Tài liệu Tom tat la nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện nhi trung ương

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ LÝ THỊ THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 9 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018 2 Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN Trung tâm nghiên cứu Gen Protein, Đại học Y Hà Nội Bệnh viện Nhi Trung ương Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Vân Khánh Đại học Y Hà Nội 2. GS. TS. Trương Nam Hải Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: GS.TS. Tạ Thành Vân Trường Đại học Y Hà Nội Phản biện 2: GS.TS. Phạm Văn Ty Trường Đại học KHTN Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS. Trần Văn Khoa Học viện Quân y Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ Phiên chính thức tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi: giờ phút, ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc Gia - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Website: http://luanvan.moet.gov.vn 1 MỞ ĐẦU Beta thalassemia (β Thalassemia) là một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến ở Việt Nam, gây ra bởi đột biến gen Beta globin ( globin) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985). Tần suất mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày 11%... (Saovaros Svasti, Hieu et alet al. 2002). Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề về phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị các bệnh nhân Thalassemia thể nặng bằng truyền máu thường xuyên và tầm soát, phát hiện người mang gen. Điều trị bệnh β thalassemia chủ yếu bằng truyền máu, thải sắt suốt đời hoặc chữa trị bằng ghép tế bào gốc, liệu pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và phải có nguồn tế bào gốc phù hợp. Việc này gây ra gánh nặng về kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người nhà bị bệnh β Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội. Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng. Biện pháp phòng ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốn sinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh. Đột biến trên gen β globin phần lớn là đột biến điểm. Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và tần suất khác nhau. Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia. Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân. Phân tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực 2 hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng. Đây được xem là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra các em bé mắc thể bệnh nặng. Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Weatherall (2007). Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về bệnh  thalassemia nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về lâm sàng, tần suất bệnh thông qua xét nghiệm điện di huyết sắc tố. Gần đây đã có một số nghiên cứu về tần suất bệnh, về tần suất mang gen dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử nhưng mô hình nghiên cứu và số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu còn chưa lớn, chưa đủ để đưa ra con số tỷ lệ đột biến đặc trưng của người Việt Nam nói chung và của người miền Bắc nói riêng. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen  globin và chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương” được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu sau: 1. Phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMS-PCR và giải trình tự gen Sanger. 2. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phần tử từ tế bào ối . Nội dung nghiên cứu: 1. Áp dụng kỹ thuật multiplex ARMS PCR, ARMS PCR, giải trình tự gen xác định đột biến ở bệnh nhân β thalassemia và người mang gen bệnh. 2. Chẩn đoán trước sinh cho các gia đình có tiền sử sinh con bị β thalassemia thể nặng. 3 Những đóng góp mới của luận án: 1. Đưa ra nhóm đột biến thường gặp trên gen β globin tại bệnh viện Nhi Trung ương. 2. Tần suất, tỷ lệ các alen đột biến thường gặp, kiểu gen đột biến xuất hiện nhiều nhất trên đối tượng bệnh nhân và người mang gen bệnh. 3. Phát hiện 3 đột biến điểm mới tìm thấy trên người Việt Nam, 01 đột biến mất đoạn lớn toàn bộ gen β globin. 4. Đưa ra quy trình chẩn đoán trước sinh cho bệnh β thalassemia. Cấu trúc của luận án: Luận án được trình bày trong 150 trang (không kể tài liệu tham khảo và phần phụ lục). Luận án được chia thành các phần: - Mở đầu: 03 trang - Chương 1. Tổng quan tài liệu: 22 trang - Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 11trang - Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 50 trang - Chương 4. Bàn luận: 12 trang - Kết luận và kiến nghị: 1,5 trang - Các công trình công bố của tác giả: 01 trang - Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh: 11 trang Luận án gồm 23 bảng, 53 hình. Sử dụng 99 tài liệu tham khảo gồm tiếng Việt, tiếng Anh và một số trang Web. Phần phụ lục gồm nồng độ DNA của các bệnh nhân nghiên cứu, danh sách 214 bệnh nhân, 354 người mang gen bệnh và 178 sản phụ tham gia nghiên cứu. 4 NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cấu trúc và các dạng phân tử Hemoglobin 1.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường Thalassemia là rối loạn di truyền do bất thường trong quá trình tổng hợp hemoglobin mà nguyên nhân là sự thay đổi tỷ lệ tổng hợp các chuỗi globin. Bình thường 2 loại chuỗi α globin và “không α” globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1, đột biến gen làm giảm hoặc ngừng sản xuất một loại chuỗi globin nhất định hoặc một vài chuỗi (α, β, γ, δ) sẽ gây ra sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin. Loại chuỗi globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu. Thông thường người ta chia bệnh thalassemia ra làm 2 loại, nếu giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin sẽ gây bệnh α thalassemia và rối loạn tổng hợp chuỗi β globin sẽ gây thể bệnh β thalassemia. Hình 1.1. Cấu trúc phân tử hemoglobin (Nguồn:http://www.tutorialpoint.org/ProvaBiswas/HB_page1.html) 1.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống. Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptide ra các loại sau đây: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε ), chuỗi theta (ζ). 5 Các chuỗi (ζ) và chuỗi (ε) chỉ tồn tại ở những tuần đầu của thời kỳ bào thai, sau đó nhanh chóng được thay thế bằng chuỗi (α), (β), (), (δ). Các chuỗi này tồn tại suốt cuộc đời ở các mức độ khác nhau. Ở người trưởng thành gặp chủ yếu là chuỗi (α), (β) một số ít chuỗi (δ) và rất ít chuỗi (). Các loại chuỗi (β), (), (δ) đều kết hợp từng cặp với chuỗi (α) nên các loại chuỗi đó còn gọi chung là các chuỗi “không α”. 1.2. Cơ chế bệnh sinh và di truyền phân tử của bệnh β thalassemia 1.2.1. Gen β globin Bệnh β thalassemia là bệnh di truyền lặn theo nhiễm sắc thể (NST) thường. Gen mã hóa cho chuỗi β globin nằm trên nhánh ngắn của NST số 11, vị trí 11p15.5, mỗi NST chứa một gen β globin. Gen dài 1600 cặp base, mã hóa cho 146 acid amin. 1.2.2. Đột biến trên gen β globin Cho đến nay có hơn 200 đột biến đã được tìm thấy trên gen β globin. Dựa vào ảnh hưởng của đột biến đến việc tổng hợp chuỗi β globin, đột biến trên gen β globinđược chia làm 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lượng chuỗi β globin, làm mất chức năng của gen β globin gọi là nhóm β0 globin và nhóm làm giảm số lượng chuỗi β globin được xếp vào nhóm đột biến gây β+globin. Đột biến trên gen β globin mang tính chủng tộc, có nghĩa là mỗi nhóm dân tộc, vùng địa lý khác nhau mang một nhóm đột biến khác nhau đặc trưng cho từng nhóm đó với tỷ lệ khác nhau. 1.2.3. Cơ chế bệnh sinh bệnh β thalassemia Trong hội chứng Thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sự thiếu hụt một loại chuỗi polypeptit của phần globin, gây ra dư thừa tương đối loại chuỗi kia (Cousens, Gaff et al. 2010). Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ rất khác nhau phụ thuộc vào từng thể bệnh, song hậu quả của nó gây ra: - Giảm tổng hợp Hb do thiếu phần globin - Mất cân bằng giữa các chuỗi α và “không α” 6 Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia (Nguồn: Dương Bá Trực. 1996) 1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh β thalassemia ở Việt Nam Các nghiên cứu về  thalassemia ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào tỷ lệ mang gen bệnh, các thay đổi về huyết học, lâm sàng và điều trị bệnh các nghiên cứu về đặc điểm phân tử về kiểu của bệnh, kiểu gen trên đối tượng là người mang gen bệnh, bệnh nhân  thalassemia nhằm ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh chưa nhiều và với cỡ mẫu không nhiều. 7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành tại Bệnh Viện Nhi Trung Ương trong thời gian từ 1/2013 đến tháng 12/2017. Đối tượng nghiên cứu được chia thành 3 nhóm: - Nhóm bệnh nhân được chẩn đoán là thể nặng: đã được chẩn đoán sàng lọc dựa trên các kết quả cận lâm sàng: công thức máu tổng quát và điện di huyết sắc tố. Các bệnh nhân này thường có biểu hiện lâm sàng: da xạm, gương mặt điển hình bị thalassemia, xương mặt có thể biến dạng, truyền máu thường xuyên tùy thuộc từng cá thể, độ tuổi bắt đầu truyền máu tùy thuộc kiểu gen… - Nhóm người được nghi ngờ là người mang gen bệnh: là bố mẹ của các bệnh nhân  thalassemia thể nặng - Nhóm làm chẩn đoán trước sinh: là thai phụ ở gia đình đã có con đầu đã được chẩn đoán xác định mắc  thalassemia thể nặng và đã xác định được đột biến trên gen β globin. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu cắt ngang: nghiên cứu trên các thành viên gia đình (bố, mẹ, con đầu), thai phụ có thai lần tiếp theo và có mong muốn thực hiện chẩn đoán trước sinh. 2.2.1. Phương pháp phát hiện đột biến trên gene  globin Được tiến hành tại Trung tâm gen Protein Đại học Y Hà Nội và Khoa Di truyền, Bệnh viện Nhi trung ương. 8 Hình 2.1. Quy trình xác định đột biến gen β globin. 2 ml máu tĩnh mạch bệnh nhân, bố, mẹ và đối chứng được chống đông bằng EDTA. DNA tổng số được chiết tách bằng kit thương mại QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN, Đức). DNA tổng số được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch theo phương pháp đo mật độ quang. 09 đột biến điểm thường gặp CD41/42(-TCTT), CD17 (AAGTAG), IVS1-1(G-T), -28(A-G), IVS2-654(C-T), CD71/72(+A), IVS15(G-C), CD 95(+A) và HbE (AAG-GAG)-CD26 được chia thành 3 nhóm, sẽ được sàng lọc bằng kỹ thuật multiplex ARMS PCR và ARMS PCR. Nếu không phát hiện thấy đột biến nằm trong nhóm này, sẽ tiếp tục giải trình tự gen β globin để tìm đột biến điểm hiếm gặp khác, hoặc tiếp tục với kỹ thuật Gap PCR tìm đột biến mất đoạn lớn 2,3kb. 9 Sơ đồ nghiên cứu Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu 2.3. Đạo đức nghiên cứu Đề tài tuân thủ chặt chẽ vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Y sinh. Nghiên cứu được tiến hành dựa trên sự tự nguyện tham gia của các gia đình có bệnh nhân được chẩn đoán mắc  thalassemia trên lâm sàng, các cặp vợ chồng được xác định là người mang gen bệnh  thalassemia. Các xét nghiệm phân tích gen chỉ thực hiện khi có sự đồng ý của bệnh nhân và gia đình bệnh nhân. Các thông tin về bệnh nhân và gia đình bệnh nhân, kết quả chẩn đoán hoàn toàn được bảo mật. 10 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1.1. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở bệnh nhân β thalassemia thể nặng Bằng việc áp dụng các kỹ thuật multiplex ARMS PCR và ARMS PCR, chúng tôi đã phát hiện được 214/214 bệnh nhân có đột biến. Chúng tôi phát hiện được cả 9 loại đột biến thường gặp trên gen β globin với các kiểu gen khác nhau với các kiểu gen đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kết hợp. Về phân bố tần suất theo từng dạng đột biến gen, nghiên cứu đã phát hiện thấy 214/214 bệnh nhân có kết hợp 2 đột biến gen β globin, chiếm tỷ lệ 99,9%. Nhóm đột biến CD17 (AAG-TAG), CD41/42(TCTT), HbE (GAG-AAG)-CD26 chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là 30,1%, 27,57% và 21,4%. Bảng 3.1. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân  thalassemia STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Các đột biến gen β globin CD41/42(-TCTT) CD17(AAG-TAG) HbE (GAG-AAG)-CD26 -28(A-G) CD71/72(+A) IVS1-1(G-T) IVS1-5(G-C) IVS2-654(C-T) CD95(+A) Các đột biến hiếm gặp khác Vị trí (Exon/Intron) Exon 2 Exon 1 Exon 2 Promotor Exon 2 Intron 1 Intron 1 Intron 2 Exon 2 Tần số (n=428) 118 129 92 14 22 23 7 17 2 Tỷ lệ (%) 27,57 30,1 21,4 3,27 5,14 5,37 1,63 4,23 0,47 4 0,93 11 Bảng 3.2. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân  thalassemia theo vị trí đột biến Vị trí (Exon/Intron) Promotor (-28 A-G) Exon 1 CD17(AAG-TAG) Intron 1 IVS1-1 (G-T) IVS1-5(G-C) Exon 2 HbE (GAG-AAG) CD41/42(-TCTT) CD71/72(+A) CD95(+A) Intron 2 Các đột biến hiếm gặp khác Tần số (n=428) Tỷ lệ (%) 14 3,27 129 30,14 30 7 234 54,6 18 4,2 4 0,7 Nhận xét: Các đột biến phân bố ở các vùng gen như: vùng promotor, vùng Exon 1, Intron 1, Exon 2, Intron 2, Exon 3. Tỷ lệ gặp đột biến điểm cao nhất ở vùng Exon 2 chiếm tỷ lệ 54,6%. Dùng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger sequencing đã phát hiện được 3 đột biến điểm hiếm gặp và chưa có công bố ở mức độ sinh học phân tử ở Việt Nam: c.-138 C-T; c.-140 C-T; c.440-441 dupAC. Bệnh nhân 1: Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.441-442ins AC Hình 3.1. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.441-442ins AC Nhận xét: Tại vị trí c.441-442 của gen β globin, ở người bình thường là mã kết thúc gen, tuy nhiên ở bệnh nhân do thêm 2 nucleotid 12 AC ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện các đỉnh nucleotid chồng lên nhau làm mã kết thúc bị dịch chuyển. Bệnh nhân 2: Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.-140C>T Hình 3.2. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.-140C>T Nhận xét: Tại vị trí c.-140C của gen β globin ở bệnh nhân có sự thay thế nucleotid C thành T ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh nucleotid C và T chồng lên nhau. Như vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.-140C>T. Bệnh nhân 3: Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.-138C>T Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.-138C>T Nhận xét: Tại vị trí c.-138C của gen β globin ở bệnh nhân có sự thay thế nucleotid C thành T ở dạng dị hợp tử nên xuất hiện đỉnh nucleotid C và T chồng lên nhau. Như vậy bệnh nhân có đột biến dị hợp tử c.138C>T. Ca lâm sàng điển hình: Phát hiện đột biến mất đoạn lớn gây tồn dư huyết sắc tố bào thai HbF bằng kĩ thuật Gap PCR 13 Đặc biệt, với kĩ thuật Duplex Gap PCR, đã phát hiện được trường hợp đột biến mất đoạn lớn thuộc nhóm đột biến hiếm gặp ở nhóm bệnh β thalassemia gây tồn dư huyết sắc tố bào thai ở người trưởng thành. Đột biến mất đoạn lớn dạng HPFH thể SEA là đột biến mất đoạn toàn bộ gen β globin và 1 số vùng gen liên quan bên cạnh, độ lớn 2,3kb. Bệnh nhân được chẩn đoán β thalassemia và được chỉ định xét nghiệm gen tìm đột biến. Bố, mẹ và anh trai cũng được tiến hành xét nghiệm song song. Trước tiên, kỹ thuật Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR được áp dụng để phát hiện 9 đột biến thường gặp. Kết quả cho thấy bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử IVS2-654 (C>T), anh trai bệnh nhân không có đột biến IVS2-654 (C>T), bố bệnh nhân không có đột biến IVS2-654 (C>T), mẹ bệnh nhân có đột biến dị hợp tử IVS2654 (C>T). Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR được kiểm tra lại bằng kỹ thuật giải trình tự gen và cho kết quả tương đồng. Như vậy với kết quả này cho thấy, kiểu đột biến gen của bệnh nhân không phù hợp với kiểu di truyền của bố và mẹ vì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử thì không thể chỉ có thể nhận 1 alen đột biến IVS2-654 (C>T) của người mẹ. 14 Hình 3.4. Kết quả xác định đột biến gen của bệnh nhân mã số PWBbT120505F và gia đình. (A) Kết quả giải trình tự gen kiểm tra đột biến. (B) Kết quả phát hiện đột biến HPFH thể SEA bằng kỹ thuật Gap PCR Chúng tôi giả thuyết có khả năng bệnh nhân có đột biến mất đoạn lớn và người bố cũng có đột biến này và truyền cho con. Chúng tôi tiếp tục áp dụng kỹ thuật Gap PCR để kiểm tra. Kết quả cho thấy bệnh nhân có dị hợp tử đột biến mất đoạn lớn HPFH dạng SEA và bố bệnh nhân cũng có đột biến biến mất đoạn lớn HPFH dạng SEA. Như vậy, bệnh nhân có dị hợp tử đột biến kết hợp (IVS2-654 (C>T)/HPFH thể SEA) gồm đột biến IVS2-654 (C>T) nhận từ người mẹ và đột biến mất đoạn lớn HPFH dạng SEA nhận từ người bố (hình 3.4) Nhận xét: Ở hình 3.4A, tại vị trí IVS2-654, mẫu bố và mẫu anh trai chỉ xuất hiện đỉnh bình thường của nucleotid C chứng tỏ không có đột biến, trong khi đó mẹ xuất hiện cả đỉnh bình thường của của nucleotid C và đỉnh đột biến của nucleotid T chứng tỏ mẹ có đột biến dị hợp tử. Bệnh nhân chỉ xuất hiện đỉnh đột biến của nucleotid T chứng tỏ bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử. Ở hình 3.4B, mẫu nước không xuất hiện vạch chứng tỏ không có hiện tượng nhiễm ngoại lai. Ở mẫu chứng âm tính với đột biến HPFH thể SEA không xuất hiện vạch, trong khi đó ở mẫu bố bệnh nhân và bệnh nhân xuất hiện vạch đột biến tương tự như mẫu chứng dương tính với đột biến HPFH thể SEA chứng tỏ bố bệnh nhân và bệnh nhân có đột biến dạng này. 15 Bảng 3. 3. Kiểu gen và kiểu hình của 214 bệnh nhân  thalassemia STT Kiểu gen kết hợp Kiểu gen Kiểu hình lâm sàng Số lượng ca bệnh Tỉ lệ (%) Kiểu gen β/HbE 1 2 3 CD17-HbE CD41/42-HbE CD71/72-HbE β0/HbE Thể nặng 40 18.69 0 Thể nặng 36 16.8 + Thể nặng 7 3.27 0 β /HbE β /HbE 4 IVS1-5-HbE β /HbE Thể nặng 3 1.4 5 IVS1-1-HbE β0/HbE 2 0.93 6 -28-HbE β+/HbE Thể nặng Thể nặng, trung gian 2 0.93 Thể nặng 1 0.47 7 HbE-IVS2-654 + β /HbE Kiểu gen đồng hợp tử, dị hợp tử 2 đột biến 8 9 10 CD41/42-CD17 CD41/42-CD41/42 CD17-CD17 β 0/ β 0 Thể nặng 25 11.68 0 0 Thể nặng 20 9.34 0 0 Thể nặng 19 8.87 0 + Thể nặng 9 4.2 Thể nặng 8 3.73 β/β β/β 11 CD17-IVS2-654 β/β 12 CD41/42-CD71/72 β 0/ β + 13 14 CD17- -28 CD17-CD71/72 + + Thể nặng 7 3.27 0 + Thể nặng 6 2.8 0 0 Thể nặng 4 1.86 Thể nặng 4 1.86 β/β β/β 15 IVS1-1-IVS1-1 β/β 16 IVS1-1-IVS2-654 β 0/ β + 17 18 20 CD41/42-IVS1-1 CD41/42-28 0 0 Thể nặng 3 1.4 0 + Thể nặng 3 1.4 0 0 Thể nặng 3 1.4 β/β β/β β/β 21 CD17-IVS1-1 CD41/42-IVS2654 β 0/ β + Thể nặng 2 0.93 22 CD17-IVS1-5 β 0/ β 0 Thể nặng 2 0.93 23 24 CD41/42-CD95 IVS1-1-CD95 0 + Thể nặng 1 0.47 0 + Thể nặng 1 0.47 + + Thể nặng 1 0.47 Thể nặng 1 0.47 β/β β/β 25 -28-CD71/72 β/β 26 -28-IVS2-654 β+/ β+ 16 Đột biến hiếm gặp c.-138 C>T27 CD41/42 c.-140 C>T – 28 CD17 c.441-442ins AC29 CD41/42 2,3kb 30 deletion/IVS2-654 β+/β0 Thể nặng 1 0.47 β+/β0 Thể nặng 1 0.47 β+/β0 Thể nặng Thể trung gian 1 0.47 1 0.47 β+/ β+ Nhận xét: Xác định kiểu gen của 214 bệnh nhân mắc β thalassemia thể nặng, tỉ lệ tìm thấy đột biến là 214/214 bệnh nhân (100%). Nghiên cứu này đã xác định được 26 kiểu gen là kết hợp của các đột biến nằm trong nhóm 09 đột biến phát hiện bằng kỹ thuật Multiplex PCR và ARMS PCR chiếm 98,12%, 4/214 (1,88%) trường hợp phát hiện đột biến điểm hiếm gặp trên người Việt Nam, được phát hiện bằng kĩ thuật giải trình tự gen Sanger và Gap-PCR. 3.2. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen bệnh β thalassemia Bảng 3.4. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin trên đối tượng người mang gen bệnh Các đột biến Vị trí Tần số alen gen β globin (Exon/Intron) Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR CD41/42(-TCTT) Exon 2 109 CD17(AAG-TAG) Exon 1 100 HbE (GAG-AAG)- CD26 Exon 2 86 -28(A-G) Promotor 9 CD71/72(+A) Exon 2 22 IVS1-1(G-T) Intron 1 8 IVS1-5(G-C) Intron 1 2 IVS2-654(C-T) Intron 2 4 CD95(+A) Exon 2 6 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger Các đột biến điểm 3 hiếm gặp Tỷ lệ (%) 30,79 28,25 24,29 2,54 6,21 2,26 0,56 1,13 1,69 0.85 17 Đột biến mất đoạn lớn Không tìm thấy đột biến Kỹ thuật Gap - PCR Toàn bộ gen β globin(2,3kb) 1 0,28 3 0,85 Trong tổng số 354 người được chẩn đoán là người mang gen bệnh β thalassemia tham gia nghiên cứu, tỷ lệ phát hiện đột biến ở người mang gen bệnh là 351/354, chiếm 99,15%. - Trong 09 đột biến sàng lọc bằng phương pháp Multiplex ARMS PCR và ARMS PCR, nhóm đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao nhất là CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG), HbE (CD26) với tỷ lệ tương ứng là 30,79%, 28,25% và 24,29%. - Đã phát hiện 03 đột biến điểm hiếm gặp bằng phương pháp giải trình tự gen β globin: c.-138 C-T; c.-140 C-T; c.441-442 insAC (Hb Tak). Những trường hợp mang gen bệnh này là bố hoặc mẹ của các trường hợp bệnh nhân đã được ghi nhận ở phần kết quả - Đặc biệt còn phát hiện thấy 01 trường hợp người mang gen bệnh β thalassemia mang đột biến mất đoạn toàn bộ gen β globin với độ lớn 2,3kb. Đây cũng là báo cáo đầu tiên ở Việt Nam ở mức độ sinh học phân tử về đột biến này. - Phát hiện có 02 trường hợp gia đình, có kiểu gen đột biến cả vợ và chồng đều có kiểu gen đột biến đồng thời gây bệnh β thalassemia và α thalassemia. Biểu hiện lâm sàng và các kết quả cận lâm sàng chỉ biểu hiện là người mang đột biến trên gen β globin. - Phát hiện có 01 gia đình, người mẹ tuy mang 2 đột biến điểm trên gen β globin là người mang thể β thalassemia trung gian, không có biểu hiện lâm sàng đặc trưng của người bị bệnh, chỉ số HbF tăng cao (28%). Các trường hợp nghi ngờ mang gen đã phát hiện thấy đột biến, là người mang gen bệnh β thalassemia là hoàn toàn phù hợp với các quả cận lâm sàng thể hiện ở kết quả công thức máu tổng quát và định lượng Hemoglobin bằng xét nghiệm điện di huyết sắc tố. - Có 3/354 trường hợp người nghi ngờ mang gen bệnh không phát hiện thấy đột biến trên gen β globin chiếm tỷ lệ 0,84%. 3.3. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia 18 Hình 3.5. Quy trình chẩn đoán trước sinh cho bệnh β thalassemia Bảng 3.5. Kết quả số lượng và tỷ lệ thai nhi chẩn đoán trước sinh. Số lượng Tỷ lệ Số lượng đột biến thai nhi (%) (n=178) Không bị đột biến 54 30,3 Bị 1 đột biến 75 42,1 Bị 2 đột biến 49 27,6 Nhận xét: Trong số 178 thai nhi được tiến hành chẩn đoán trước sinh, có 54/178 thai nhi không mang đột biến nào, chiếm 30,3%, 75/178 thai nhi (chiếm 42,1%) mang 01 đột biến, 49/178 thai nhi (chiếm 27,6%). Bảng 3.6. Kết quả tần số và tỷ lệ alen đột biến trong chẩn đoán trước sinh cho thai nhi Các đột biến Vị trí Tần số Tỷ lệ gen β globin (Exon/Intron) (n=356) (%) CD41/42(-TCTT) Exon 2 51 14,3 CD17(AAG-TAG) Exon 1 56 15,73 HbE (GAG-AAG)Exon 2 41 11,5 CD26 -28(A-G) Promotor 4 1,12 CD71/72(+A) Exon 2 12 3,37 IVS1-1(G-T) Intron 1 5 1,4 IVS1-5(G-C) Intron 1 1 0,28