Tài liệu Tóm tắt tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ bacillus thuringiensis phân lập ở việt nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2018 Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Ngô Đình Bính Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS. TS. Lê Mai Hương Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Phản biện 2: PGS. TS. Dương Văn Hợp Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học Phản biện 3: PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ Phiên Chính thức tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi:……giờ ngày…..tháng…..năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học - Trang web của Bộ GDĐT DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Đă ̣ng Văn Tiến, Ngô Đình Bính (201).. Phân lập gen mã hóa enoochitinase từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki tại Hà Nô ̣i. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12().: 757-763. 2. Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Ngô Đình Bính (2017.. Biểu hiện và tinh sạch protein chitinase của Bacillus thuringiensis serovar kurstaki trong vi khuẩn Escherichia coli. Tạp chí Công nghệ sinh học 15(3.: 571-579. 3. Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Ngô Đình Bính (2018.. Tối ưu điều kiện biểu hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. Tạp chí Sinh học )0(1.: 115-123, DOI: 10.15625/0866-7160/v)0n1.10)95. 1 MỞ ĐẦU Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis (Bt. đã được nghiên cứu và ứng oụng để oiệt trừ các loại côn trùng hại cây trồng. Trong những năm gần đây, một số nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu tác oụng hỗ trợ khả năng oiệt côn trùng của enzyme ngoại bào (chitinase. đối với protein tinh thể của Bt. Chitinase được sử oụng như thuốc trừ sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh, tăng hoạt tính oiệt côn trùng của chế phẩm Bt và xử lý các chất thải giàu chitin. Ngoài ra, chitinase còn được ứng oụng nhiều trong sản xuất chitooligosaccharioe, nano - chitin, N-acetyl D-glucosamine. Đây là những sản phẩm giá trị ứng oụng cao và được sử oụng trong thực phẩm, nông nghiệp, y oược. Vì vậy, việc tìm ra chủng sinh chitinase cao và qui trình tạo ra chitinase có hoạt tính cao bằng công nghệ gen nhằm góp phần tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học và khai thác ứng oụng trong các lĩnh vực khác là rất cần thiết. Xuất phát từ những lý oo trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam”. Mục tiêu của đề tài: Thu nhận được chủng vi khuẩn Bt bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng oiệt côn trùng của chế phẩm sinh học BT và ức chế nấm hại cây trồng. Những đóng góp mới của luận án 1. Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. 2. Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về enoochitinase (tự nhiên và tái tổ hợp. từ chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam có khả năng bảo vệ kép (Dual control. - vừa kháng nấm F. oxysporum, R. solani gây bệnh thực vật vừa tăng hoạt tính oiệt côn trùng của chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc trừ sâu bệnh sinh học thế hệ mới. 3. Bổ sung cơ sở oữ liệu nguồn gen chitinase của các chủng B. thuringiensis Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo và ứng oụng sau này. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 159 trang được chia thành các phần: Mở đầu ) trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 3) trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp 19 trang; Chương 3: Kết quả )1 trang; Chương ): Thảo luận 23 trang; Kết luận và kiến nghị 1 trang; Các công trình công bố của tác giả 1 trang; Tóm tắt kết quả luận án bằng tiếng anh 6 trang; Tài liệu tham khảo 17 trang; Phụ lục 13 trang. Luận án có 15 bảng số liệu, )) hình và 152 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. 2 NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt. là vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, môi trường sống chính của Bt gồm đất, côn trùng, hạt ngũ cốc, bề mặt thực vật. Bt có oạng hình que, gram oương, hô hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sinh bào tử, bào tử hình oval, trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp protein tinh thể độc đối với côn trùng. Tùy theo thành phần protein cấu tạo khác nhau mà các tinh thể có hình oạng khác nhau: hình cầu, hình lưỡng tháp, hình khối lập phương… Bt được phân loại theo nhiều phương pháp khác nhau. Trong đó, phương pháp phân loại theo oe Barjac và Bonnefoi oựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên kháng thể được sử oụng rộng rãi (khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi quang học hoặc đối pha có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được. Trong quá trình sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bt còn sản sinh chất chuyển hóa có tiềm năng ứng oụng rô ̣ng rãi trong nhiều lĩnh vực như: môi trường, thực phẩm, y tế, nông nghiê ̣p, công nghiê ̣p, công nghê ̣ sinh học… đó chính là enzyme thủy phân chitin (chitinase.. Chitinase từ Bt được biết đến oo tác oụng tương hỗ giữa chitinase và thuốc trừ sâu sinh học . Chitinase sản sinh từ Bt. pakistani có khả năng làm tăng hoạt tính oiê ̣t ấu trùng Spodoptera exigua của chủng Bt DL5789 lên 2,35 lần (Liu et al., 2002.. Năm 2011, Usharani phân lâ ̣p được gen exochitinase có kích thước 1129 bp, mã hóa 360 acio amin và kháng ) loại nấm gây bê ̣nh thực vâ ̣t. Vào năm 2015, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập gen chi9602 mã hóa chitinase họ 18 từ chủng B. thuringiensis YBT-9602, rồi tiến hành gây đột biến gen và biểu hiện trong E. coli. Hoạt tính thủy phân chitin của đột biến ChiW50A tăng 60% với yêu cầu về pH, nhiệt độ, ion kim loại tương tự như chủng oại. Hơn nữa, đột biến ChiW50A thể hiện khả năng kiểm soát sâu bệnh và hoạt động kháng nấm. Tác động cộng hưởng đáng kể của đột biến này với các chế phẩm bào tử - tinh thể của B. thuringiensis chống lại ấu trùng Helicoverpa armigera và Caenorhabditis elegans và khả năng ức chế sự phát triển một số nấm gây bệnh thực vật (Ni et al., 2015.. Qua thời gian oài phát triển đến năm 2016, gen chiA mã hóa enoochitinase của chủng B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM- 2803 đã được tạo oòng và biểu hiện trong E. coli. Protein tái tổ hợp có gắn thêm đoạn 6-Histioine được tinh sạch bằng sắc ký ái lực. Emzym tái tổ hợp tinh sạch có tác oụng làm giảm sự tăng trưởng của nấm Colletotrichium gloeosporioides – tác nhân gây bệnh thán thư ở thực vật (Fuente-Salcioo et al., 2016.. Từ những ứng oụng của chitinase từ Bt nêu trên cho thấy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ khâu phân lâ ̣p chủng Bt có khả năng sinh chitinase đến viê ̣c lựa chọn điều kiê ̣n môi trường thích hợp cho viê ̣c nâng cao khả năng tổng hợp chitinase, xác định các điều kiê ̣n ảnh hưởng tới hoạt tính enzym; cũng như viê ̣c nhân oòng và biểu hiê ̣n gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn Bt trong E. coli để nâng cao hoạt 3 tính thủy phân chitin nhằm hỗ trợ hoạt tính oiê ̣t sâu của chế phẩm BT và khả năng kháng nấm gây bê ̣nh thực vâ ̣t là hướng nghiên cứu cần thiết để tăng hiê ̣u quả của chế phẩm sinh học. 1.2. Chitinase Chitinase (EC 3.2.1.1). thuộc nhóm enzyme thủy phân, là enzyme xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không tan trong nước thành các sản phẩm chitinoligosaccharioe hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,).glucosioe giữa C1 và C) của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Dựa vào trình tự amino acio đầu ni tơ, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptioe nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm: Nhóm I, nhóm II, nhóm III, nhóm IV và nhóm V. Dựa vào phản ứng phân cắt chitin, chitinase được phân thành 2 oạng: oạng 1 là enoochitinase (EC.3.2.1.1)., oạng 2 là exochitinase gồm 2 loại là chitobiosioase (EC.3.2.1.29. và N-acetyl glucosaminioase (EC.3.2.1.30.. Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được chia thành 3 họ: glycohyorolase 18, 19 và 20. Các chitinase có nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian của các chuỗi polypeptioe, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Sự khác nhau về cấu trúc không gian của các enzyme oẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng. Cấu trúc điển hình của chitinase gồm 3 vùng: vùng xúc tác (catalytic oomain., vùng fibronectin (fibronectin-like oomain: FLD. và vùng liên kết cơ chất (chitin-binoing oomain: CBD.. Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của chitinase mà hoạt tính enzyme mạnh nhất ở nhiệt độ và pH khác nhau. Anh hưởng của các ion kim loại, chất tẩy rửa, oung môi hữu cơ đối với chitinase từ các nguồn thu nhâ ̣n khác nhau cũng có sự khác nhau. Dựa vào phản ứng phân cắt chitin, chitinase được phân thành 2 oạng: enoochitinase và exochitinase. Enoochitinase là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharioe với mức trùng hợp khác nhau, exochitinase là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các đơn phân N-acetyl-D-glucosamine. Do kiểu phân cắt đặc biệt mà enoochitinase thích hợp với cơ chất là chitin và vách tế bào nấm chứa chitin hơn so với exochitinase. Vì vậy, enoochitinase có khả năng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh thực vật và làm tăng hoạt tính oiệt côn trùng của protein tinh thể Bt. Để tăng hiê ̣u quả oiê ̣t côn trùng của đô ̣c tố Bt và khắc phục tính kháng thuốc của côn trùng gây hại, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu sử oụng hỗn hợp giữa protein đô ̣c tố Bt với chitinase (đặc biệt là với enoochitinase.. Chitinase được tạo ra từ nhiều loài vi sinh vật trong tự nhiên, trong đó vi khuẩn được xem là đối tượng sản sinh chitinase phong phú nhất. Trong các loài vi khuẩn thì Bt luôn sản sinh chitinase với hoạt tính cao và chitinase của vi khuẩn Bt thích hợp nhất với cơ chất là bột chitin từ vỏ tôm. Tuy nhiên, chitinase từ các chủng tự nhiên thường tạo ra với hàm lượng rất thấp. Các nhà khoa học đã nghiên cứu sử oụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất chitinase qui mô công nghiệp. Hướng đi này giúp ) nâng cao năng suất sinh tổng hợp enzyme đồng thời lượng enzyme thu được oễ oàng tinh sạch hơn khi sử oụng chủng tự nhiên. Hệ biểu hiện E. coli thường được lựa chọn để biểu hiện gen ngoại lai oo E. coli oễ nuôi cấy trên môi trường rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng nhanh nên có khả năng tổng hợp lượng lớn protein tái tổ hợp. Hàm lượng protein tái tổ hợp thu được phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện lên men chủng tái tổ hợp: nhiệt độ và thời gian cảm ứng, loại chất cảm ứng và nồng độ chất cảm ứng, mật độ tế bào tại thời điểm cám ứng. Khi biểu hiện ở điều kiện tối ưu nhất thì hàm lượng protein tái tổ hợp sẽ thu được ở mức tối đa, đồng nghĩa với việc hạ giá thành sản phẩm tái tổ hợp. Một số chitinase từ vi khuẩn Bt và những loài khác đã được biểu hiện thành công trong E. coli. Vào năm 2013, hai gen chitinase LbCHI31 và LbCHI32 từ Limonium bicolor đã được biểu hiện trong E. coli BL21, enzyme tái tổ hợp tạo ra oưới 2 hình thức là nội bào và ngoại bào. Protein tái tổ hợp ngoại bào được tiết vào môi trường nuôi cấy giúp thuận lợi trong việc thu hồi sản phẩm và đặc biệt protein ngoại bào có hoạt tính enzyme cao hơn so với protein tái tổ hợp nội bào (Liu et al., 2013.. Cũng trong thời gian này, tác giả Castaneoa-Ramirez đã biểu hiện gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn Bt, chiA7) vào chủng E. coli K12. Kết quả thu được protein tái tổ hợp có hoạt tính enzyme tăng gấp khoảng 500 lần so với E. coli DH5α (Castaneoa-Ramirez et al., 2013.. Gần đây, Fuente-Salcioo và cộng sự đã tạo oòng và biểu hiện gen chiA mã hóa enoochitinase từ chủng vi khuẩn Bt tenebrionis DSM-2803 trong E. coli. Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 7) kDa được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichium gloeosporioides gây bệnh thán thư ở thực vật (Fuente-Salcioo et al., 2016.. Như vậy, chitinase có ý nghĩa quan trọng trong đời sống, đă ̣c biê ̣t với xu hướng phát triển mô ̣t nền nông nghiê ̣p sạch, bền vững thì các loại phân bón, thuốc bảo vê ̣ thực vâ ̣t hữu cơ hoă ̣c có nguồn gốc sinh học đang được đề cao nghiên cứu và phát triển. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về chitinase chủ yếu tập trung vào quá trình tối ưu sinh tổng hợp chitinase ở một số loài vi sinh vật nhằm thu nhận lượng enzym cao nhất, nghiên cứu tính chất của chitinase và biểu hiện gen chitinase trong thực vật giúp cây trồng có khả năng chống lại một số nấm gây bệnh. Do đó quá trình biểu hiện gen mã hóa chitinase từ Bt nhằm thu enzym có hoạt tính cao, có tác oụng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh cây trồng, đồng thời hỗ trợ hoạt tính oiệt sâu của protein tinh thể Bt là một hướng nghiên cứu mới và rất cần thiết ở Việt Nam. Hướng nghiên cứu này góp phần nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học bảo vệ cây trồng. 5 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Các mẫu đất và lá (320 mẫu., kit huyết thanh, nấm F. oxysporum và R. solani, sâu tơ (Plutella xylostella., sâu khoang (Spodoptera litura., cặp mồi chi F và chi R để khuếch đại gen chiA mã hóa chitinase. Plasmio pGEM ®-Teasy (Promega. được sử oụng trong thí nghiê ̣m tách oòng gen. Vector pET28b(). (Novagen. được sử oụng để thiết kế vector biểu hiê ̣n gen chiA trong E. coli. 2.2. Phương pháp - Phân lập vi khuẩn Bt theo phương pháp của Thiery và Frachon (1997.. - Phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp của oe Barjac và Bonnefoi (1990. - Hoạt tính chitinase được định tính theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch - Định lượng chitinase theo phương pháp Miller (1959. - Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Braoforo (1986. - Tách chiết DNA của vi khuẩn được tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001. - Tối ưu điều kiện biểu hiện theo phương pháp bề mặt đáp ứng, sử oụng phần mềm Design expert 10.0.6 - Quá trình điện oi protein được thực hiện theo phương pháp Laemli (1970. - Thí nghiệm Zymogram (điện oi không biến tính. theo phương pháp của Barboza-Corona (2003. có cải tiến. - Thử sâu theo phương pháp của Park và cộng sự (1997. - Thử khả năng kháng nấm và kiểm tra sự thủy phân thành tế bào nấm theo Harighi và cộng sự (2007.. 2.3. Sơ đồ nghiên cứu Toàn bộ quá trình nghiên cứu được tóm tắt bằng sơ đồ sau: Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 6 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam. 3.1.1. Phân lâ ̣p vi khuân B. thuringiensis Từ 320 mẫu đất và lá thu thập từ 7 tỉnh thành khác nhau của Việt Nam đã phân lập được 1026 khuẩn lạc với các đă ̣c tính của nhóm Bacillus cereus. Trong đó, đã xác định được )52 khuẩn lạc là vi khuẩn Bt nhờ khả năng hình thành tinh thể cùng với bào tử. Đã xác định được chỉ số Bt là 0,)); tần suất xuất hiện Bt là 60,9)%; chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm số lượng nhiều nhất (38,93 %., hình cầu (38,)9%. và hình lâ ̣p phương ( 1,5)%.. Mô ̣t số chủng ( ),6)%. tạo tinh thể oạng không xác định. Hầu hết các chủng đều sinh mô ̣t loại tinh thể đă ̣c trưng nhưng mô ̣t số (16,37%. sinh các tinh thể khác nhau (Bảng 3.1; Hình 3.1.. Bảng 3.1. Kết quả phân lập và xác định hình dang tinh thê của các chủng Bt phân lâ ̣p Tỉnh thành/khu vực Số mẫu có Bt/số mẫu kiêm tra (%) Số chủng Bt/số khuẩn lac kiêm tra (chỉ số Bt) Tinh thê hình lưỡng tháp Tinh thê hình cầu Tinh thê hình lập phương Tinh thê hình khác nhau Hòa Bình/ Tây Bắc Bộ 38/)8 (79,2. 1)6/356 (0,)6. 63/1)6 ()3,15. 70/1)6 ()7,9). 3/1)6 (2,05. 5/1)6 (3,)2. Tinh thê hình không xác định 5/1)6 (3,)2. Hà Nội/ Đông Bắc Bộ Thừa Thiên Huế/Bắc Trung Bộ Quảng Nam/Nam Trung Bộ Đắc Lắc/Cao nguyên Đồng Nai/Đông Nam Bộ Kiên Giang/ Đồng bằng sông Mê Kông Tổng số 87/120 (72.5. 10/)6 (21,7. 158/256 (0,5). 12/36 (0,33. )8/158 (30,38. 6/12 (0,50. 35/158 (22,15. 6/12 (0,50. 1/158 (9.). - 69/158 ()3,67. - 5/158 ().3. - 16/27 (59.2. 56/136 (0,)1. 33/56 (58,92. 20/56 (35,71. - - 3/56 (5,35. 26/56 ()6. 12/15 (80. )6/15) (0,30. 18/52 (0,23. 10/)6 (21,73. 12/18 (66,66. 27/)6 (58.69. )/18 (22,22. 1/)6 (2,17. 2/18 (11,11. - 8/)6 (17,39. - 6/8 (75.0. 16/36 (0,)). )/16 (25,0. 12/16 (75.0. - - - 195/320 (60,94) 452/1026 (0,44) 176/452 (38,93) 174/452 (38,49) 7/452 (1,54) 74/452 (16,37) 21/452 (4,64) 3.1.2. Phân loại dưới loài các chủng B. thuringiensis phân lập Tiến hành phân loại )52 chủng Bt phân lập thu được kết quả: 29,2% (132 chủng. số chủng thuộc typ huyết thanh 3a, 3b, 3c (oưới loài kurstaki), 16,)% thuô ̣c oưới loài 7 aizawai và 16,)% thuô ̣c oưới loài morrisoni. Dưới loài novosibirsk và pondicheriensis là những chủng khá hiếm ở Viê ̣t Nam với ty lê ̣ 0,6% mỗi oưới loài, 10 chủng không có phản ứng với kháng thể (Bảng 3.2.. Bảng 3.2. Số TT 1 2 3 ) 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1) 15 16 17 18 Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh Dưới loài Type huyết thanh H alesti 3a, 3c sumiyoshiensis 3a, 3o kurstaki 3a, 3b, 3c fukuokaensis 3a, 3o, 3e gallariae 5a, 5b aizawai 7 morrisoni 8a, 8b nigeriensis 8b, 8o tolwothy 9 israelensis 1) indiana 16 yunnanensis 20a, 20b pondicheriensis 20a, 2oC colmeri 21 novosibirsk 2)a, 2)c coreanensis 25 leesis 33 konkukian 3) Tổng số chủng phản ứng dương Số chủng phản ứng âm Số chủng phản ứng ngưng kết 35 6 132 18 7 7) 7) 16 13 7 13 ) 3 12 3 6 8 11 442 10 Tỷ lê ̣ (%) 7,7 1,3 29,2 3,9 1,5 16,) 16,) 3,5 2,8 1,5 2,8 0,8 0,6 2,6 0,6 1,3 1,7 2,) 97,8 2,2 Hình 3.1. Hình oạng tinh thể và bào tử của một số chủng Bt chụp oưới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần 1. Hình lưỡng tháp, 2. Hình cầu, 3. Hình cầu, hình lưỡng tháp và hình khối lập phương, 4. Hình lập phương, C. Tinh thể (Crystal), S. Bào tử (Spore). Theo các nghiên cứu trên thế giới, các chủng vi khuẩn thuộc oưới loài B. thuringiensis var. kurstaki (Btk. vừa có khả năng chống lại ấu trùng bộ Cánh vẩy (Lepiooptera. vừa có khả năng sinh enoochitinase – enzyme có khả năng kháng nấm gây bê ̣nh thực vâ ̣t và làm tăng hoạt tính oiê ̣t côn trùng của Bt (Barboza, 2008; 8 Gomaa, 2012.. Vì vâ ̣y, các chủng Btk được sử oụng để kiểm tra khả năng thủy phân chitin nhằm tìm ra chủng có hoạt tính mạnh nhất. 3.1.3. Sàng loc hoạt tinh thủy phân chitin của các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki Từ 132 chủng Btk, tiến hành sàng lọc khả năng sinh enzym thủy phân chitin trên môi trường thạch có bổ sung chitin như nguồn các bon (Kamil et al., 2007., thu được 99 chủng sinh chitinase với đường kính vòng phân giải 3 - 29 mm, trong đó chủng MSS1.1 có đường kính vòng phân giải lớn nhất 29 mm và hoạt tính chitinase cao nhất đạt 0,5) U/ml (Hình 3.2A, B.. B B Hình 3.2. Hình ảnh sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của một số chủng Bt (A. và hoạt tính chitinase của 11 chủng Bt có đường kính vòng phân giải ≥ 25mm (B.. 3.1.4. Sàng loc gen endochitinase (chiA) của các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki Sử oụng cặp mồi đặc hiệu chi F và chi R để khuếch đại gen chiA (Hình 3.3. từ DNA hệ gen của 99 chủng sinh chitinase, thu được 73 chủng mang gen chiA (chiếm 73,7)%.. 3kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2kb 1,5kb Hình 3.3. Kết quả sàng lọc gen chiA từ các chủng Btk phân lâ ̣p ở Hà Nô ̣i. 1-8: các chủng Bt1.43, Bt1.55, Bt1.56, Bt1.58, Bt6.12, CM2.3, CM3.3, CM5.9; 10-17: HN1.2, TQ3.3, MSS1.1, MSS6.1, HDC4.7, RH2.15, MSS6.3, AV125.9, 9: DNA chuẩn (hãng Thermo scientific, kích thươc 10kb). 3.1.5. Sàng loc hoạt tinh kháng nấ của các chủng B. thuringiensis serovar kurstaki Từ 36 chủng Bt có đường kính vòng thủy phân chitin lớn (17-29 mm., đồng thời có hoạt tính chitinase cao (0,31 - 0,5) U/ml. và có mang gen chiA, tiến hành thử hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani thu được 5 chủng có khả năng kháng nấm. Trong đó, chủng MSS1.1 có đường kính vòng ức chế đối với 2 loại nấm F. oxysporum (Hình 3.). và R. solani lần lượt là 13 và 8 mm. Chủng MSS1.1 được lựa chọn để khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase, nhân oòng và biểu hiện chitinase tái tổ hợp. 9 Hình 3.4. Anh kháng nấm F. oxysporum của một số chủng Btk 3.2. Khảo sát điều kiêṇ sinh tổng hợp chitinase của chủng Bacillus thuringiensis MSS1.1 Qua quá trình khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase của chủng Btk MSS1.1 thu được kết quả như sau: Chủng MSS1.1 khi được lên men trong môi trường tối ưu gồm các thành phần (g/l.: bột ngô 10, K2HPO) 1, KH2PO) 1, bột đậu tương 10, NaCl 2, MgSO) 0,5, CaCl2 1, MnSO) 0,01, ZnSO) 0,01, FeSO) 0,01; bổ sung chitin huyền phù 0,5%, pH môi trường 7, nhiệt độ nuôi 28 oC thì sau 96 giờ lên men hoạt tính chitinase thu được là 0,87 U/ml, tăng 1,36 lần so với môi trường cơ sở ban đầu. 3.3. Nhân dong gen chiA mã hóa chitinase tư chủng vi khuẩn B. thuringiensis var. kurstaki MSS1.1 Gen chiA được nhân oòng trong vector pGEM®-Teasy. Kết quả đọc trình tự cho thấy, đoạn gen chiA từ DNA của chủng vi khuẩn MSS1.1 có chiều oài 2031 nucleotioe, có đô ̣ tương đồng 99% so với đoạn gen chiA của chủng B. thuringiensis serovar kurstaki HD73 trên GenBank có mã số EF581163.2 với 10 vị trí sai khác và xuất hiê ̣n vị trí cắt của enzym giới hạn BamHI (GGATCC. trong khoảng giữa đoạn gen oo sự sai khác ở vị trí nucleotioe C915T. Trình tự amino acio oo gen chiA mã hóa có độ tương đồng 99% so với trình tự amino acio của chủng HD73 có mã số ABQ65137.2 với sự thay đổi của 5 amino acio. Phân tích trình tự gen chiA của chủng Bt MSS1.1 cho thấy gen chiA có 3) amino acio đầu N là peptioe tín hiệu (http://www.cbs.otu.ok/services/SignalP/., với vị trí cắt ở giữa amino acio thứ 3) và 35. Phân tích cấu trúc oự đoán của protein ChiA từ chủng Bt MSS1.1 cho thấy, chitinase ChiA có cấu trúc 3 vùng đặc trưng cho họ glycosyl hyorolase 18: vùng thủy phân, vùng fibronectin và vùng gắn kết chitin. 3.4. Biêu hiêṇ gen chiA trong vi khuẩn E. coli BL21 3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen chiA trong vi khuân E.coli BL21 (DE3) Đoạn gen chiA được gắn vào vector biểu hiện pET28b(). tại vị trí cắt của EcoRI và XhoI, sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH10B khả biến. Plasmio tái tổ hợp có chứa gen chiA được tách, tinh sạch từ chủng DH10B và biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3. khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt và cấy trải trên môi trường LB thạch bổ sung 50 µg/ml kanamycin, nuôi 37 oC qua đêm. Khuẩn lạc mang gen chiA được nuôi trong môi trường LB lỏng chứa 50 µg/ml kanamycin, ở 10 37oC và cảm ứng bởi IPTG nồng độ cuối 0,5 mM. Mức độ biểu hiện protein của oòng tế bào được kiểm tra bằng điện oi trên gel polyacrylamioe (Hình 3.5A.. Kết quả xuất hiện một băng protein khoảng 70 kDa đậm hơn so với mẫu còn lại. Để khẳng định, tiến hành kiểm tra bằng Western blot sử oụng kháng thể đặc hiệu kháng đuôi His - tag. Kết quả (hình 3.5B. cho thấy xuất hiện băng tín hiệu đậm khoảng 70 kDa tương ứng với kết quả biểu hiện. Ngoài ra trên phổ Western blot cũng thấy xuất hiện một số băng tín hiệu thấp hơn so với băng đậm chính (70 kDa. và hoàn toàn không thấy xuất hiện băng nào cao hơn băng đậm chính này. Sự xuất hiện của băng thấp hơn có thể giải thích là oo protein chitinase tái tổ hợp bị thủy phân không đặc hiệu bởi protease trong quá trình chuẩn bị mẫu. Xác định hoạt tính enzyme của protein tái tổ hợp qua phản ứng DNS, thu được kết quả 1,10 ± 0,02 U/ml, cao hơn hoạt tính của chủng tự nhiên 1,26 lần. A B Hình 3.5. Phổ điện oi protein trên gel SDS-PAGE (A. và phân tích Western blot (B. Hình A. Băng 1: Protein tổng số từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA sau cảm ứng IPTG; Băng 2: Protein tổng số từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA không cảm ứng IPTG; Hình B: Băng 1: Dịch chiết protein từ E. coli BL21(DE3) mang pET28chiA sau cảm ứng; Băng 2: Dịch chiết protein từ E. coli BL21(DE3) mang pET28chiA không cảm ứng;M: Thang protein chuẩn 3.4.2. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen chiA của chủng tái tổ hợp 3.4.2.1. Nhiệt độ cảm ứng Kết quả thể hiện ở hình 3.6A cho thấy, ở các điều kiện nhiệt độ 28, 30, 3) và 37oC bản điện oi đều cho băng đậm kích thước khoảng 70 kDa. Đặc biệt, mức độ biểu hiện ở 30, 3) và 37oC không khác nhau nhiều. Tuy nhiên, hoạt tính enzym thu được có sự khác biệt đáng kể. Hoạt tính chiA thu được khi biểu hiện ở 30 oC là cao nhất (Bảng 3.3., đồng thời protein tái tổ hợp thể tan thu được khi biểu hiện ở 30ºC cũng cao nhất (Hình 3.6B.. Bảng 3.3. Sinh trưởng của tế bào và hoạt tinh enzýe ở các nhiệt độ cả́ ứng khác nhau Nhiệt độ cảm ứng Mật độ tế bào Hoat tính 11 (oC) 25 28 30 3) 37 (OD600nm) 1,)5 ± 0,11 2,13 ± 0,12 2,07 ± 0,15 2,99 ± 0,09 3,)1 ± 0,17 A (U/ml) 0,76 ± 0,03 1,22 ± 0,08 2,27 ± 0,02 2,16 ± 0,07 1,12 ± 0,19 B Hình 3.6. Điện oi protein rChiA biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau Hình A. Băng 1-5: protein tái tổ hợp biểu hiện ở 25, 28, 30, 34 và 37oC sau 6 giờ cảm ứng. Hình B. Protein tổng số, thể tan và thể vùi khi biểu hiện ở 30, 34 và 37oC; M: Maker protein 3.4.2.2. Nồng độ chất cảm cảm ứng Vector biểu hiện pET28b(). có chứa promoter T7, quá trình biểu hiện gen ngoại lai cần được cảm ứng bởi IPTG, tuy nhiên cần phải xác định nồng độ chất cảm ứng phù hợp, vừa đủ để trung hòa chất ức chế và không ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm. Chủng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA được biểu hiện ở các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau. Sau đó mẫu được thu hồi và đánh giá bằng kiểm tra hoạt tính cùng với điện oi SDS-PAGE (Hình 3.7A, B.. Kết quả cho thấy, ở nồng độ ITPG1 0,05 mM thì hoạt tính enzyme đạt được cao nhất (đạt 3,17 U/ml.. 2 3 ) 5 6 7 8 9 M kDa A B Hình 3.7. Kết quả oi protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau (A. và ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến hoạt tính protein tái tổ hợp (B.. Giếng 1: Mẫu không cảm ứng (nồng độ IPTG là 0); Giếng 2-9: Protein tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,3 và 1,5 mM; Giếng M: Thang protein chuẩn. 3.4.2.3. Thời gian cảm ứng Chủng tái tổ hợp được biểu hiện theo mô tả ở phần phương pháp, mẫu được thu sau các khoảng thời gian khác nhau để xác định hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy, sau khi cảm ứng 3 giờ hoạt tính enzyme của protein tái tổ hợp bắt đầu tăng đến 9 giờ 12 sau cảm ứng thì đạt cực đại (),83 U/ml., kéo oài thời gian sau cảm ứng đến 12 giờ thì hoạt tính bắt đầu giảm (chỉ còn 3,7) U/ml.. 3.4.2.4. Mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng Mật độ tế bào trong môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protein của chủng tái tổ hợp. Kết quả thể hiện hoạt tính enzyme đạt cao nhất (5,73 U/ml. khi mật độ tế bào OD600nm = 0,7. 3.4.2.5. Chất cảm ứng lactose Lactose được nghiên cứu như chất cảm ứng thay thế IPTG. Ở nồng độ lactose 7 mM mật độ tế bào đạt ),3) đơn vị và hoạt tính chitinase đạt cao nhất là 5,71 U/ml, hoạt tính này thấp hơn không đáng kể so với khi cảm ứng bằng IPTG nồng độ 0,05 mM (hoạt tính 5,73 U/ml. (Hình 3.8A.. Mặt khác, điện oi protein tái tổ hợp thu được từ mẫu cảm ứng bằng lactose và IPTG trên gel polyacrylamioe cho thấy, cả 2 mẫu đều xuất hiện băng protein đậm trong khoảng 70 kDa, tương ứng với trọng lượng của protein ChiA (Hình 3.8B.. A B Hình 3.8. Anh hưởng của nồng độ lactose đến hoạt tính chitinase và sinh trưởng của chủng E. coli tái tổ hợp (A.; Phổ điện oi protein tái tổ hợp khi cảm ứng bằng lactose (B.. Hình B. Băng 1: protein rChiA khi cảm ứng bằng ITPG 0,05mM; Băng 2: protein rChiA khi cảm ứng bằng lactose 7mM; M: Thang protein chuẩn. 3.4.3. Tối ưu khả năng biểu hiện rChiA bằng phương pháp bề ́ặt đáp ứng Những kết quả trên mới chỉ đánh giá được tác động độc lập của các yếu tố mà chưa đánh giá được tác động cộng hưởng, tương tác giữa các yếu tố với nhau. Với mục tiêu thu được protein ChiA có hoạt tính cao nhất, chúng tôi tìm sự tương tác đồng thời của các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp rChiA như: nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng và mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng. Tiến hành tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng với các miền khảo sát của 3 yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất cảm ứng lactose (A. 5 - 7 mM; Thời gian cảm ứng (B. 6 - 12 giờ và mật độ tế bào (C. (OD600 nm. 0,6 - 1. Bằng phần mềm Design expert 10.0.6, thu được ma trận gồm 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng. Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Kết quả phân tích hồi quy (Bảng 3.). cho thấy mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99%. Chuẩn F cho sự không tương thích của mô hình là 13 5,01 chứng tỏ sự không tương thích của mô hình là không có ý nghĩa, chỉ có 5,08% (P = 0,0508. cơ hội xuất hiện lỗi oo độ nhiễu gây nên. Bảng 3.). Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase Thông số Mô hình A-Lactose B-Thời gian cảm ứng C-Mật độ tế bào AB AC BC A2 B2 C2 Độ lệch thực nghiệm và mô hình Sự không tương thích mô hình Sai số Phương sai tổng Tổng phương sai Bậc tự do Trung bình phương sai khác Chuẩn Fisher Giá trị P 9 1 1 1 1 1 8,91 24,16 1,05 2,11 0,18 3,11 136,95 371,27 16,12 32,46 2,72 47,83 < 0,0001 < 0,0001 0,0025 0,0002 0,1301 < 0,0001 1 1,250E-005 1,921E-004 0,9892 1 1 1 27,15 13,79 17,44 417,13 211,87 268,02 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,65 10 0,065 0,54 5 0,11 5,01 0,0508 0,11 80,87 5 19 0,022 80,22 24,16 1,05 2,11 0,18 3,11 1,250E005 27,15 13,79 17,44 Giải bài toán tối ưu bằng cách chập mục tiêu theo thuật toán “hàm mong đợi” oùng phần mềm Design-Expert 10.0.6 với 100 phương án tối ưu được đưa ra. Phương án tối ưu nhất cho sinh tổng hợp chitinase của chủng E. coli tái tổ hợp là: nồng độ lactose 6,15 mM; thời gian cảm ứng 8,12 giờ và mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng là OD600nm = 0,87 với giá trị chitinase theo tính toán đạt 7,)9 U/ml. Để kiểm tra sự chính xác của mô hình, thí nghiệm xác nhận được tiến hành 3 lần. Kết quả cho thấy: hoạt độ chitinase theo thực nghiệm (7,5) U/ml. và mô hình (7,)9 U/ml. không có sự chênh lệch lớn, như vậy mô hình này phù hợp với thực nghiệm. Như vậy, sau khi tối ưu điều kiện lên men chủng E. coli tái tổ hợp bằng phương pháp bề mặt đáp ứng đã làm tăng hoạt tính enzym tái tổ hợp lên 1,32 lần (hoạt tính trươc khi tối ưu đạt 5,71 U/ml). 3.4.4. Tinh sạch và ác định hoạt tinh của chitinase tái tổ hợp Kết quả điện oi (Hình 3.9A. cho thấy, rChiA sau tinh sạch cho một băng đậm kích thước khoảng 70 kDa (Băng 1. tương ứng với trọng lượng chitinase tái tổ hợp. Hình 3.9B cho thấy, kết quả điện oi không biến tính (phương pháp zymogram. thu được vệt sáng ở khoảng kích thước 70 kDa, tương ứng với kích thước của rChiA trước và sau tinh sạch. Do trong sản phẩm rChiA còn một số băng kích thước nhỏ, 1) chúng tôi tiến hành kiểm tra Western blot đối với mẫu protein tái tổ hợp trước và sau tinh sạch. Kết quả hình 3.9C cho thấy, trên phổ Western blot đối với cả mẫu rChiA trước và sau tinh sạch chỉ xuất hiện một băng đậm kích thước khoảng 70 kDa. Kết quả này chứng tỏ protein chitinase đã được tinh sạch thành công. Protein tinh sạch có hoạt độ riêng 72,11 U/mg protein, tăng ),65 lần so với ban đầu. Hiệu suất thu hồi enzym cao đạt )0,32%. B C Hình 3.9. Điện oi SDS-PAGE chitinase tinh sạch (A.; kiểm tra hoạt tính chitinase bằng zymogram (B. và phân tích Western blot (C.. Hình A: M. Thang protein chuẩn, 1. Protein sau tinh sạch, 2. Protein trươc tinh sạch. Hình B: 1. Dịch chiết protein không cảm ứng, 2. Dịch chiết protein từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA trong đệm phosphate pH6, 3-5. Dịch chiết protein từ chủng E. coli BL21(DE3)pET28b/chiA trong đệm sodium acetate pH6 vơi hàm lượng protein tương ứng là 1, 5 và 20 µg. Hình C: M. Thang protein chuẩn, 1. Protein sau tinh sạch, 2. Protein trươc tinh sạch. 3.5. Nghiên cứu tính chất của chitinase tái tổ hợp 3.5.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của rChiA là )0 oC (hoạt tính đạt cực đại 72,12 U/mg., rChiA bền ở oải nhiệt độ oưới 35 oC (ở 30oC và 35oC, hoạt tính rChiA giảm không đáng kể, vẫn còn ouy trì 9),6 và 91,3% sau khi ủ 2) giờ.. 3.5.2. pH tối ưu và độ bền pH pH tối ưu cho hoạt động của rChiA là 7 và hoạt tính rChiA bền nhất khi ở pH7, sau 2) giờ ủ vẫn còn 70,1% hoạt tính 3.5.3. Ảnh hưởng của ion kí loại và EDTA lên hoạt tinh chitinase Một số ion kim loại hóa trị 2: Mn 2), Mg2), Cu2), Zn2), Fe2) với nồng độ 10 mM đã làm giảm hoạt tính enzyme từ 13,3 – 32,2%. Ngoại trừ ion Hg 2) ở nồng độ 10 mM làm cho rChiA mất hoàn toàn hoạt tính enzyme. Đặc biệt, ion Ca2) ở nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme tăng 17,61%. Hoạt tính enzyme của rChiA tăng từ 1- )% khi bổ sung các ion K) và Na) ở nồng độ 1-10 mM. Ion Ag) ở nồng độ 10 mM làm hoạt tính enzyme giảm 58%. EDTA nồng độ 1-10 mM làm giảm hoạt tính enzyme 17,6 – )7,2%. 3.5.4. Ảnh hưởng của chât tây rửa 15 Trong số các chất tẩy rửa thì Trixton X100 với nồng độ 2% đã làm hoạt tính enzyme của rChiA tăng 1),6%. Đặc biệt, SDS với nồng độ 2% thì hoạt tính enzyme của rChiA chỉ còn 66,8%. 3.5.5. Ảnh hưởng của dung ́ôi hữu cơ Hoạt tính enzym của rChiA bị ảnh hưởng bởi oung môi hữu cơ ở các nồng độ khác nhau. Khi bổ sung ethanol, acetone, methanol và n-butanol với nồng độ 10% đã làm hoạt tính giảm đi 1,3; 5,); 6,3 và 8,)%. Đặc biệt, khi xử lý enzym với các oung môi hữu cơ ở nồng độ 30% thì hoạt tính enzym của rChiA giảm khá nhiều từ 16,3% đến )0,2%. 3.5.6. Động hoc của phản ứng enzýe Các thông số động học K m và Vmax của rChiA với cơ chất chitin và cơ chất )-MU(GlcNAc.3 được xác định oựa trên phương trình Linewever-Burk (Bảng 3.5.. Bảng 3.5. Các thông số động học của rChiA với các cơ chất khác nhau Cơ chất Phương trình Linewever-Burk y=1),199x ) 1.596 y= 0,7693x ) 1,8731 Chitin )-MU-(GlcNAc.3 Vmax 0,63 µM/ phút ± 0,09 0,53 nM/phút ± 0,087 Km (mg/ml) 8,90 ± 0,3) 0,)1 ± 0,06 3.5.7. Sản phấ của sự thủy phân cơ chât bởi chitinase Sử oụng rChiA tinh sạch và colloioal chitin như nguồn cơ chất, các oligosaccharit với mức trùng hợp 2 (GlcNAc2., 3 (GlcNAc3. và ) (GlcNAc). đã được phát hiện. Ngoài ra, còn thấy một lượng không nhỏ N-acetyl-D–glucosamine (GlcNAc. (Hình 3.10.. Hình 3.10. Phân tích bản mỏng (TLC. các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase 1. Sản phẩm thủy phân chitin huyền phù sau 24 giờ, 2. Chất chuẩn (N-acetyl D glucosamine và các oligomer (Sigma), 3. rChiA tinh sạch, 4. Chitin huyền phù 0,5% GlcNAc (GlcNAc)2 (GlcNAc)3 (GlcNAc) 4 1 2 3 4 3.6. Khả năng kháng nấm gây bênh ̣ thực vâ ̣t và tăng hoat tính diêṭ sâu của chitinase tái tổ hợp 3.6.1. Khả năng kháng nấ gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ hợp rChiA có khả năng ức chế sự phát triển của một số nấm gây bệnh thực vật như: F. oxysporum và R. solani. Hoạt tính ức chế được quan sát sau 3 ngày, ở đĩa bổ sung rChiA thì sợi nấm phát triển kém hẳn so với đĩa đối chứng bổ sung enzym đã bất hoạt (Hình 3.11A, B.. Đối với nấm Mucor sp. thì sợi nấm ở đĩa bổ sung chitinase vẫn phát triển bình thường giống như ở đĩa đối chứng (Hình 3.11C.. Khi quan sát oưới kính hiển vi thì thấy, nấm F. oxysporum và R. solani xử lý với rChiA thì sợi nấm bị thủy phân, biến oạng trong khi sợi nấm xử lý với enzym đã bất hoạt vẫn giữ nguyên hình oạng ban đầu. Ngược lại, sợi nấm Mucor sp. không ảnh hưởng gì khi xử lý với rChiA (Hình 3.12.. Khi xử lý nấm gây bệnh thực vật F. oxysporum, R. solani và 16 Mucor sp với rChiA, đã xác định được lượng N-acetyl D-glucosamine giải phóng ra lần lượt là 22,1) µg/ml; 18,36 µg/ml và 0 µg/ml. Như vậy, rChiA có khả năng ức chế 2 loại nấm gây bệnh thực vật là F. oxysporum và R. solani. 2 A 3 3 1 3 1 2 B 3 C 1 2 3 Hình 3.11. Sự ức chế phát triển nấm F. oxysporum (A., R. solani (B. và Mucor sp. (C. của rChiA sau 3 ngày. Đĩa 1: đối chứng (bổ sung enzym đã bất hoạt), Đĩa 2: bổ sung 100 µl rChiA (tương đương 3,49 U). Đĩa 3: bổ sung 200 µl rChiA (6,98 U) Hình 3.12. Sợi nấm F. oxysporum, R. solani và Mucor sp. khi xử lý với enzym đã bất hoạt (A, C, E. và với rChiA (B, D, F. 17 3.6.2. Hỗ trợ hoạt tinh diệt sâu Bộ cánh vây của chitinase tái tổ hợp 3.6.2. Hỗ trợ hoat tính diệt sâu Bộ cánh vẩy của chitinase tái tổ hợp Khi sử oụng kết hợp chitinase rChiA với protein tinh thể Bt từ chủng SP10.6 đã rút ngắn thời gian gây chết từ 72 giờ xuống còn )8 giờ (gây chết 100% đối với sâu tơ và 8),3% đối với sâu khoang. (Hình 3.13., đồng thời giá trị LC 50 giảm 8,0)% và 6,80% đối với sâu tơ và sâu khoang (Bảng 3.6.. A B Hình 3.13. Thử nghiệm khả năng oiệt sâu tơ (A. và sâu khoang (B. của protein tinh thể Cry, rChiA Bảng 3.6. Nồng độ gây chết 50% (LC50. của protein tinh thể Bt và rChiA LC50 sâu tơ (ng/cm2) 167,8 ± 8,5 15),3 ± 9,) Mẫu thử nghiệm SP10.6 SP10.6 ) rChiA LC50 sâu khoang (ng/cm2) 283,5 ± 12,6 26),2 ± 7,3 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Phân lập vi khuẩn B. thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam. 4.1.1. Phân lâ ̣p vi khuân B. thuringiensis Chỉ số Bt của các mẫu đất ở Mỹ là 0,25 - 0,31 (Martin và Traverst, 1989.; ở NewZealano là 0,2 - 0,5 (Chilcott và Wigley, 1993.. Trong khi đó, tần suất xuất hiện Bt ở 7 tỉnh thành Việt Nam là 60,9)% và chỉ số Bt là 0,)). Như vậy, so với số liệu công bố của các tác giả trên thì tần suất xuất hiện Bt và chỉ số Bt mà chúng tôi phân lập được là khá cao. Chứng tỏ số lượng vi khuẩn Bt ở Việt Nam rất phong phú, có thể cung cấp nhiều nguồn gen quý. 4.1.2. Phân loại dưới loài kurstaki các chủng Bt phân lập Kết quả phân loại cho thấy, 29,2% số chủng thuộc typ huyết thanh 3a, 3b, 3c (oưới loài kurstaki., chiếm ty lệ cao nhất. Kết quả phân loại này khá cao so với ở New Zealano chỉ 25% số chủng thuộc oưới loài kurstaki (Young, 1998.. Theo các nghiên cứu trên thế giới, các chủng vi khuẩn thuộc oưới loài B. thuringiensis var. kurstaki (Btk. vừa có khả năng chống lại ấu trùng bộ Cánh vẩy (Lepiooptera. vừa có khả năng sinh enoochitinase – enzyme có khả năng kháng nấm gây bê ̣nh thực vâ ̣t và làm tăng hoạt tính oiê ̣t côn trùng của Bt (Barboza, 2008; Gomaa, 2012.. A B