Tài liệu Tóm tắt luận án Tối ưu hóa quá trình thu nhận chitin – chitosan từ phế liệu tôm thẻ chân trắng nhằm nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu tôm hàng đầu trên thế giới với hai đối tượng nuôi chính là tôm sú và tôm thẻ chân trắng, tổng khối lượng sản phẩm tôm sú và tôm thẻ năm 2012 đã đạt trên 480 ngàn tấn, trong đó lượng tôm thẻ chân trắng đạt trên 130 ngàn tấn và có xu hướng gia tăng. Song song với các sản phẩm xuất khẩu chính, một lượng đáng kể đầu và vỏ tôm cũng được tạo ra từ các qui trình sản xuất, ước tính lên đến 200 ngàn tấn mỗi năm. Trên đầu và vỏ tôm có chứa một lượng đáng kể protein, chitin, khoáng, protease và astaxanthin. Do đó, việc xử lý kịp thời và hiệu quả lượng nguyên liệu tôm còn lại không những sẽ góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường mà còn nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh và hiệu quả sử dụng tài nguyên thông qua việc thu hồi các hợp chất có hoạt tính sinh học. Ở nước ta việc khai thác nguồn nguyên liệu tôm còn lại mới chỉ tập trung chủ yếu vào chitin và do sử dụng phương pháp hóa học nên không thu hồi được các hợp chất có giá trị khác như protein và astaxanthin. Bên cạnh đó,chất lượng chitin vẫn còn nhiều hạn chế và công nghệ sản xuất chitin đã gây ô nhiễm môi trường rất nghiêm trọng. Vì vậy, để có thể sử dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu còn lại từ quá trình chế biến tôm, đặc biệt là với tôm thẻ chân trắng - một đối tượng nuôi mới, đồng thời thúc đẩy sự hình thành và phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn nguyên liệu này ở Việt Nam cần thiết phải nghiên cứu công nghệ cải tiến để có thể thu hồi chitin đồng thời với các hợp chất có giá trị sinh học khác và giảm ô nhiễm môi trường. Kết hợp phương pháp sinh học với hóa học đang là hướng đi được quan tâm trong thu hồi chitin và các hợp chất có giá trị từ nguyên liệu giáp xác nhưng để có thể áp dụng vào thực tiễn cần phải nghiên cứu các giải pháp hỗ trợ để nâng cao hiệu quả đồng thời hiểu rõ hơn về động học quá trình. Xu thế mới trong cải tiến công nghệ hiện nay là chú trọng khai thác và áp dụng tác nhân vật lý để hỗ trợ quá trình hóa học và sinh học, trong đó sóng siêu âm đang đặc biệt được quan tâm. Sóng siêu âm là một tác nhân vật lý "xanh" đã được chứng minh hiệu quả và triển khai ở qui mô công nghiệp trong nhiều lĩnh vực như chế biến thực phẩm, công nghiệp hóa học, công nghiệp dệt. Do đó nghiên cứu kết hợp xử lý sóng siêu âm trong quá trình sản xuất chitin, chitosan có thể mở ra một hướng đi mới, giúp cải tiến hiệu quả công nghệ thu hồi chitin, chitosan hiện có. Luận án " Tối ưu hóa quá trình thu nhận chitin-chitosan từ phế liệu tôm thẻ chân trắng nhằm nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm" được thực hiện với mục đích nghiên cứu kết hợp phương pháp enzyme, phương pháp hóa học với phương pháp vật lý để đề xuất một hướng đi mới cho phép cải tiến công nghệ sản xuất chitin, chitosan ở Việt Nam. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của luận án là tối ưu hóa các công đoạn chính trong quá trình thu nhận chitin, chitosan bằng công nghệ kết hợp nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm, giảm lượng hóa chất sử dụng, tận dụng được nguồn protein có giá trị sinh học và hạn chế ô nhiễm môi trường. 3. Phạm vi và nội dung nghiên cứu Luận án sẽ tập trung nghiên cứu 03 công đoạn chính có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm và hiệu quả của quá trình thu nhận chitin, chitosan từ vỏ động vật giáp xác: công đoạn khử protein, khử khoáng và deacetyl, trên cơ sở đó đề xuất qui trình cải tiến cho phép cải thiện chất lượng của sản phẩm và nâng cao hiệu 2 quả về mặt môi trường. Các nội dung chính trong luận án bao gồm: (1) Xác định thành phần (thành phần khối lượng, thành phần hóa học, thành phần khoáng và thành phần acid amin) của đối tượng tôm thẻ chân trắng; (2) Nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thu nhận chitin và protein từ phần đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng; (3) Nghiên cứu động học quá trình khử protein trên vỏ tôm thẻ chân trắng bằng pepsin; (4) Nghiên cứu tối ưu hóa và động học quá trình deacetyl chitin, thu hồi từ đối tượng tôm thẻ chân trắng, trong điều kiện dị thể với sự hỗ trợ của sóng siêu âm; và (5) Đề xuất qui trình thu nhận chitin, chitosan và protein sử dụng công nghệ cải tiến (kết hợp phương pháp enzyme, phương pháp hóa học và phương pháp vật lý) cho phép nâng cao chất lượng sản phẩm và hiệu quả của quá trình. 4. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu chính trong luận án là nguyên liệu còn lại (phần đầu và phần vỏ thân) của quá trình chế biến tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) xuất khẩu, kích cỡ trung bình từ 81-120 con/kg. 5. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của luận án Luận án đã công bố dẫn liệu về thành phần khối lượng và thành phần hóa học của đối tượng nguyên liệu tôm thẻ chân trắng được nuôi và chế biến ở khu vực Khánh Hòa, đồng thời đánh giá tác động của việc chậm xử lý đến sự biến đổi của đầu tôm thẻ chân trắng. Kết quả thu được là căn cứ khoa học để các doanh nghiệp chế biến tôm và sản xuất chitin thực hiện các điều chỉnh cần thiết cho quá trình xử lý nguyên liệu còn lại, từ đó nâng cao được hiệu quả sử dụng tài nguyên, hạn chế được các tác động xấu đến môi trường. Lần đầu tiên việc nghiên cứu động học quá trình khử protein dưới xúc tác của enzyme protease (pepsin) cũng được thực hiện. Kết quả nghiên cứu động học thu được giúp hiểu rõ hơn đặc điểm cấu trúc của vỏ tôm, bản chất quá trình khử protein bằng enzyme pepsin đồng thời cung cấp mô hình toán hỗ trợ cho việc mở rộng qui mô áp dụng cũng như kiểm soát, điều chỉnh quá trình khử protein bằng enzyme. Các kết quả nghiên cứu tối ưu hóa và động học quá trình deacetyl trong điều kiện dị thể có kết hợp với sóng siêu âm lần đầu tiên được công bố giúp hiểu rõ hơn tác dụng của hỗ trợ quá trình deacetyl của sóng siêu âm, đồng thời cung cấp các căn cứ khoa học để mở rộng phạm vi áp dụng sóng siêu âm vào lĩnh vực sản xuất chitin, chitosan. Việc áp dụng công nghệ kết hợp (Integrated) giữa phương pháp sinh học, hóa học và vật lý vào quá trình thu hồi chitin, chitosan và protein cũng lần đầu tiên được đề cập trong luận án. Các qui trình được đề xuất sẽ mở ra một hướng đi mới trong việc cải tiến công nghệ thu hồi chitin, chitosan hiện có: cho phép nâng cao chất lượng sản phẩm, thu hồi protein có hoạt tính sinh học, đồng thời tiết giảm đáng kể lượng hóa chất sử dụng và chất thải. 6. Kết cấu của Luận án Luận án gồm 142 trang nội dung, 19 trang tài liệu tham khảo (242 tài liệu) và 56 trang phụ lục. Nội dung luận án được trình bày trong 3 chương với 28 bảng biểu và 28 hình ảnh, đồ thị và 13 sơ đồ, qui trình. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Thành phần và giá trị của nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm xuất khẩu Nguyên liệu còn lại sau khi chế biến tôm gồm có đầu, vỏ, đuôi và một lượng không đáng kể thịt vụn; Tỷ lệ giữa các phần thay đổi tùy thuộc vào giống loài, độ tuổi, mùa vụ và phương pháp chế biến tuy nhiên theo số liệu thống kê tỷ lệ nguyên liệu còn lại so với khối lượng toàn thân tôm dao động khoảng 40-60%. Mặc dù có sự khác nhau về tỷ lệ các thành phần hóa học ở các loài tôm nhưng protein luôn là thành phần chiếm tỷ trọng lớn nhất (từ 33-49,8% khối lượng chất khô), tiếp đến là chất khoáng và chitin (tương ứng từ 21,6- 3 38% và từ 13,5-20% khối lượng chất khô). Như vậy, nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến tôm là nguồn nguyên liệu quan trọng để thu nhận protein và chitin. Trên đầu tôm có chứa một hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau trong đó một lượng đáng kể là enzyme protease. Hệ enzyme protease trên đầu tôm bao gồm cả endoprotease và exoprotease, có hoạt lực tương đương một số protease thương mại tuy nhiên chúng rất dễ bị tổn thất theo lượng protein hòa tan. Đối với tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei), hệ protease hoạt động mạnh ở 60oC trong vùng pH=7,5-8, đây cũng chính là giá trị pH tự nhiên của đầu tôm tươi. Khai thác trực tiếp nguồn protease trên đầu tôm để thủy phân protein sẽ cho phép tiết kiệm được chi phí bổ sung enzyme từ bên ngoài. 1.2. Pepsin và khả năng ứng dụng trong thu nhận protein và chitin Pepsin có bản chất của một endopeptidase, thuộc nhóm aspartate protease, có tính đặc hiệu đối với các liên kết peptide giữa các acid amin kỵ nước với các acid amin vòng thơm như phenylalanine, tryptophan và tyrozin. Phân tử pepsin được hình thành từ một chuỗi protein đơn. Khối lượng phân tử trung bình của pepsin thương mại vào khoảng 34,644 Da với 327 gốc acid amin, trong đó các acid amin có tính acid chiếm một tỷ lệ cao (43 trong tổng số 327), tạo nên giá trị pI khá thấp. Trung tâm hoạt động của pepsin được hình thành bởi hai tiểu phần có gốc aspartate, Asp32 và Asp215, một tiểu phần sẽ đóng vai trò chất nhận proton, và tiểu phần còn lại là chất cho proton. pH hoạt động của pepsin trong khoảng từ 1-5, tùy theo cơ chất. Trong giải pH từ 5-7, hoạt tính của pepsin giảm đáng kể. Ở pH trên 7, pepsin bị biến tính và mất khả năng hoạt động tuy nhiên hoạt tính của pepsin có thể phục hồi khi pH của hệ thay đổi về vùng tối thích. Sản phẩm thủy phân protein của pepsin có hoạt tính sinh học cao hơn so với các enzyme khác như Alcalase , α-chymotrypsin, và trypsin. Với các tính chất đặc trưng này, có thể sử dụng pepsin để kết hợp quá trình khử protein với quá trình khử khoáng giúp rút ngắn thời gian và thu hồi sản phẩm thủy phân protein có hoạt tính sinh học. Pepsin thương mại hiện nay chủ yếu được thu nhận từ lớp niêm mạc dạ dày lợn theo phương pháp truyền thống nên chi phí sản xuất cao hơn so với một số enzyme protease thương mại khác được thu nhận từ sinh khối vi sinh vật. Tuy nhiên các nguồn thu nhận pepsin đang được nghiên cứu mở rộng (từ nội tạng cá hay từ một số loài vi sinh vật như nấm Botrytis cinerea hay vi khuẩn Aspergillus niger) cùng với sự cải tiến về công nghệ thu hồi dựa trên hệ thống hai pha (Aqueous two-phase system) do đó chắc chắn giá thành của pepsin sẽ có sự điều tiết hợp lý hơn trong tương lai. 1.3. Sóng siêu âm và tiềm năng ứng dụng Sóng siêu âm là sóng âm thanh có tần số cao hơn tần số tối đa mà tai người có thể nghe thấy được (>20kHz). Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm và công nghệ sinh học, sóng siêu âm có tần số thấp - cường độ cao (20 -100kHz) có phạm vi ứng dụng khá rộng, đặc biệt được dùng để điều chỉnh tính chất vật lý và hóa học của thực phẩm, của enzyme cũng như của các đối tượng được chiếu sóng. Cơ chế tác động của sóng siêu âm trong hệ có chất lỏng chủ yếu liên quan đến hiện tượng tạo lỗ hổng (cavitation). Tùy thuộc vào đặc tính của hệ được chiếu sóng siêu âm (tính chất của môi trường lỏng, sự có hay không có mặt của khí và các thành phần không tan) và điều kiện chiếu sóng (tần số, mức năng lượng, thời gian, phương thức tạo sóng, ...) mà các tác động trên có thể xảy ra với các mức độ khác nhau. Với cơ chế tác động đa chiều, sóng siêu âm có thể thay đổi cấu trúc không gian của các chất tham gia phản ứng (nguyên liệu, enzyme) và tăng cường sự tiếp xúc giữa các chất tham gia phản ứng nhờ đó có tác dụng đẩy nhanh tốc độ và rút ngắn đáng kể thời gian phản ứng. 4 Việc nghiên cứu và ứng dụng sóng siêu âm để đẩy nhanh tốc độ phản ứng hóa học, nâng cao hiệu suất tách chiết các chất có hoạt tính sinh học với các hệ dị thể (rắn - lỏng) đang rất được quan tâm vì sóng siêu âm có khả năng xúc tiến các phản ứng hóa học, giúp giảm nhẹ điều kiện phản ứng (nhiệt độ, thời gian, lượng hóa chất sử dụng), tiết kiệm chi phí đồng thời còn cho phép giữ và/hoặc cải thiện chất lượng sản phẩm. Kết quả của các nghiên cứu cho thấy tác động hóa học, vật lý và năng lượng hình thành nhờ xử lý sóng siêu âm đã cho phép giảm thiểu được rất đáng kể lượng hóa chất và chất thải thải ra môi trường, góp phần tạo nên các quá trình công nghệ "xanh" và chúng hoàn toàn có thể phát triển để đưa vào áp dụng ở qui mô công nghiệp. 1.4. Những vấn đề cần giải quyết đối với công nghệ sản xuất chitin, chitosan ở Việt Nam Nguyên liệu dùng để sản xuất chitin chủ yếu là phần đầu tôm và vỏ tôm từ qui trình chế biến tôm sú và tôm thẻ chân trắng xuất khẩu. Tại các doanh nghiệp chế biến tôm, đầu tôm luôn được tách ra khỏi thân từ rất sớm, sau khi tiếp nhận (trừ sản phẩm tôm nguyên con); còn vỏ tôm sẽ được tách ra ở các giai đoạn muộn hơn, tùy thuộc vào đặc điểm của sản phẩm. Tuy nhiên, sau đó chúng lại được nhập chung và lưu giữ khá lâu (thường từ 4-8h) ở nhiệt độ phòng trong khu vực chứa phế liệu trước khi được vận chuyển đến các cơ sở sản xuất chitin hoặc thức ăn gia súc. Lúc này đầu và vỏ tôm thường đã có dấu hiệu hư hỏng rất rõ: chảy dịch, mùi hôi và biến màu. Thói quen xử lý này đã làm giảm hiệu quả thu hồi các sản phẩm hữu ích đồng thời gây ô nhiễm môi trường. Công nghiệp sản xuất chitin, chitosan của nước ta hiện tại còn đơn giản và chưa được đầu tư đúng mức. Các cơ sở sản xuất đa phần tập trung ở khu vực miền Tây Nam bộ và Đồng bằng sông Cửu Long nhưng có qui mô nhỏ, khoảng 2000 tấn sản phẩm/năm và chủ yếu sử dụng phương pháp hóa học; phương pháp sinh học kết hợp với hóa học chỉ mới được một vài cơ sở triển khai thăm dò ở qui mô nhỏ. Các cơ sở sản xuất chitin hiện nay đều sử dụng acid HCl trong công đoạn khử khoáng và NaOH để khử protein. Nồng độ HCl sử dụng thường nằm trong khoảng 4-6% và xử lý ở nhiệt độ thường trong thời gian khoảng 1 ngày. Nồng độ của dung dịch NaOH nằm trong khoảng 4-5%, ở nhiệt độ thường hoặc có gia nhiệt, thời gian trong khoảng 1 ngày. Quá trình khử protein chỉ được gia nhiệt khi yêu cầu chất lượng của chitin cao còn hầu hết là xử lý ở nhiệt độ thường. Dịch thu được sau khử protein được đưa lên tháp để cô đặc và sản phẩm protein thu hồi có dạng sệt, được tận dụng làm thức ăn gia súc nhưng chất lượng rất kém. Sản phẩm chính của các cơ sở sản xuất là chitin nhưng chất lượng vẫn còn thấp, hàm lượng khoáng và protein cao, dễ bị biến màu; chất lượng không ổn định, giá thành cao; giá bán thấp do đó khả năng ứng dụng và thương mại hóa hạn chế. Số lượng các cơ sở sản xuất chitin hiện đang ngày càng giảm vì bị cấm hoạt động do gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Nguyên nhân gây ô nhiễm đến từ hai nguồn: dịch rỉ protein trong quá trình vận chuyển nguyên liệu từ doanh nghiệp chế biến tôm về nơi sản xuất chitin và lượng chất thải từ qui trình sản xuất chitin, chitosan. Nhu cầu thực tiễn đòi hỏi phải có các giải pháp khoa học để xử lý triệt để tình trạng ô nhiễm này. Tóm lại, hướng sử dụng nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến tôm ở nước ta chỉ mới tập trung chủ yếu đến việc thu hồi chitin mà chưa quan tâm nhiều đến việc thu hồi và duy trì giá trị sinh học cho protein cũng như chưa tạo ra được các sản phẩm có tính ứng dụng và thương mại hóa cao. Thêm vào đó, các nghiên cứu chỉ tập trung ở việc thiết lập qui trình công nghệ mà chưa có các nghiên cứu sâu về mặt động học và cũng chưa đánh giá được mức độ ảnh hưởng và sự tương tác của các thông số xử lý trong qui trình công nghệ. 5 CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu chính Nguyên liệu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) nuôi, ở khu vực Khánh Hòa, được sử dụng ở 2 dạng: dạng nguyên con để xác định thành phần khối lượng (có cỡ trong khoảng từ 60-160 con/kg), thành phần hóa học, thành phần acid amin, thành phần khoáng (cỡ trong khoảng từ 81-120 con/kg, cỡ phổ biến); và ở dạng nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm thẻ chân trắng xuất khẩu (cỡ trong khoảng từ 81-120 con/kg, có phần đầu và phần vỏ tôm tách riêng) để nghiên cứu thu hồi chitin, chitosan và protein. Nguyên liệu được thu mẫu khi còn tươi, có màu sắc và mùi đặc trưng tại công ty Cổ phần NhaTrang Seafoods (F17), Nha Trang, Khánh Hòa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Dùng phương pháp thực nghiệm, kết hợp giữa qui hoạch cổ điển với qui hoạch thực nghiệm để bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu; Khai thác các phần mềm chuyên dụng để xử lý số liệu, phân tích hồi qui và xác định các chế độ tối ưu. Đặc điểm của đối tượng tôm thẻ chân trắng được khảo sát về thành phần khối lượng, thành phần hóa học cơ bản và sự biến đổi của nguyên liệu khi lưu giữ trong điều kiện được mô phỏng theo thực tế tại các doanh nghiệp chế biến tôm. Qui trình thu nhận chitin và protein được nghiên cứu riêng cho phần đầu và phần vỏ tôm theo hướng khai thác khả năng kết hợp phương pháp enzyme với phương pháp hóa học và vật lý. Quá trình khử khoáng được thực hiện chủ yếu bằng phương pháp hóa học với HCl theo hướng hạn chế ảnh hưởng của môi trường acid đến mạch polysaccharide của chitin. Quá trình khử protein chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp sinh học: đối với phần đầu tôm sẽ khai thác hệ enzyme protease có sẵn trên nguyên liệu; còn đối với phần vỏ sẽ sử dụng enzyme pepsin bổ sung từ bên ngoài. Mục tiêu là xác lập được chế độ tự thủy phân và xử lý pepsin tối ưu, cho phép thu nhận dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa và loại tối đa lượng protein trên phần rắn. Quá trình deacetyl để chuyển chitin thành chitosan sẽ được thực hiện trong điều kiện dị thể với NaOH. Công đoạn tiền xử lý chitin và khả năng kết hợp sóng siêu âm sẽ được tập trung nghiên cứu nhằm cải tiến quá trình deacetyl truyền thống. Bên cạnh đó các thông số động học của quá trình thủy phân protein trên vỏ tôm dưới xúc tác của pepsin và deacetyl khi có sóng siêu âm cũng được khảo sát. Dựa vào các kết quả nghiên cứu 3 công đoạn chính đã thu được kết hợp với kế thừa kết quả nghiên cứu của các tác giả đi trước, qui trình sản xuất chitin, chitosan áp dụng công nghệ kết hợp sẽ được đề xuất. Sản phẩm chitin, chitosan thu nhận từ qui trình đề xuất sẽ được đặc trưng tính chất thông qua việc xác định các chỉ tiêu liên quan đến độ tinh sạch, khối lượng phân tử, độ acetyl/deacetyl, đặc điểm cấu trúc (phổ nhiễu xạ tia X, phổ FT-IR và phổ NMR) và một số tính chất lý-hóa quan trọng; Sản phẩm thủy phân protein sẽ được đánh giá khả năng chống oxy hóa thông qua đánh giá khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử. Mức độ nâng cao chất lượng sẽ được đánh giá dựa vào tiêu chuẩn chất lượng chitin, chitosan thương mại do các công ty có uy tín công bố, cụ thể là công ty AxioGen (Ấn Độ) và công ty Ensymm (Đức). Hiệu quả quá trình được đánh giá chủ yếu ở khía cạnh môi trường, dựa vào khả năng tiết giảm lượng hóa chất sử dụng so với qui trình hiện đang được áp dụng trong thực tiễn trên cùng đối tượng tôm thẻ chân trắng. 6 2.3. Các phương pháp phân tích đã áp dụng Các phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu là các phương pháp thường qui kết hợp với các phương pháp hiện đại: phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC); Phương pháp xác định phân tử lượng trung bình độ nhớt của polymer thông qua đo độ nhớt nội và phương trình Mark-Houwink-Sakurada (MHS); Phổ nhiễu xạ tia X; Phổ hấp phụ quang phổ hồng ngoại (FT-IR); Phổ proton cộng hưởng từ hạt nhân (H1NMR); Phương pháp chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (SEM). 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phân tích ANOVA kết hợp với Turkey Test để so sánh giá trị trung bình của các mẫu; Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng để tìm các phương trình hồi qui và thông số tối ưu của quá trình xử lý vỏ tôm với pepsin và deacetyl chitin; Sử dụng phần mềm Sigmaplot 12.5 để vẽ đồ thị và phân tích hồi qui (chức năng Regression và Global Curve Fit); Phần mềm Origin Pro 8.0 để xử lý phổ nhiễu xạ tia X; Phần mềm Design Expert 8.0.7 và phần mềm MINTAB 16.1 để thiết kế thí nghiệm, phân tích tối ưu và xử lý thống kê; Giá trị p<0.05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê. 2.5. Thiết bị, hóa chất phục vụ nghiên cứu Sử dụng enzyme pepsin (EC 3.4.2.3.1) do công ty hóa chất Merck sản xuất với mã số sản phẩm là 107185 0100. Hóa chất khác dùng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết, trong đó hóa chất dùng trong quá trình thu nhận chitin, chitosan (NaOH và HCl) do công ty LoBa, Ấn Độ, sản xuất và hóa chất dùng trong phân tích các chỉ tiêu do công ty Mecrk, Đức, sản xuất. Sử dụng bể siêu âm của hãng Elma Co. (Đức), Model S15-S900H để tạo sóng siêu âm. Sóng siêu âm dùng trong nghiên cứu có tần số 37kHz với mức năng lượng tổng (RMS) đạt 35W. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần của đối tượng tôm thẻ chân trắng Kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ trung bình của phần đầu và phần vỏ (bao gồm cả đuôi) so với khối lượng toàn thân của tôm thẻ chân trắng (cỡ 60-160 con/kg) nằm trong khoảng 27,5±3,93 và 11,21± 2,63 (%), tương ứng, căn cứ vào số liệu này có thể ước tính lượng nguyên liệu còn lại sau quá trình chế biến tôm thẻ chân trắng sẽ vào khoảng 38,70±6,46 (%) so với lượng nguyên liệu đưa vào chế biến. Phần đầu và vỏ của đối tượng tôm thẻ chân trắng với cỡ từ 81-120 con/kg, cỡ phổ biến, có hàm lượng khoáng tương đương nhau: 25,61% và 26,66%, tương ứng, nhưng hàm lượng protein và chitin lại có sự khác nhau khá đáng kể, hàm lượng protein trên đầu tôm cao hơn khoảng 18% nhưng hàm lượng chitin lại thấp hơn 50% so với vỏ tôm. So với phần thịt, hàm lượng acid amin trên phần đầu và vỏ tôm bằng khoảng 50% và 30%, tương ứng; Thành phần và tỷ lệ của các acid amin không có sự khác nhau nhiều và đều có mặt các acid amin không thay thế; Các acid amin glycine/arginine, glutamic/glutamine, aspartic/asparagine, và alanine luôn chiếm tỷ lệ lớn, tuy nhiên, các acid amin Tyr, Phe, Leu và Val ở phần đầu và vỏ lại có tỷ lệ cao hơn so với phần thịt. Thành phần khoáng K và Cu trong đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng có sự chênh lệch không lớn, trong khi thành phần Na, Ca và Fe lại có sự khác biệt đáng kể. Các kim loại nặng phát hiện thấy chủ yếu nằm ở phần đầu tôm (Cd, As và Pb) nhưng đều có hàm lượng dưới mức cho phép dùng trong thực phẩm, trên vỏ tôm chỉ phát hiện thấy Pb với hàm lượng tương đương trên phần đầu. Hàm lượng Se và Hg ở cả 2 phần đều nằm dưới giới hạn phát hiện. 7 Các phân tích trên cho thấy bên cạnh chitin, lượng protein trên vỏ và đầu tôm cần được ưu tiên thu hồi với chế độ xử lý thích hợp để duy trì giá trị sinh học và cần có chế độ xử lý riêng đầu và vỏ tôm để nâng cao hiệu quả thu hồi chitin và protein. 3.2. Thu hồi chitin và dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học từ đầu tôm thẻ chân trắng 3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ đến sự biến đổi của đầu tôm Chất lượng của phần đầu tôm còn lại sau quá trình chế biến tôm thẻ chân trắng xuất khẩu suy giảm nhanh theo thời gian lưu giữ ở nhiệt độ phòng (27-30oC), hàm lượng bazơ nitơ bay hơi tăng liên tục theo thời gian và gần đạt mức giới hạn không cho phép sử dụng làm thực phẩm sau 4h (28,7±0,5 mg/100g so với mức giới hạn là 30mg/100g); Cùng với sự biến đổi xấu về chất lượng còn có sự hao hụt đáng kể về khối lượng tổng và hao hụt protein (tương ứng 5,08±1,26% và 15,59±0,44% sau 4h). Việc xử lý sớm phần đầu tôm, không muộn hơn 4h, sẽ giúp hạn chế mức độ tổn thất, biến đổi chất lượng và ô nhiễm môi trường. 50 Tû lÖ hao hôt so víi ban ®Çu (%) F Hao hut khèi l­îng Hao hôt Protein Baz¬ nit¬ 20 E DE 40 E D 15 30 10 cd C 5 B A bc b 20 d bcd 10 a a a 0 Hµm l­îng baz¬ nit¬ bay h¬i (mg/100g) 25 0 0 2 4 6 8 Thêi gian chê (h) Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ ở nhiệt độ phòng (27-30oC) đến sự hao hụt khối lượng, hao hụt protein và hàm lượng bazơ nitơ bay hơi của phần đầu tôm thẻ chân trắng 3.2.2. Nghiên cứu chế độ thu hồi protein và chitin từ đầu tôm thẻ chân trắng Kết quả thu được ứng với mẫu 0h ở Hình 3.2 và Hình 3.3 cho thấy chỉ cần sử dụng lực cơ học để đánh đảo mạnh đầu tôm trong 2 phút và lọc qua rây có mắt lưới 1mm đã có thể phân riêng đầu tôm thành 2 phần: phần dịch protein và phần vỏ giáp của đầu tôm (được gọi tắt là vỏ đầu). Phần dịch thu được có chứa trên 70% lượng protein của toàn bộ đầu tôm và phần vỏ đầu chỉ chiếm 7,45± 1,89% so với tổng khối lượng đầu tôm và có hàm lượng protein trên 20% (so với khối lượng chất khô). 4.3 80 cd cde cd a a a e e cde bcd bc e 4.2 4.1 ab a 4.0 70 3.9 60 3.8 50 3.7 40 3.6 30 3.5 Hµm l­îng protein cßn l¹i (%) HiÖu suÊt thu håi Nit¬ (%) 90 Tû lÖ thu nhËn s¶n phÈm cã ho¹t tÝnh chèng oxy hãa (%) 22 e a a 92 a 90 b 20 b 88 86 18 bc bcd 84 cde 16 def ef ef 82 ef 14 f g 12 78 g 10 1 2 3 4 Thêi gian (h) HiÖu suÊt thu håi nit¬ ë tû lÖ N­íc: NL 1:0 HiÖu suÊt thu håi nit¬ ë tû lÖ n­íc: NL 1:1 HiÖu suÊt thu håi nit¬ ë tû lÖ n­íc: NL 1:2 Tû lÖ thu nhËn s¶n phÈm ë tû lÖ n­íc:NL 0:1 Tû lÖ thu nhËn s¶n phÈm ë tû lÖ n­íc:NL 1:1 Tû lÖ thu nhËn s¶n phÈm ë tû lÖ n­íc: NL 2:1 Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian và lượng nước bổ sung đến hiệu suất thu hồi nitơ và sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa khi thực hiện quá trình tự thủy phân đầu tôm ở 60oC, pH tự nhiên 76 74 8 0 80 HiÖu qu¶ khö protein (%) 100 72 0 1 2 3 4 Thêi gian (h) HL Protein ë tû lÖ NL:N­íc1:0 HL Protein ë tû lÖ NL:N­íc 1:1 HL Protein ë tû lÖ NL: N­íc 1:2 HQK Protein ë tûlÖ NL:N­íc 1:0 HQK Protein ë tû lÖ NL: N­íc 1:1 HQK Protein ë tû lÖ NL:N­íc 1:2 Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian và lượng nước bổ sung đến hàm lượng protein còn lại trên phần vỏ đầu và hiệu quả khử protein khi thực hiện quá trình tự thủy phân đầu tôm ở 60oC, pH tự nhiên. Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê với p<0,05 8 Tuy nhiên, khi kết hợp với quá trình tự thủy phân, hiệu suất thu hồi protein của phần dịch và mức độ tinh sạch của phần vỏ đầu sẽ được nâng cao một cách đáng kể so với chỉ thực hiện đánh đảo. Theo chiều tăng của thời gian tự thủy phân, hiệu suất thu hồi nitơ, tỷ lệ thu nhận sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa, và khả năng khử protein trên vỏ đầu đều tăng ở tất cả các tỷ lệ nước bổ sung. Tuy nhiên, ở chế độ thủy phân có tỷ lệ nước bổ sung so với nguyên liệu là 1:1 hiệu quả thu hồi protein có xu hướng cao hơn so với ở tỷ lệ 0:1 và 2:1 (ở cả hiệu suất thu hồi nitơ và tỷ lệ thu nhận sản phẩm có khả năng chống oxy hóa), đồng thời lượng protein còn lại trên vỏ đầu cũng đạt giá trị thấp nhất. Sản phẩm thủy phân sau 2h với chế độ bổ sung nước: NL là 1:1 cũng có khả năng khử gốc tự do DPPH cao nhất (Hình 3.5). Khi kéo dài thời gian thủy phân sau 2h, hiệu quả thu hồi protein và khả năng khử protein của mẫu có tỷ lệ nước bổ sung 1:1 không còn tăng đáng kể và khả năng chống L­îng DPPH bÞ khö (M/g nguyªn liÖu) 1.2 A a 1.0 b b cdefbcdef 0.8 bcd bc bcde bcdef bcde bcd bcdef f def ef 0.6 0.4 0.2 0.0 Møc ®é hÊp phô quang häc ë b­íc sãng 700nm oxy hóa có xu hướng giảm. 0.18 B a ab 0.16 0.14 abc 1 2 Thêi gian (h) 3 abcd cde 0.12 abc abcde abcde bcde cde 0.10 cde de e 0.08 0.06 0.04 0 0 abc a 1 2 3 4 4 Thêi gian (h) Tû lÖ NL:N­íc 1:0 Tû lÖ NL:N­íc 1:1 Tû lÖ NL:N­íc 1:2 Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian và tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng khử gốc tự do DPPH (A) và tổng năng lực khử (B) của dịch thủy phân. Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê với p<0,05. Phần vỏ đầu thu được sau khi thực hiện quá trình tự thủy phân ở chế độ tối ưu (nhiệt độ 60oC, tỷ lệ NL:nước 1:1, trong 2h, ở pH tự nhiên) và được tách bằng lực cơ học có hàm lượng protein 13,78± 0,75%, khoáng 34,23±0,2% % (khối lượng chất khô) sẽ được tiếp tục xử lý để thu chitin. Dựa vào kết quả nghiên cứu của các tác giả đi trước, chế độ xử lý tiếp theo cho phần vỏ đầu được đề xuất là: xử lý HCl 0,25M trong 12h ở nhiệt độ phòng và xử lý với NaOH 1% trong 8h ở 70oC. Chitin thu được sau xử lý với chế độ đề xuất có có hàm lượng protein và khoáng đều thấp hơn 1% (0,59 ± 0,17% và 0,45±0,12%, tương ứng). Tóm lại, thực hiện chế độ tự thủy phân ở điều kiện thích hợp (tỷ lệ NL:nước là 1:1, thời gian thủy phân 2h ở nhiệt độ 60oC và pH tự nhiên) đồng thời kết hợp với sử dụng lực cơ học để đánh đảo và lọc cho phép thu hồi dịch thủy phân protein có hoạt tính chống oxy hóa cùng với chitin từ đầu tôm thẻ chân trắng tươi một cách hiệu quả: hiệu suất thu hồi nitơ đạt khoảng 86,19±1,67%, tỷ lệ thu nhận sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa khoảng 4,09±0,12%, đồng thời giảm được trên 90% lượng nguyên liệu cần xử lý hóa chất khi thu hồi chitin. Tuy nhiên cần có thêm các nghiên cứu toàn diện hơn về hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein thu được cũng như tìm kiếm các giải pháp tinh chế để thương mại hóa sản phẩm thủy phân protein. 3.3. Thu hồi chitin và dịch thủy phân protein có hoạt tính sinh học từ vỏ tôm thẻ chân trắng 3.3.1. Thiết lập chế độ xử lý với HCl Kết quả theo dõi sự biến đổi hàm lượng khoáng và lượng khoáng còn lại trên vỏ tôm theo thời gian xử lý với HCl ở Hình 3.6 cho thấy quá trình khử khoáng chủ yếu diễn ra trong 2h đầu, với khoảng 96% lượng khoáng được loại bỏ, khoảng thời gian sau 2h chỉ khử thêm một lượng khoáng không đáng kể, tốc độ khử khoáng dần đạt đến giá trị giới hạn sau 10h, đồng thời, đã có khoảng 30% lượng protein bị loại bỏ cùng với khoáng; hàm lượng protein và khoáng còn lại lần lượt là 32,26% và 2,61% (so với khối lượng chất khô). Khi 96% khoáng có 9 trong vỏ tôm đã bị khử pH của hệ cũng đạt đến sự ổn định (dao động quanh giá trị pH=1,77±0,06). Do đó, chế độ khử khoáng được lựa chọn như sau: xử lý với dd HCl 0,25M ở nhiệt độ phòng trong 2h với tỷ lệ dd HCl:vỏ tôm là 4:1(v/w). 30 90 HiÖu qu¶ khö kho¸ng (%) Hµm l­îng kho¸ng cßn l¹i (%) 100 25 20 80 Hµm l­îng kho¸ng cßn l¹i HiÖu qu¶ khö kho¸ng 15 10 70 60 5 50 0 40 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Thêi gian (h) Hình 3.6: Sự thay đổi hàm lượng khoáng và hiệu quả khử khoáng khi xử lý vỏ tôm với HCl 0,25M theo thời gian ở nhiệt độ phòng (27-30oC) 3.3.2. Đánh giá khả năng sử dụng pepsin Kết quả ở Hình 3.7 cho thấy hoạt động xúc tác của pepsin làm tăng đáng kể hiệu quả khử protein và khử khoáng, mức độ gia tăng phụ thuộc lượng enzyme sử dụng. Ở tỷ lệ 5U/g protein, có thêm khoảng 40% protein và 20% khoáng được khử so với mẫu đối chứng và khi tỷ lệ là 25U/g protein thì khả năng khử protein và khử khoáng đạt mức ổn định, tương ứng với hiệu quả khử 85,93±0,25% và 90,34±0,9%. Nếu tính cả hiệu quả khử có được do xử lý với HCl, tổng hiệu quả khử protein và khử khoáng lên đến 91,16±0,65%; và 99,79± 0,02%, tương ứng. Mặc dù mức độ khử khoáng tổng tăng không nhiều giữa mẫu đối chứng và mẫu có sử dụng pepsin nhưng sự gia tăng đó lại có ý nghĩa quan trọng ở chỗ góp phần khử triệt để lượng khoáng trong vỏ tôm, đưa hàm lượng khoáng còn lại xuống dưới mức 1%, đáp ứng yêu cầu của chitin chất lượng cao. 120 HiÖu qu¶ khö (%) 100 80 60 HQK protein tõ qu¸ tr×nh xö lý víi Pepsin HQK kho¸ng tõ qu¸ tr×nh xö lý víi Pepsin HQK protein tæng HQK kho¸ng tæng 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Nång ®é Pepsin bæ sung (U/g protein) Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ pepsin đến hiệu quả khử protein và khử khoáng A B Hình 3.8: Ảnh chụp SEM (20kV) vỏ tôm trước (A) và sau khi xử lý với dung dịch HCl 0,25M trong 2h (B) 10 Ảnh chụp cấu trúc vỏ tôm sau khi xử lý với HCl bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) ở Hình 3.8 cho thấy sau khi xử lý với acid HCl vỏ tôm có cấu trúc xốp hơn với sự xuất hiện nhiều khoảng trống; Điều này đã giúp cho các phân tử pepsin có điều kiện xâm nhập, tiếp xúc sâu hơn vào cấu trúc của vỏ tôm. 3.3.3. Tối ưu quá trình xử lý với pepsin Tiến hành xử lý số liệu thực nghiệm ở Bảng 3.8 bằng phương pháp mặt đáp ứng trên phần mềm DX 8.0.7 thu được mô hình hồi qui bậc 2 biểu diễn mối quan hệ giữa hiệu quả khử protein và các biến độc lập nhiệt độ (30-40oC), tỷ lệ enzyme (5-25U/gprotein) và thời gian (6-18h) ở Phương trình (3-2). = 73,37 + 16,3X1 + 7,73X2 + 8,62X3 + 4,47X1X2 + 2,97X1X3 –7,17X12 – 6,26X22 – 8,90X32 (Phương trình 3-2) Trong đó: là hiệu quả khử protein dự đoán; X1, X2, X3 lần lượt là giá trị mã hóa của biến nhiệt độ, tỷ lệ enzyme và thời gian. Trong Phương trình (3-2), hàm mục tiêu tỷ lệ nghịch với biến bình phương của nhiệt độ, bình phương của tỷ lệ enzyme và bình phương của thời gian do đó có đồ thị biểu diễn là dạng mặt parabol lồi và sẽ tồn tại giá trị cực đại của hàm mục tiêu. Các kết quả phân tích thống kê thu được chứng tỏ giữa hàm hồi qui thu được và các biến độc lập có mức độ phù hợp và tương quan cao: hệ số tương quan (R-square) và hệ số tương quan hiệu chỉnh (R square-adjusted) đều trên 0,99; giá trị p của kiểm định mức độ không phù hợp lớn hơn 0,47. Với hệ số tương quan dự đoán, Pred-RSquared, bằng 0,958 Phương trình (3-2) có thể dự đoán chính xác 95,8% kết quả so với thực nghiệm. Kết quả ở Bảng 3.9 cũng cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa kết quả tính toán từ Phương trình (3-2) với kết quả thu được từ thực nghiệm. Điều này một lần nữa khẳng định độ tin cậy của phương trình hồi qui đã thu được và hoàn toàn có thể sử dụng Phương trình (3-2) để kiểm soát, điều khiển và dự đoán hiệu quả khử protein đạt được khi áp dụng quá trình xử lý vỏ tôm bằng pepsin vào thực tiễn. Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm theo mô hình Box-Behnken No 1 2 3 4 5 6 7 8 X1, o C -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 X2, U/g.protein X3, h Y, (%)* No X1, oC X2, U/g.protein X3, h Y, (%)* -1 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 1 41,89 65,30 45,64 86,95 34,99 61,91 46,77 85,55 9 10 11 12 13 14 15 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 -1 -1 1 1 0 0 0 41,08 58,57 57,11 76,09 73,15 73,17 73,76 * Số liệu trình bày là trung bình cộng của 3 lần lặp Bảng 3.9: Hiệu quả khử protein của pepsin theo phương trình hồi qui và theo thực nghiệm Điều kiện Hiệu quả khử protein (%) X1=40 C ; X2= 10U/g.pro; X3=15h X1=40oC ; X2= 12,5U/g.pro; X3=14h X1=40oC ; X2= 15U/g.pro; X3=15h X1=40oC ; X2= 15U/g.pro; X3=16h X1=40oC ; X2= 20U/g.pro; X3=16h Từ thực nghiệm* Từ phương trình 82,41 ± 0,97 81,25 86,58 ± 0,51 85,39 89,87 ± 0,19 89,52 90,22 ± 0,14 89,74 93,29 ± 0,16 92,48 STT 1 2 3 4 5 o * Số liệu trình bày là trung bình cộng của 3 lần lặp Chế độ xử lý pepsin tối ưu cho đối tượng vỏ tôm thẻ chân trắng (đã qua khử khoáng với dd HCl 0,25 M) như sau: nhiệt độ 40oC, thời gian 16h, nồng độ enzyme bổ sung 20U/g protein, ở pH=2; với chế độ này khoảng 92% lượng protein đã bị loại, hàm lượng protein và khoáng còn lại tương ứng là 8,2±1,6% và 0,56±0,04%. 11 3.3.4. Khả năng kết hợp sóng siêu âm và pepsin trong quá trình thu nhận chitin Kết quả ở Hình 3.12 cho thấy thời gian chiếu sóng siêu âm (37kHz, RMS=35W) có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hoạt động của pepsin, cụ thể trong vòng 25 phút đầu, sóng siêu âm có xu hướng làm tăng khả năng hoạt động của pepsin, mức độ gia tăng hoạt độ cao nhất đạt được khoảng 8% sau khoảng 20-25 phút chiếu sóng nhưng khi kéo dài thời gian chiếu sóng thì hoạt độ của pepsin lại có xu hướng giảm (p<0,05), sau 40 phút chiếu sóng liên tục thì hoạt độ của pepsin không còn có sự khác biệt so với mẫu đối chứng (p>0,05) và nếu kéo dài trên 40 phút, khả năng hoạt động của pepsin sẽ thấp hơn so mẫu không chiếu siêu âm (p<0,05). 46 35 Cã sãng siªu ©m Kh«ng cã sãng siªu ©m 11 a Hµm l­îng protein cßn l¹i (%) Ho¹t ®é enzyme (U/mg) 44 42 40 38 30 10 b bc 9 cde bcd 25 def def 20 fg fg 8 g 7 6 15 8 10 12 14 16 10 5 36 0 0 20 40 60 80 2 100 4 6 8 10 12 14 16 Thêi gian (h) Thêi gian (phót) Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sóng siêu âm (37kHz, 35W) đến hoạt độ của pepsin Kh«ng tiÒn xö lý Pepsin TiÒn xö lý Pepsin víi sãng siªu ©m Hình 3.17: Ảnh hưởng của công đoạn tiền xử lý pepsin với sóng siêu âm đến khả năng loại protein trên vỏ tôm (20U/g protein, 40oC, pH=2). Các chữ cái khác nhau biểu hiện sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê với p<0,05. Đồ thị ở Hình 3.17 cho thấy sau 14h xử lý ở điều kiện nhiệt độ và nồng độ enzyme tối ưu, hiệu quả khử protein với pepsin đã được tiền xử lý 25 phút với sóng siêu âm tần số 37kHz (RMS 35W) tương đương với hiệu quả đạt được sau 16h xử lý với pepsin không được tiền xử lý và việc kéo dài thời gian xử lý lên16h không làm giảm hàm lượng protein còn lại một cách đáng kể (Hình 3.17, ảnh nhỏ). Như vậy, tiền xử lý pepsin trong 25 phút trước khi thực hiện quá trình xử lý vỏ tôm sẽ giúp rút ngắn thời gian khử protein 2h. 3.3.5. Hoàn thiện qui trình thu nhận chitin và protein từ vỏ tôm thẻ chân trắng theo công nghệ đề xuất Sau khi thực hiện chế độ khử protein lần 2 với dd NaOH 1%, trong 8h ở 70oC, tỷ lệ dd NaOH:NL=2:1 chitin thu được từ qui trình có sử dụng pepsin có độ tinh sạch cao (hàm lượng tro và protein đều dưới <1%, tương ứng là 0,56±0,04% và 0,79±0,02%); cấu trúc mạch polysacchride hầu như ít bị ảnh hưởng (DA= 97,01±0,85% và phân tử lượng trung bình theo độ nhớt Mv= 1652Da); Sản phẩm thu được rất phù hợp để sản xuất các dẫn xuất có giá trị sinh học và thương mại cao từ chitin như N-acetyl glucosamine. Dịch thủy phân protein thu được từ quá trình xử với pepsin cũng có thể thu hồi để sản xuất các chế phẩm có hoạt tính chống oxy hóa, hiệu suất thu hồi đạt khoảng 3,52±1,54% (Bảng 3.10). Bảng 3.10: Kết quả đánh giá khả năng thu hồi protein từ dịch thủy phân với pepsin Khả năng thu hồi nitơa (%) Tỷ lệ thu hồi chế phẩm có hoạt tính chống oxy hóab (%) 64,2±2,7 3,52±1,54 a Chỉ tiêu Khả năng chống oxy hóa dd chế phẩm có nồng độ 1mg/ml DPPH (mM) 0,13±0,01 TNLK (OD700nm ) 0,1640±0,015 So với dd BHA (1mg/ml) (%) DPPH TNLK 46,79±4,19 46,02±1,67 So với lượng nitơ trong nguyên liệu ban đầu; b So với khối lượng nguyên liệu ban đầu. 3.4. Động học quá trình khử protein của pepsin 12 Đại lượng ln(P/Po) (với P là lượng protein còn lại theo thời gian và Po là lượng protein ở thời điểm ban đầu) có mối quan hệ tuyến tính với thời gian với hệ số tương quan R luôn đạt 0,99 (Hình 3.22). Kết quả này cho phép khẳng định quá trình loại protein dưới tác dụng của pepsin tuân theo phản ứng giả bậc nhất (Pseudo-first order) và có thể đặc trưng bằng phương trình vi phân có dạng: dP/dt = -kP, trong đó P biểu diễn lượng protein còn lại theo thời gian và k là hằng số vận tốc của phản ứng. 0.0 k1 Ln (P/Po) -0.5 -1.0 k2 -1.5 -2.0 k3 -2.5 -3.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Thêi gian (h) Hình 3.22: Sự thay đổi giá trị logarith của tỷ số (P/Po) theo thời gian xử lý với pepsin ở điều kiện nhiệt độ 40oC, pH2, nồng độ enzym 0.42g/L, với P là lượng protein còn lại theo thời gian (g), Po là lượng protein ở thời điểm ban đầu (g) Số liệu ở Bảng 3.11 cho thấy có sự thay đổi đột ngột của hằng số vận tốc ở các giai đoạn khử protein, giá trị của hệ số vận tốc khử protein ở các giai đoạn 1 (0-2h), giai đoạn 2 (2-8h) và giai đoạn 3 (8-24h) lần lượt là k1= 7,2.10-2, k2=3,05.10-2, k3=6,510-3(phút-1). So với giai đoạn 1, hệ số vận tốc ở giai đoạn 2 đã giảm một nửa và ở giai đoạn 3 chỉ còn khoảng 1/10. Sự thay đổi đột ngột về hằng số vận tốc của phản ứng chứng tỏ có sự khác nhau về mức độ liên kết giữa protein và chitin giữa các lớp trong cấu trúc vỏ tôm. Động học quá trình loại protein bằng NaOH cũng có xu hướng tương tự, tuy nhiên, có sự khác nhau về thời điểm xảy ra sự thay đổi và độ lớn của giá trị hằng số vận tốc. Trong trường hợp khử protein với NaOH, kết quả nghiên cứu của Percot (2003) cho thấy hệ số vận tốc khử thay đổi tại mốc thời gian 30 phút và 8h đồng thời hệ số vận tốc ở giai đoạn 1 (0-30 phút) cao hơn đáng kể so với trường hợp của pepsin nhưng lại bằng/hoặc giảm 1/2 ở giai đoạn 2 (30 phút 8h), tùy thuộc nhiệt độ, và thấp hơn rất đáng kể ở giai đoạn 3 (Bảng 3.11). Bảng 3.11: Hằng số vận tốc quá trình loại protein khi xử lý với pepsin và NaOH Hằng số tốc độ k1 (10-2phút -1) k2 (10-3phút -1) k3 (10-4phút -1) * Xử lý với Pepsin* ([E] =0,42 g/L, E/S = 1,68/1000 g/g) 40oC 0,72 ± 0,09 3,05 ± 0,57 6,50± 0,01 Xử lý với NaOH** (1M, 15mL/g) 50oC 70oC 2,10 ± 0,04 2,68 ± 0,05 3,12 ± 0,16 1,52 ± 0,08 0,48 ± 0,10 1,53 ± 0,27 Số liệu trình bày là kết quả của 3 lần lặp; ** Kết quả theo công bố của tác giả (Percot, 2003) Quá trình khử protein dưới tác dụng xúc tác của pepsin diễn ra chủ yếu trong 2h đầu; Kết quả phân tích động học kết hợp với phân tích hồi qui cho thấy hiệu quả khử (DP) và vận tốc khử (r) ở giai đoạn này tuân theo Phương trình (3-9) và Phương trình (3-10), tương ứng và giá trị của hằng số vận tốc k2 = 40,983 (min-1) và kd (=k3*Km) = 1,535 (min-1). (Phương trình 3-9) (Phương trình 3-10) 3.5. Nâng cao hiệu quả deacetyl trong điều kiện dị thể 3.5.1. Tác dụng hỗ trợ của công đoạn tiền xử lý 13 Đồ thị ở Hình 3.27 cho thấy quá trình tiền xử lý đã có tác dụng tăng cường khả năng deacetyl rất đáng kể. Độ deacetyl của các mẫu được tiền xử lý với nước nóng và sóng siêu âm cao hơn gần 20% so với mẫu không được tiền xử lý khi cùng được deacetyl theo cách truyền thống với NaOH 60% (w/w) trong 3h. Tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa về độ deacetyl đạt được giữa 02 cách thức tiền xử lý đã thực hiện (p>0,05). 100 90 ChiÕu siªu ©m Ng©m n­íc nãng Kh«ng xö lý a DD (%) a 80 b 70 60 50 MÉu Hình 3.27: Ảnh hưởng của cách thức tiền xử lý đến khả năng deacetyl. Các chữ cái khác nhau biểu hiện sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê với p<0,05. Kết quả chụp SEM ở Hình 3.28 cho thấy bề mặt mẫu chitin được tiền xử lý với sóng siêu âm có nhiều nếp nhăn hơn so với bề mặt của mẫu chỉ ngâm nước nóng và kết quả xử lý số liệu đo phổ nhiễu xạ tia X trên phần mềm Origin Pro 8.0 trình bày ở Bảng 3.13 cho thấy so với mẫu chitin không được tiền xử lý, độ rắn tổng (χcr) của chitin sau khi tiền xử lý với sóng siêu âm và nước nóng ở nghiên cứu này giảm tương ứng 1,38 và 2,54%. Như vậy, thực hiện tiền xử lý chitin thu nhận từ vỏ tôm thẻ chân trắng giúp giảm tỷ lệ vùng kết tinh và tăng hiệu quả deacetyl, chế độ tiền xử lý được đề xuất là ngâm nước nóng 60oC trong 60 phút. A B Hình 3.28: Ảnh chụp SEM (10kV) mẫu chitin đã được xử lý trong 60 phút ở 60oC với nước nóng (A) và chiếu siêu âm (B). Bảng 3.13: Độ rắn của chitin sau khi được tiền xử lý và mẫu đối chứng Mẫu chitin Không xử lý Xử lý với nước nóng Xử lý với sóng siêu âm CrI020 (%) 90,09 88,68 90,13 CrI110 (%) 95,85 95,05 95,97 χcr (%) 74,12 71,58 72,74 3.5.2. Đánh giá khả năng hỗ trợ quá trình deacetyl của sóng siêu âm Đồ thị ở Hình 3.30 cho thấy sóng siêu âm có mức độ ảnh hưởng khác nhau đến độ deactyl và độ hòa tan trong dải nồng độ khảo sát (35-65%, w/w). Tác động của sóng siêu âm đến độ deacetyl thể hiện rõ rệt khi nồng độ NaOH ≤45%. Khi nồng độ NaOH sử dụng ≤45%, DD của mẫu được deacetyl trong điều kiện có sóng siêu âm cao hơn rất đáng kể (p<0,05) so với mẫu đối chứng, không có sóng siêu âm, và giá trị DD đạt được tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ nhưng khi nồng độ NaOH ≥50% sự ảnh hưởng của sóng siêu âm và nồng độ thể hiện không rõ rệt, độ deacetyl ở các mẫu chênh lệch không đáng kể (p>0,05). Trong cùng điều kiện về nồng độ và thời gian, độ hòa tan của mẫu được deacetyl trong điều kiện có sóng luôn cao hơn đáng kể so với mẫu đối chứng. Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng giảm theo chiều tăng của nồng độ và khi nồng độ NaOH=65% thì không có sự 14 khác biệt đáng kể (p>0,05). So với độ deacetyl, sóng siêu âm có ảnh hưởng lớn hơn đến độ hòa tan, mức độ ảnh hưởng được duy trì ngay cả khi nồng độ NaOH = 60%. 90 d e fg efg ef g efg 100 efg hf hi g ij h 50 55 60 j ij B c 70 §é Deacetyl (%) efg A 80 §é hßa tan (%) 80 60 50 a a e c c 60 40 40 b a b 30 20 20 35 40 45 50 55 60 65 35 40 Nång ®é NaOH (%, w/w) 45 65 Nång ®é NaOH (%, w/w) Cã sö dông sãng siªu ©m Kh«ng cã sãng siªu ©m Hình 3.30: Ảnh hưởng của nồng độ NaOH và phương thức deacetyl đến độ deacetyl và độ hòa tan của mẫu sau 6h xử lý ở 80oC. Các chữ cái khác nhau biểu hiện sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê với p<0,05 Tính chất của chitosan thu được trong điều kiện deacetyl có và không có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (80 C, 4h, NaOH=60%, w/w) được đặc trưng bằng phổ nhiễu xạ tia X và phổ FT-IR. Kết quả phân tích phổ o nhiễu xạ tia X ở Hình 3.31 cho thấy có sự dịch chuyển nhẹ góc phản xạ tại vị trí 020, từ 2θ=9,54o sang 2θ=10,08o kèm theo sự giảm nhẹ về mức độ kết tinh ở chitosan được deacetyl sau 4h trong điều kiện có siêu âm Lin (counts) so với chitosan được deacetyl theo cách truyền thống (độ rắn tổng 71,38% so với 72,81%, tương ứng). A 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 10.08273 20.1758 38.59359 Lin (counts) 0 10 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 20 30 40 50 2THETA 9.54498 B 20.21717 0 10 20 30 40 50 2THETA 55 50 3800 3500 3200 2900 2600 2300 2000 1800 1600 Wavenumber cm-1 1400 1200 1000 900 800 669.51 630.70 612.42 583.04 543.54 531.02 798.13 773.65 896.01 1030.95 1082.15 1154.35 1262.14 1321.87 1421.75 1380.14 1657.23 2922.26 3448.70 40 45 Transmittance [%] 60 65 Hình 3.31: Phổ nhiễu xạ tia X của chitosan được deacetyl trong điều kiện có (A) và không có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (B) với [NaOH]=60% ở 80oC, 4h. 700 600 500 Hình 3.32: Phổ FT-IR của chitosan được deacetyl với [NaOH]=60% (w/w) ở 80oC trong 4h trong điều kiện có (đường màu đỏ) và không có sự kết hợp với sóng siêu âm (đường màu đen). 15 Phổ FT-IR của chitosan được deacetyl trong điều kiện có và không có sóng siêu âm ở Hình 3.32 có các peak đặc trưng cho chitosan theo mô tả của Rinaudo (2006) và khá tương đồng nhau. Điều này chứng tỏ sóng siêu âm có tần số 37kHz (35W) không có tác động đáng kể nào đến các liên kết hóa học trong phân tử chitosan. Tuy nhiên phổ FT-IR của chitosan thu được trong điều kiện có sóng siêu âm có cường độ hấp phụ tại vị trí 1560 và 1312 cm-1 (tương ứng với amide II và amide III) giảm và peak ở vị trí 1415cm-1 sắc nhọn hơn, điều này khẳng định sự có mặt của sóng siêu âm đã giúp đạt được độ deacetyl cao hơn. 3.5.3. Động học quá trình deacetyl khi có sự hỗ trợ của sóng siêu âm Sự thay đổi giá trị DD khi deacetyl trong điều kiện có và không kết hợp với sóng siêu âm (37kHz, RMS 35W) theo thời gian với dải nồng độ NaOH từ 35-60% (w/w) có cùng xu hướng: tăng theo thời gian xử lý và tiến dần đến một giới hạn ổn định; Thời điểm đạt được độ deactyl cao nhất tỷ lệ nghịch với nồng độ NaOH sử dụng: nồng độ càng tăng, thời điểm đạt giá trị DD ổn định càng đến sớm, ngoại trừ trường hợp deacetyl ở nồng độ 35%. Tuy nhiên, ở cùng điều kiện về nồng độ NaOH và thời gian, các mẫu được deacetyl khi có sóng siêu âm luôn đạt đến giá trị ổn định sớm hơn và có giá trị cao hơn (Hình 3.33). 80 50 100 40 80 20 DD (%) DD (%) DD (%) 60 30 40 60 40 20 10 0 0 0 60 120 180 240 300 C 0 0 360 60 120 180 240 300 360 0 60 Thêi gian (phót) Thêi gian (phót) 100 100 80 80 DD (%) DD (%) 20 B A 60 40 120 180 240 300 360 Thêi gian (phót) 60 Kh«ng cã sãng siªu ©m Cã sãng siªu ©m 40 20 20 D E 0 0 0 60 120 180 240 300 0 360 60 120 180 240 300 360 Thêi gian (phót) Thêi gian (phót) Hình 3.33: Sự thay đổi của độ deacetyl theo thời gian deacetyl trong điều kiện có và không có siêu âm với các nồng độ NaOH (w/w) khác nhau (A) 35%, (B) 40%, (C) 45%, (D) 50% và (E) 60%. Giá trị biểu diễn là trung bình cộng của 3 lần lặp. Bảng 3.16: Vận tốc deacetyl (%/phút) (x102)a Chế độ deacetyl Nồng độ NaOH (%) (w/w) Giai đoạnb Không có sóng siêu âm 35 a Xử lý với sóng siêu âm 40 45 50 60 35 40 45 50 60 1 18,58 44,53 173,58 271,19 311,32 78,58 196,35 252,32 355,94 416,37 2 54,41 63,81 51,87 49,23 59,66 55,58 50,62 42,19 37,62 37,51 3 2,25 11,30 10,76 4,96 3,14 1,61 8,43 8,70 2,56 1,41 4 0,24 8,08 3,90 3,24 1,87 0,16 3,77 6,55 3,53 1,88 Giá trị biểu diễn là giá trị trung bình của 3 lần lặp; bGiai đoạn: 1 (0-15 phút); 2 (15-60 phút); 3 (60-240 phút); 4 (240 -360 phút) Giá trị vận tốc deacetyl ở Bảng 3.16 cho thấy tốc độ phản ứng giảm dần theo thời gian và chủ yếu diễn ra trong 1 giờ đầu, đặc biệt là ở 15 phút đầu tiên. Ở giai đoạn 1 (0-15 phút), vận tốc phản ứng deacetyl luôn tăng khi tăng nồng độ NaOH và khi được hỗ trợ bởi sóng siêu âm nhưng trái lại ở các giai đoạn sau (2, 3 và 4), vận 16 tốc deacetyl lại có xu hướng giảm khi có mặt sóng siêu âm và/hoặc khi nồng độ NaOH sử dụng cao hơn, ngoại trừ trường hợp [NaOH]=35%. Số liệu cũng cho thấy quá trình deacetyl diễn ra rất chậm sau 4 giờ và đặc biệt ở nồng độ NaOH ≤35% thì hầu như không diễn ra, kể cả khi có mặt sóng siêu âm. Phản ứng deacetyl trong điều kiện có và không có sóng siêu âm đều tuân theo phương trình giả bậc nhất, có dạng dX/dt = k* X, với X là độ deacetyl ở thời điểm t và k là hệ số vận tốc deacetyl; tuy nhiên giá trị của hệ số vận tốc k thay đổi theo nồng độ NaOH, sự tham gia của sóng siêu âm và thời gian với xu hướng tương tự như đã quan sát được ở vận tốc deacetyl nêu trên (Bảng 3.17) Bảng 3.17: Hệ số vận tốc deacetyl (phút-1) (x103)a Chế độ deacetyl Nồng độ NaOH (%) (w/w) Giai đoạnb Không có sóng siêu âm 35 a Xử lý với sóng siêu âm 40 45 50 60 35 40 45 50 60 1 43,81 78,11 151,36 178,58 187,19 106,36 158,77 174,11 195,62 205,55 2 36,78 30,63 13,11 9,12 9,60 22,01 11,82 8,48 5,83 5,10 3 0,70 2,36 1,75 0,71 0,40 0,39 1,35 1,29 0,34 0,17 4 0,07 1,27 0,53 0,42 0,22 0,04 0,52 0,82 0,44 0,22 Giá trị biểu diễn là giá trị trung bình của 3 lần lặp; bGiai đoạn: 1 (0-15 phút); 2 (15-60 phút); 3 (60-240 phút); 4 (240 -360 phút) Như vậy, sóng siêu âm (37kHz, 35W) giúp cho quá trình deacetyl được đẩy nhanh và diễn ra đồng đều hơn, cải thiện đáng kể độ hòa tan nhưng không làm thay đổi bản chất của quá trình deacetyl và không có ảnh hưởng đáng kể nào đến các liên kết hóa học trong phân tử chitosan so với khi deacetyl theo cách truyền thống. 3.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian đến độ deacetyl và độ hòa tan trong điều kiện deacetyl dị thể với sóng siêu âm Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (70-80oC), thời gian (2-6h), nồng độ (40-60%) theo mô hình yếu tố hai mức ở Bảng 3.19 và Bảng 3.20 cho thấy tất cả các biến đơn và biến tương tác giữa nồng độ với nhiệt độ và thời gian đều có ảnh hưởng đến độ deacetyl và độ hòa tan trong miền nghiên cứu; Trong đó biến nồng độ là biến có ảnh hưởng đáng kể nhất, với mức độ 26,73% đối với độ deacetyl và 52,65% đối với độ hòa tan. Yếu tố có tầm ảnh hưởng quan trọng sau nồng độ đến độ hòa tan là nhiệt độ nhưng trái lại là thời gian lại có ảnh hưởng lớn hơn nhiệt độ đối với độ deacetyl. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ hòa tan và độ deacetyl tương ứng là 11,10% và 3,73%; trong khi đó ảnh hưởng của thời gian là 5,85% và 10,13%, tương ứng. Bảng 3.19: Kết quả phân tích thống kê ảnh hưởng Bảng 3.20: Kết quả phân tích thống kê ảnh hưởng của các nhân tố đến độ deacetyl ( (p=0,05) của các nhân tố đến độ hòa tan ( (p=0,05) Biến X0 X1 X2 X3 X1X3 X2X3 Mức độ ảnh hưởng (%) 3,751 10,138 26,731 -1,967 -9,017 Hệ số hồi qui 70,080 1,875 5,069 13,365 -0,984 -4,509 Prob>F 0,001 0,001 0,001 0,001 0,004 0,001 Biến X0 X1 X2 X3 X1X3 X2X3 Mức độ ảnh hưởng (%) 11,100 5,850 52,650 -6,300 -3,650 Hệ số hồi qui 68,225 5,550 2,925 26,325 -3,150 -1,825 Prob>F 0,001 0,001 0,007 0,001 0,005 0,031 X1: Nhiệt độ (oC); X2:Thời gian (h); X3:Nồng độ (%); Mối quan hệ toán học biểu diễn sự tương quan giữa các biến độc lập đến độ deacetyl ( ) (%) và độ hòa tan ( ) (%) được trình bày ở Phương trình (3-11) và Phương trình (3-12) tương ứng. 70,081 + 1,875 X1 +5,069 X2 +13,365 X3 - 0,984 X1X3 - 4,509 X2X3 (Phương trình 3-11) 17 (Phương trình 3-12) = 68,225 + 5,55 X1 +2,925 X2 +26,325 X3 - 3,154 X1X3 - 1,825 X2X3 Kết quả phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ và thời gian đến hai hàm mục tiêu độ deacetyl và độ hòa tan bằng phương pháp mặt đáp ứng cho thấy để thu được sản phẩm có độ deacetyl trên 70% và độ hòa tan trên 85% thì chế độ deacetyl phải thực hiện ở nồng độ NaOH≥ 50%, thời gian không dưới 4h ở nhiệt độ 80oC. 3.5.5. Tối ưu quá trình deacetyl Tiến hành xử lý số liệu thực nghiệm thu được ở Bảng 3.21 bằng phương pháp mặt đáp ứng trên phần mềm MINITAB 16.1 thu được phương trình hồi qui cho hàm mục tiêu độ deacetyl ( ) (%) và hàm mục tiêu độ hòa tan ( ) (%) theo 2 biến độc lập: nồng độ (50-60%) và thời gian (4-8h) ở Phương trình (3-13) và Phương trình (3-14), tương ứng. (Phương trình 3-13) = 85,8035+ 3,0240 X1 +2,069 X2 - 1,2260X12 - 1,2865X22 -0,5759X1X2 2 (Phương trình 3-14) 2 = 96,5179+ 3,0600 X1 +1,3300 X2 +0,6400X1 - 0,5100X2 -1,2175X1X2 Bảng 3.21: Kết quả thực nghiệm theo mô hình Central Composite Độ hòa tan (%) 91,56 No -1 DD (%) 78,31 1 X1, % -1 2 +1 -1 85,41 100,00 9 +1 0 87,13 100,00 3 -1 +1 83,32 96,43 10 0 -1 81,60 94,12 4 +1 +1 88,12 100,00 11 0 +1 86,30 97,23 5 0 0 86,34 96,14 12 0 -1 85,95 95,78 97,13 13 0 0 84,94 95,78 97,45 14 0 0 85,76 96,76 No 6 7 0 0 X2, h 0 0 85,98 86,12 Độ hòa tan (%) 0 DD (%) 80,89 X1, % X2, h 8 0 93,65 X1: Nồng độ (%); X2:Thời gian (h) Kết quả kiểm định thống kê được tóm tắt ở Bảng 3.23 cho phép khẳng định độ tin cậy của Phương trình (3-13) và Phương trình (3-14). Hai phương trình này có thể giải thích 97,85% và 95,76% số liệu thực nghiệm thu được đối với hàm mục tiêu độ deacetyl và độ hòa tan, tương ứng. Bảng 3.23: Kết quả kiểm định thống kê phương trình hồi qui (3-13) và (3-14), (p=0,05) Hệ số kiểm định Độ deacety PRESS R-Sq (%) R-Sq(pred) (%) R-Sq(adj) (%) Mức độ không phù hợp Hàm mục tiêu , %) Độ hòa tan , %) 5,62 5,43 98,84 97,72 94,18 93,03 97,85 95,76 0,48 0,91 Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chế độ deacetyl đến phân tử lượng trung bình độ nhớt của chitosan (Mv, kDa) Điều kiện deacetyl Nhiệt độ (oC) Nồng độ NaOH (%) Thời gian (h) 0 2 4 6 8 * Phân tử lượng trung bình độ nhớt (Mv), (kDa) Có sóng Không sóng 80 70 80 50 60 50 50 60 1652, 00 592,61 468,53 421,82 377,37 1652,00 539,12 404,21 361,84 323,55 1652,00 473,26 - 1652,00 439,90 - 1652,00 378,53 - Số liệu biểu diễn là trung bình cộng của 2 lần lặp Do quá trình depolymer luôn diễn ra song song với quá trình deacetyl và có ảnh hưởng đến đặc tính của chitosan vì vậy việc nghiên cứu sự thay đổi phân tử lượng trong quá trình deacetyl đã được thực hiện. Kết quả ở 18 Bảng 3.25 cho thấy phân tử lượng trung bình độ nhớt của sản phẩm chitosan (Mv) phụ thuộc vào điều kiện deacetyl (nhiệt độ, thời gian, nồng độ và điều kiện có/không có sự hỗ trợ của sóng siêu âm). Trong cùng 6h xử lý với NaOH có nồng độ 60% (w/w) phân tử lượng trung bình độ nhớt của chitosan thu được khi deacetyl ở 70oC cao hơn đáng kể so với ở 80oC (473,26 so với 421,82kDa); chitosan thu được khi deacetyl truyền thống, không có mặt sóng siêu âm, có phân tử lượng cao hơn so với khi kết hợp với sóng siêu âm nhưng mức độ chênh lệch không quá lớn (439,90 và 378,53 kDa so với 421,82 và 361,84 kDa tương ứng với nồng độ 50 và 60% khi deacetyl ở 80oC trong 6h). Phân tử lượng của chitosan giảm theo chiều tăng của thời gian deacetyl nhưng mức độ giảm khác nhau ở giai đoạn trước và sau 2h. Phân tử lượng trung bình độ nhớt giảm khoảng 64-67% chỉ sau 2h (từ 1652kDa xuống còn 592,61 và 539,12 kDa tương ứng với nồng độ NaOH 50 và 60%) nhưng sau đó phân tử lượng có chiều hướng giảm chậm lại, so với thời điểm 2h deacetyl phân tử lượng trung bình độ nhớt chỉ giảm 20 và 25% tương ứng sau 6h và 8h deactyl ở cả nồng độ NaOH 50% và 60%. Phân tích hồi qui tuyến tính giá trị logarith phân tử lượng trung bình độ nhớt của chitosan thu được trong khoảng thời gian deacetyl từ 2-8h thấy rằng động học quá trình depolymer trong điều kiện có sóng siêu âm vẫn tuân theo phương trình bậc nhất (Hình 3.38) tương tự như khi deacetyl truyền thống. 2.9 y = 2,8198-0,0317*t (R=0,9573) y = 2,7800-0,0352*t (R=0,9363) NaOH 50% NaOH 60% Lg(Mv) 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2 4 6 8 Thêi gian (h) Hình 3.38: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian đến phân tử lượng trung bình độ nhớt của chitosan được deacetyl với sự hỗ trợ của sóng siêu âm. Phương trình (3-15) và (3-16) biểu diễn sự thay đổi phân tử lượng trung bình độ nhớt của chitosan theo thời gian khi deacetyl ở nhiệt độ 80oC với dung dịch NaOH 50% và 60%, tương ứng. Dựa vào hai phương trình này có thể xác định được thời gian deacetyl cần thực hiện để thu chitosan có phân tử lượng trung bình độ nhớt thỏa mãn yêu cầu. = 2,8501 - 0,0404*t (Phương trình 3-15) = 2,7767 - 0,0388*t (Phương trình 3-16) Như vậy, với 04 phương trình hồi qui thu được (từ Phương trình (3-13) đến (3-16)) có thể kiểm soát quá trình deacetyl ở 80oC với sóng siêu âm tần số 37kHz để thu chitosan có độ deacetyl, phân tử lượng và độ tan theo yêu cầu. 3.6. Đề xuất qui trình thu nhận chitin, chitosan và protein theo công nghệ cải tiến và đánh giá lợi ích 3.6.1. Qui trình thu nhận chitin, chitosan và protein theo công nghệ cải tiến đề xuất Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu đã thu được trong quá trình thực hiện luận án có thể khẳng định phương pháp thu hồi chitin, chitosan có sử dụng kết hợp phương pháp enzyme, phương pháp hóa học và vật lý có thể áp dụng để cải tiến công nghệ thu hồi chitin, chitosan từ nguyên liệu còn lại của quá trình chế biến tôm 19 thẻ chân trắng xuất khẩu. Qui trình thu hồi chitin, chitosan và protein dựa trên công nghệ này được đề xuất ở Hình 3.39, Hình 3.40 và Hình 3.41. Đầu tôm tươi sau khi đưa ra khỏi dây chuyền sản xuất sẽ được bổ sung lượng nước sạch theo tỷ lệ 1:1 (w/v), trộn đều và tiến hành tự thủy phân ở pH tự nhiên trong 2h ở nhiệt độ 60oC. Kết thúc thời gian thủy phân, hỗn hợp sẽ được đánh đảo mạnh trong 2 phút, tốc độ khoảng 1000 vòng/phút và chuyển sang thiết bị lọc với kích thước lỗ 1mm. Phần dịch sẽ được xử lý (lọc, ly tâm, tách cặn), sấy để thu chế phẩm thủy phân protein có hoạt tính chống oxy hóa và tùy theo mục đích sử dụng có thể được tinh chế tiếp theo. Phần bã (phần vỏ đầu) sẽ tiếp tục được xử lý để thu chitin. Để thu chitin, phần vỏ đầu được xử lý với dung dịch HCl 0,25M trong 12h ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ dd HCl so với vỏ đầu là 4:1 (v/w). Phần rắn sau xử lý sẽ được rửa sạch đến trung tính, vắt ráo và khử protein lần 2 với NaOH 1% trong 8h ở 70oC, thể tích dung dịch NaOH sử dụng so với lượng vỏ đầu là 2:1(v/w). Chitin thu được sau tinh sạch sẽ được rửa đến trung tính, làm khô đến độ ẩm <10% và bảo quản nơi khô ráo. Đầu tôm tươi Vỏ tôm tươi Tự thủy phân (2h, 60oC, pH tự nhiên, Tỷ lệ H2O:NL=1:1(v/w) Ép ráo Đánh đảo mạnh trong 2 phút, tốc độ khoảng 50 vòng/phút Lọc (Đường kính lỗ lọc khoảng 1mm) Dung dịch pepsin (20U/g protein) Xử lý HCl 0,25M trong 2h, ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ ddHCl:NL=4:1(v/w) Chiếu siêu âm (37kHz, RMS=35W, 25 phút) Rửa sạch, vắt ráo Thủy phân ở pH =2, trong 14h ở 40oC Vỏ đầu Dịch thủy phân protein Dịch thủy phân Xử lý với HCl 0,25M trong 12 h ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ ddHCl:NL=4:1(v/w) Sấy Sấy Thu sản phẩm Thu sản phẩm Bã Xử lý với NaOH 1%, trong 8h ở 70oC, tỷ lệ ddNaOH:NL=2:1 (v/w) Rửa trung tính Rửa đến trung tính Xử lý với NaOH 1%, 8h, 70oC, tỷ lệ ddNaOH:NL= 2:1(v/w) Phân riêng Phơi khô Rửa đến trung tính Làm khô Chitin Chitin Hình 3.39: Qui trình thu nhận chitin và protein từ phần đầu tôm thẻ chân trắng đề xuất Hình 3.40: Qui trình thu nhận chitin và protein từ phần vỏ tôm thẻ chân trắng đề xuất Vỏ tôm sau khi ép ráo sẽ được khử khoáng với HCl 0,25M ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ dung dịch HCl so với lượng vỏ tôm là 4:1 (v/w). Sau 2h, vớt phần rắn ra, rửa sạch vắt ráo và tiếp tục xử lý với pepsin. Bổ sung dung dịch có pH =2 vào hỗn hợp vỏ tôm đã khử khoáng ở trên theo tỷ lệ 3:1 (v/w), nâng hỗn hợp lên nhiệt độ 40oC và bổ sung pepsin theo tỷ lệ 20U/g protein. Duy trì ổn định nhiệt độ cho hỗn hợp ở 40oC trong 14 hoặc 16h, tương ứng với có hay không có tiền xử lý pepsin với sóng siêu âm (37kHz, RMS 35W) trong 25 phút ở 40oC. Khi kết thúc thời gian xử lý với pepsin tiến hành lọc để tách riêng phần dịch và phần rắn. Phần dịch được xử lý tương tự phần dịch thu được từ phần đầu ở trên để thu sản phẩm thủy phân protein có hoạt tính chống oxy hóa. Phần rắn sau khi rửa sạch đến trung tính và vắt ráo sẽ tiếp tục được khử protein lần 2 với NaOH 1% trong 8h ở 70oC; thể tích dung dịch NaOH sử dụng so với phần rắn là 2:1 (v/w). Kết thúc thời gian khử protein lần 2, chitin sẽ được rửa sạch đến trung tính, làm khô đến độ ẩm <10% và bảo quản nơi khô ráo Tùy thuộc vào mục đích sử dụng sẽ xác định được yêu cầu về độ deacetyl, độ hòa tan và phân tử lượng của chitosan cần sản xuất. Với các thông số đã xác định đó, tiến hành tính toán nồng độ NaOH cần dùng và thời gian cần deacetyl ở 80oC dựa vào các Phương trình (3-13), Phương trình (3-14) và Phương trình (3-15) hoặc 20 Phương trình (3-16). Chitin (dạng vảy) sẽ được ngâm nước nóng 60oC trong vòng 60 phút và làm ráo trước khi trộn đều với dung dịch NaOH có nồng độ đã xác định theo tỷ lệ 1:15 (w/v) và thực hiện deacetyl theo thời gian đã tính toán được. Sóng siêu âm có tần số 37kHz với mức năng lượng 35W được chiếu trong suốt thời gian deacetyl và nhiệt độ được duy trì ở 80oC bằng bộ phận ổn nhiệt. Sau khi kết thúc quá trình deacetyl, chitosan được ngâm, rửa sạch đến trung tính, làm khô đến độ ẩm <10% và bảo quản trong bao bì kín, ở nơi khô ráo. Mục đích sử dụng chitosan Xác định yêu cầu về độ deacetyl, phân tử lượng và độ hòa tan của sản phẩm chitosan Chitin Ngâm nước nóng 60oC trong 60 phút Căn cứ vào Phương trình (3-12), (3-13) , (3-14) hoặc (3-15) Làm ráo Chiếu siêu âm tần số 37kHz Xác định chế độ deacetyl phù hợp (Thời gian, nồng độ NaOH) Deacetyl ở 80oC Ngâm, rửa đến trung tính Làm khô Chitosan 3.6.2. Hình 3.41: Qui trình xác định chế độ deacetyl và sản xuất chitosan đề xuất Chất lượng của chitin và chitosan thu được theo qui trình đề xuất Chitin và chitosan thu được từ phần đầu và phần vỏ của tôm thẻ chân trắng theo qui trình đề xuất ở Hình 3.39, Hình 3.40 và Hình 3.41 có các chỉ tiêu chất lượng được trình bày ở Bảng 3.26 và Bảng 3.27. Kết quả phân tích ở Bảng 3.26 cho thấy so với tiêu chuẩn chitin thương mại do công ty AxioGen (Ấn Độ) công bố, sản phẩm chitin sản xuất theo qui trình đề xuất từ nguyên liệu đầu tôm và vỏ tôm thẻ chân trắng đều có chất lượng đáp ứng yêu cầu, tất cả các chỉ tiêu đều nằm trong dải cho phép. Bảng 3.26: Chất lượng chitin sản xuất theo qui trình đề xuất Tiêu chuẩn chitin thương mại b Chỉ tiêu Màu sắc Tro (%, db) Protein (%, db) Độ acetyl (%) Độ ẩm (%) Phân tử lượng trung bình độ nhớt (Mv, kDa) Hàm lượng kim loại nặng (ppm) Tạp chất không tan (%) a Ngà vàng <1 >90 <10 ≤ 15 <1 Sản phẩm thu được Từ phần vỏ Từ phần đầu Trắng hồng Trắng hồng 0,57±0,07 0,68±0,05 0,66±0,1 0,79±0,04 97,01±0,85 94,32±0,29 8,70±0,79 8,07±0,56 1652 1232 0,29 <1a Dung môi NaOH 40%, có bổ sung ure, sau 72h ở nhiệt độ 6-10oC; b: Công bố của Cty AxioGen, Ấn Độ. Bên cạnh đó, nhờ hạn chế việc xử lý nguyên liệu với HCl ở nồng độ cao và nhiệt độ cao nên chitin sản xuất theo qui trình đề xuất có mạch polysaccharide ít bị ảnh hưởng, phân tử lượng trung bình độ nhớt cao (1232 và 1652 kDa, tương ứng với nguyên liệu là đầu và vỏ tôm). Việc tiết giảm nồng độ và số lần xử lý với NaOH trong qui trình cũng có tác dụng hạn chế quá trình deacetyl nên sản phẩm chitin thu được có độ acetyl cao (94%