH-benzimidazol (II)........................................26 3.1.3. Tổng hợp ethyl (IH-benzimidazol-l-yl)acetat (III)......................28 3.1.4. Xác định cấu trúc của các họp chất tổng hợp được...................... 31 3.1.5. Thử tác dụng chống ung thư của các họp chất tổng hợp được (thử độ độc tế bào)..........................................................................................33 3.2. Bàn luận................................................................................................35 3.2.1. Giai đoạn tổng hợp lH-benzimidazol......................................... 35 3.2.2. Giai đoạn tổng hợp 5-nitrobenzimidazol.......................................37 3.2.3. Giai đoạn tổng hợp Ethyl (IH-benzimidazol-l-yl)acetat..............37 3.2.4. về phổ hồng ngoại:.......................................................................37 3.2.5. về phổ cộng hưỏng từ hạt nhân proton *H....................................38 3.2.6. về tác dụng sinh học.....................................................................38 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DMSO Dimethyl sulfoxide EtOH Ethanol H Giờ H Hiệu suất *H-NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) IC 50 50% Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế 50%) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) MeOD Methanol MeOH Methanol SKLM Sắc ký lóp mỏng Nhiệt độ nóng chảy DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1: Kết quả ức chế sự phát triển của các họp chất 18-26, 12 Etoposide, Doxorobucin, SN-38 và Cisplatin trên 21 dòng tế bào ung thư người Bảng 2: Khảo sát tỉ lệ mol acid formic ; 0 -phenylendiamin dùng 24 trong phản ứng Bảng 3 : Khảo sát thời gian phản ứng 25 Bảng 4: số liệu phân tích phổ hồng ngoại của họp chất I 30 Bảng 5; số liệu phân tích phổ hồng ngoại của hợp chất II 30 Bảng 6 : số liệu phân tích phổ hồng ngoại của hợp chất III 30 Bảng 7: Kết quả phân tích phổ 'H-NMR của benzimidazol (I) 31 Bảng 8: Kết quả phân tích phổ ’H-NMR của ethyl (IH- 31 benzimidazol-l-yl)acetat (III) Bảng 9: Kết quả thử hoạt tính độc tế bào 33 DANH MỤC CÁC sơ ĐÒ Trang Sơ đồ 1: Sơ đồ tổng hợp chất 1 và 5 10 Sơ đồ 2: Sơ đồ tổng họp một số dẫn chất benzimidazol thực 11 nghiệm ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là một trong những bệnh được quan tâm ở hầu hết các nước trên thế giới trong những năm qua. Hiện nay, ung thư được xếp vào nhóm những bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất. Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới, mỗi năm trên thế giới có khoảng 11 triệu trường họp mới mắc ung thư và khoảng 7 triệu người chết vì căn bệnh này. Tỉ lệ chết do ung thư lên tới 100/100.000 dân ở các nước úc, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, và Singapore. Tại Việt Nam, theo thống kê của Nguyễn Bá Đức, tính đến năm 2005, trung bình mỗi nám có khoảng 150.000 người mắc ung thư và khoảng 1 0 0 .0 0 0 người tử vong [5, 8 , 10]. Do đó vấn đề cấp bách hiện nay là tìm ra thuốc đặc trị căn bệnh này. Việc nghiên cứu tổng họp hóa chất điều trị ung thư bắt đầu từ năm 1943 khi meclorethamin cứu được hơn nửa số bệnh nhân ung thư máu, sau đó ngành hóa trị liệu ra đời và trở thành vũ khí quan trọng khi phối hợp với phẫu thuật để điều trị ung thư [9]. Hiện nay, hóa chất chữa ung thư được nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ theo xu hướng tăng cường tác dụng chống ung thư và hạn chế tác dụng không mong muốn của thuốc. Trong số đó phải kể đến một số dẫn chất benzimidazol. Do đó, đề tài “Tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol hướng tác dụng chống ung thu*’ được tiến hành với các mục tiêu như sau: 1. Tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol. 2. Thử khả năng gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được. Chương 1. TỎNG QUAN 1.1. Bệnh ung thư 1.1.1. Khái niệm bệnh ung thư Ung thư là tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh với trên 200 loại khác nhau về nguồn gốc của tế bào, căn nguyên, tiên lượng và cách thức điều trị nhưng có những đặc điểm chung là sự phân chia không kiểm soát được của tế bào cũng như khả năng tồn tại và phát triển của chúng ở các cơ quan trong cơ thể. Có thể định nghĩa ung thư là bệnh lý ác tính của tế bào; khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh ung thư, tế bào tăng sinh một cách vô hạn độ, vô tổ chức, không tuân theo các cơ chế kiểm soát về phát triển cơ thể [6 , 7, 23, 27]. Bệnh ung thư được phát hiện bởi Hypocrates (một nhà y học Hy Lạp thời cổ đại) từ rất sớm với tên gọi “karkinos” (có nghĩa là con cua theo tiếng Hy Lạp). Ngày nay, ung thư được cả thế giới biết đến với từ “cancer” theo tiếng Anh và cũng có nghĩa là con cua trong tiếng Latinh [18]. 1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh ung thư Các nguyên nhân gây bệnh ung thư có thế chia làm hai nhóm chính là các nguyên nhân bên ngoài và các nguyên nhân bên trong cơ thể [3, 12, 25-4]. • Trên 80% nguyên nhân gây bệnh ung thư có nguồn gốc từ môi trường bên ngoài bao gồm: - Tác nhân vật lý là bức xạ ion hóa và bức xạ cực tím. - Tác nhân hóa học là khí đốt, xăng dầu, khí thải các nhà máy công nghiệp, thuốc trừ sâu hay các chất bảo quản thực phẩm, môi trường làm việc được xem là rất nguy hiểm vì tính chất đa dạng và khó phòng tránh. Đặc biệt thuốc lá là nguyên nhân của hơn 30% tổng số trưÒTig hợp ung thư (trong đó có 50% ung thư phổi). - Tác nhân sinh học là virus gây ung thư (đáng chú ý nhất là 3 loại: virus Epstein-Barr, virus viêm gan B và virus HPV), ký sinh trùng và vi trùng (sán Schistosoma và vi khuẩn H. pylori). • Các nguyên nhân bên trong gây bệnh ung thư bao gồm: yếu tố di truyền, yếu tố nội tiết (ví dụ ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến) và yếu tố khác như tuổi, giới, tiền sử bệnh gia đình. 1.1.3. Hóa chất điều trị ung thư Hiện nay, điều trị ung thư tại chỗ sử dụng 2 phương pháp phẫu thuật và xạ trị, còn điều trị ung thư toàn thân, sử dụng các phương pháp điều trị hóa chất, điều trị nội tiết và điều trị sinh học [4]. Việc sử dụng các hóa chất gây độc tế bào một cách hợp lý để tiêu diệt các tế bào ung thư là phương pháp điểu trị cơ bản cho nhiều bệnh ung thư, đồng thời hỗ trợ các phương pháp phẫu thuật, xạ trị, miễn dịch đem lại hiệu quả điều trị cao nhất. Dựa trên mối quan hệ giữa phương thức hoạt động của thuốc và chu kì tế bào, có thể chia hóa chất điều trị ung thư thành 2 nhóm lớn [11,24, 28], a. Thuốc tác động không đặc hiệu lên chu kỳ tế bào Thuốc tác động không đặc hiệu lên chu kỳ tế bào là thuốc tác động lên nhiều pha khác nhau của chu kì tế bào (kể cả pha GO) gồm các phân nhóm: • Các tác nhân alkyl hỏa: bao gồm dẫn xuất nitrogen (cyclophosphamid, ifosfamid, mechlorethamin, melphalan, clorambucil...); dẫn xuất nitroure (carmustin, lomustin, semustin...); dẫn xuất triazen (dacarbazin); dẫn xuất alkyl sulfonat (busulfan); dẫn xuất platin (cisplatin, carboplatin). • Khảng sinh khảng ung thư: chủ yếu được phân lập từ Streptomyces, có khả năng ngăn cản quá trình tổng hợp và phiên mã ADN. Kháng sinh đầu tiên được tìm ra là Actinomycin A. Một số thuốc khác như anthracyclin (Daunorubicin và Doxombicin), dactinomycin, mitomycin-C, ... • Hormon (Dexamethason, và chất đổi kháng Prednisolon), các hormon: estrogen các glucocorticoid (Ethinylestradiol, Diethylstilbestrol), các androgen (Testosteron propionat), các kháng androgen (Flutamide, Finasterid), tamoxifen... • Các tác nhân khác: asparaginase, hydroxyure, procarbazin, mitotan... b. Thuốc tác động đặc hiệu lên chu kì tế bào Thuốc tác động đặc hiệu lên chu kì tế bào là thuốc có tác động chính lên một pha cụ thể và có thể tác động lên các pha khác ở mức độ kém hơn. • Tác nhân chổng chuyển hỏa: thuốc kháng acid folic (Methotrexat); thuốc kháng purin (Mercaptopurin, Thioguanin, Azathioprin); thuốc kháng pyrimidin (5-fluorouracil, Floxuridin,...) • Tác nhân ức chế giảm phân: thuốc chia thành các phân nhóm: vinca alkaloid (Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin...); epipodophyllotoxin (Podophyllotoxin, Etoposid, Teniposid....); taxan và các camptothecin. c. Thuốc thay đổi đáp ứng miễn dịch Một số thuốc trong nhóm này là Interferon, interleukin II... 1.1,4, Phổi hợp hóa chất trong điều trị ung thư Hiện nay việc dùng đơn lẻ các hóa chất điều trị ung thư cho hiệu quả không cao và độc tính lớn, nên xu hướng điều trị ung thư hiện nay là phối họp hóa chất điều trị ung thư để tăng cường hiệu quả điều trị do: - Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư là lớn nhất vẫn nằm trong giới hạn độc tính mà tế bào thưòng chịu đựng được. - Sự phát triển của nhóm tế bào mới kháng thuốc là rất chậm và ít nhất. Tuy nhiên sự phối hợp hóa chất phải dựa trên nguyên tắc: - Dùng phối hợp các thuốc có cơ chế tác dụng khác nhau. - Không phối hợp nhiều thuốc có cùng độc tính trên một cơ quan. - Dùng liều cao, đợt ngắn, ngắt quãng có hiệu quả hơn liều thấp kéo dài. - Không dùng loại thuốc mà bản thân nó ít có hiệu quả khi dùng đơn độc. 1.2. Một số dẫn chất benzimidazol có tác dụng chống ung thư 1.2.1. 2-methyl-5-nỉtrobenzimidazol và dẫn chất thế ở vị tríN-1 của nó Năm 2006, Mostafa M. Ramla và cộng sự đã tổng hợp 2-methyl-5nitrobenzimidazol và một số dẫn chất thế ở vị trí N-1 của nó [22].Đó là các dẫn chất sau; 0,N 0,N NH.NH, 0,N SCH COCH 2 3 0,N Tất cả các họp chất trên đã được thử tác dụng chống ung thư vú (MCF-7) thực hiện tại Viện ưng thư quốc gia, Khoa Ung thư sinh học, Đại học Cairo, và kết quả là trong số các họp chất đó, các họp chất hợp chất lỢCso = 4,52 Ịj,g) và họp chất 5 (IC50 = 8,29 |ig) được nhận thấy là có hoạt tính. Tiến hành tổng hợp 1 và 5 theo sơ đồ sau: 0 ,N SCH COCH 2 ^ 3 /N H 0 ,N H inhl : Sơ đồ tổng hợp hợp chất 1 và 5 1,2.2. Dẩn chất benzitnidazol mang nhóm thế ở vị trỉ C-2 và C-5 Năm 2007, Kristina và cộng sự tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol mang nhóm thế amidino ở vị trí C-5 của vòng benzimidazol, và mang nhân dị vòng như pyridin, N-methyl pyrrol hay imidazol ở vị trí C-2, và đánh giá tác dụng chống ung thư của các họp chất tổng họp được, 8 kết quả cho thấy tất cả các hợp chất này đều cho thấy tính chọn lọc đáng chú ý đối với dòng tế bào ung thư vú MCF-7 [26]. Các dẫn chất đó là: 6-14 Trong đó: Cũng trong năm 2007, A. Selcen Alpan, H. Semih Gunes và Zeki Topcu đã tổng hợp và thử tác dụng ức chế enzym DNA topoisomerase I ở động vật có vú 3 dẫn chất lH-Benzimidazol với 3 nhóm thế khác nhau ở vị trí C-5, cụ thể là các chất 5-cloro-4-(lH-benzimidazol-2-yl)phenol (họp chất 15), 5methyl-4-(lH-benzimidazol-2-yl)phenol (họp chất 16), và 4-(lHbenzimidazol-2-yl)phenol (hợp chất 17) [15]. Trong đó họp chất 16thể hiện tác dụng ức chế tương đối mạnh. 10 15, X = Cl 16, X = CH3 17,X = H Theo nghiên cứu thì hợp chất 16 có khả năng ức chế enzyme topoisomerase. Topoisomerase là một enzyme chức năng tháo xoắn phân tử DNA được tìm thấy trong sinh vật nhân sơ, sinh vật nhân chuẩn, virus và các bào quan, như ti thể và lục lạp. Enzym topoisomerase được chia làm 2 loại là DNA topoisomerase I và DNA topoisomerase II. Loại I tháo dạng siêu xoắn, gắn vào phân tử DNA và cắt 1 trong 2 mạch. Sau khi giải phóng 1 phân tử DNA đã được tháo xoắn, các enzyme này sẽ nối lại chỗ đứt. Còn loại II tháo các nút nảy sinh do các biến đổi cấu trúc của chuỗi xoắn kép bằng cách cắt đứt cả 2 mạch DNA. Do đó, khi thuốc có tác dụng ức chế các enzyme này thì nó trở thành tác nhân chống ung thư. 1.2.3. Dẩn chất acid benzimidazol-5-carboxylic Năm 2010, Shardia A. Galal, Khaled H. Hegab và cộng sự đã tổng họp các dẫn chất của acid 7V-Aminomethyl-l//-5-carboxylic và phối tử 1(5(6)-carboxy-l//-benzimidazol-2-ylmethyl)pyridin clorid. Đồng thời phức hợp benzimidazol của phối tử trên với Cu^"^, Co^^, và cũng đã được tác giả tổng hợp. Và tất cả các họp chất này đã được nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển của 21 dòng tế bào ung thư người [16]. Dưới đây là một số dẫn chất tác giả đưa ra: 11 NH----Ar 18 19-22 Trong đó: 19, Ar = pyrid-4-yl 20, Ar = pyrid-2-yl 21, Ar = thiazol-2-yl 22, Ar = benzimidazol-2-yl 23 Tất cả các hợp chất từ 18-26 đã được kiểm tra là ổn định khi sử dụng trong nghiên cứu tế bào. Kết quả của nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển của 21 dòng tế bào ung thư người ung thư đại tràng, 6 (8 dòng tế bào ung thư phổi, 7 dòng tế bào dòng tế bào ung thư dạ dày) invitro của các họp chất 18- 26 và hợp chất tham khảo được trình bày ở Bảng 1. Nghiên cứu invitro tác dụng ức chế sự phát triển của hợp chất từ 18-23 cho thấy hợp chất 23 là chất có hiệu lực đáng kể với GI50 = 0,095 ụM (GI50 là nồng độ cần thiết để làm giảm sự phát triển những tế bào được xử lý xuống còn một nửa so với sự phát triển của những tế bào không được xử lý). Hợp chất 18 và 22 cho thấy không có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư thử nghiệm với GI50 > 1 0 0 I^M. Mặt khác, các họp chất 19-21 cho thấy tác dụng trung bình. Thực nghiệm cho thấy, acid benzimidazol-5-carboxylic liên kết với muối pyridinum thông qua cầu nối methylen là họp chất có hoạt tính cao. Vì vậy, tác giả tiếp tục tổng hợp phức hợp ion 24-26 của phối tử 23 : 12 24 25 26 Nghiên cứu còn chứng minh các họp chất 23-26 có tác dụng này gấp khoảng 7-13 lần so với hiệu lực của etoposide và yếu hon hiệu lực của doxorubicin và SN-38 (7-Ethyl-lO-hydroxycamptothecin). So sánh với hợp chất 23, hợp chất 24 và 26 cho thấy tác dụng ức chế sự phát triển kém hơn trong khi hợp chất 25 cho thấy tác dụng mạnh hơn (Bảng 1). Đồng thời các họp chất 23-26 cũng được nghiên cứu tác dụng ức chế enzym topoisomerase II. Kết quả cho thấy các hợp chất 23 và 25 có tác dụng ức chế enzym này ở nồng độ thấp hơn 10 lần so với etoposide. 13 Bảng 1: Kết quả ức chế sự phát triển của các hợp chât 18-26, Etoposide, Doxorubicin, SN-38 và Cisplatin trên 21 dòng tế bào ung thư người Hợp chất GI50 18 >100 19 \7ịiM ịiM 20 22 21 47 ịiM 22 >100 23 0,095 24 0,163 |iM 25 0,091 ịiM 26 0,174 |iM Etoposide 1,3 Doxorobucin 0,065 ịiM SN-38 0,066 Cisplatin 3,9 ^iM ^iM J^M 1.3. Phương pháp tổng hợp một số dẫn chất benzỉmidazol 1.3.1. Phương pháp tổng hợp dẫn chẩt benzìntìdazol có nhóm thế ở vị trí C-2 Có nhiều phương pháp tổng họp dẫn chất benzimidazol có nhóm thế ở vị trí C-2. Thông qua các tài liệu thu thập được, đề tài xin giới thiệu một số phương pháp như sau: