Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ TÓM TẮT ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN...

Tài liệu TÓM TẮT ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN

.PDF
19
261
142

Mô tả:

TÓM TẮT ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG HẢI NHUNG TÓM TẮT ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1. GS.TS Nguyễn Văn Thanh 2. TS.BS. Huỳnh Nghĩa Tp.HCM, tháng 05 năm 2014 MỤC LỤC PHẦN 1 GIỚI THIỆU 1.1. Sơ lược về bệnh xơ gan .................................................................................... 2 1.2. Điều trị bệnh xơ gan trong hiện tại ................................................................... 3 1.3. Điều trị bằng tế bào gốc ................................................................................... 4 1.4. Tế bào gốc trung mô (MSC) ............................................................................. 6 PHẦN 2: ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU 1. Tên đề tài luận án: ............................................................................................. 7 2. Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................... 7 3. Mục đích nghiên cứu của luận án ...................................................................... 8 4. Đối tượng, phương pháp nghiên cứu ................................................................. 8 5. Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu.................................... 12 6. Dự kiến kết quả đạt được ................................................................................. 15 7. Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận án ................................................... 16 8. Các tài liệu tham khảo được sử dụng khi viết đề cương ................................. 16 9. Phân bổ thời gian thực hiện đề tài luận án....................................................... 17 1 PHẦN 1 GIỚI THIỆU 1.1. Sơ lược về bệnh xơ gan 1.1.1 Bệnh xơ gan Xơ gan là một loại bệnh gan mãn tính. Các kiểu xơ gan lần đầu tiên được giới thiệu bởi Laennec năm 1826. Nó có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “scirrhus” và được sử dụng để mô tả mẫu sinh thiết gan có bề mặt màu cam và hung nâu. Nhiều dạng tổn thương gan được đánh dấu bằng xơ. Xơ hóa được định nghĩa là tập trung quá mức của các thành phần của mạng lưới ngoại bào (bao gồm collagens, glycoprotein, proteoglycans) trong gan. Đáp ứng với sự tổn thương gan này vốn dĩ có khả năng đảo ngược được. Nhưng trong hầu hết các bệnh nhân, xơ gan lại thể hiện là một quá trình bất hồi phục. Việc điều trị chỉ có thể giúp giảm tiến trình bệnh và ngăn ngừa biến chứng. Xơ gan được định nghĩa mô học như một quá trình khuếch tán đặc trưng của gan xơ hóa và biến đổi cấu trúc gan bình thường thành các nốt cấu trúc bất thường. Sự tiến triển của tổn thương gan đến xơ gan có thể xảy ra trong vài tuần tới vài năm. Thật vậy, bệnh nhân bị viêm gan C có thể bị viêm gan mãn tính từ 40 năm trước khi tiến triển đến xơ gan. Mối tương quan giữa những phát hiện mô học và triệu chứng lâm sàng lại tương đối không rõ ràng. Một bệnh nhân xơ gan có thể hoàn toàn không có triệu chứng rõ ràng và sống lâu, trong khi ở bệnh nhân khác lại có nhiều triệu chứng nặng của bệnh gan giai đoạn cuối và thời gian sống rất ngắn. Dấu hiệu thường gặp và triệu chứng thể hiện ở suy giảm chức năng gan, giảm khả năng giải độc của gan, tăng huyết áp ở tĩnh mạch cửa gan. Dịch tễ học xơ gan Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới năm 2002, bệnh xơ gan là căn bệnh gây tử vong đứng hàng thứ 12, gây ra cái chết cho hơn 700,000 người mỗi năm với tỷ lệ tử vong lên đến trên 12 người trong 100,000 người trên toàn thế giới. Tỉ lệ tử vong của người mắc bệnh xơ gan là 34-66% trong vòng 10 năm, phần lớn phụ thuộc vào nguyên nhân gây xơ gan: xơ gan do rượu có tiên lượng xấu hơn xơ gan do mật và xơ gan do viêm gan. Nguy cơ tử vong do tất cả các nguyên nhân trên tăng gấp 12 lần; nếu loại trừ những hậu quả trực tiếp của bệnh gan, thì nguy cơ tử vong vẫn tăng gấp 5 lần. Theo thống kê năm 2004, bệnh xơ gan phổ biến nhất ở các nước Đông Âu, Bắc Phi, Hoa Kì và Trung Mỹ. Việt Nam nằm trong nhóm những nước có tỷ lệ mắc bệnh xơ gan khá cao và có xu hướng ngày càng tăng. Nguyên nhân Nguyên nhân gây xơ gan chủ yếu là do nhiễm virus (virus viêm gan C đóng vai trò chủ yếu gần 26% trường hợp, virus viêm gan B, D gần 15% trường hợp), rượu (gần 21% trường hợp), các nguyên nhân khác như rối loạn chuyển hóa (hemochromtosis, thiếu men -antitrypsin), bệnh đường mật kéo dài, nghẽn tĩnh mạch gan, rối loạn miễn dịch, nhiễm độc (methotrexate, amiodarone), suy dinh dưỡng, nhiễm trùng, bẩm sinh… Hậu quả 2 Hậu quả chính của xơ gan là gây suy chức năng gan và tăng huyết áp tĩnh mạch cửa. Suy chức năng gan làm giảm khả năng tổng hợp protein huyết thanh; giảm tổng hợp chất chống đông máu gây bầm tím, chảy máu; giảm chức năng tiết mật, chế biến bilirubin gây vàng da; thay đổi chuyển hóa đạm gây giảm chức năng não, hay quên, mất tập trung, khó ngủ.. do các chất đạm cần cho não như ammonia không được cung cấp đủ; giảm khả năng giải độc của gan, giảm khả năng chuyển hóa thuốc… Tăng huyết áp ở tĩnh mạch cửa gây ra các chứng bệnh cổ chướng, lách to, giãn mạch thực quản, tăng huyết áp phổi, gây xnah tím, khó thở … Ngoài ra còn gây giảm khả năng miễn dịch, tăng nguy cơ mắc bệnh do nhiễm trùng, tăng nguy cơ ung thư gan dẫn đến tử vong, dễ nghẽn tĩnh mạch gan, không cung cấp đủ máu cho thận gây suy thận (tỷ lệ tử vong rất cao)… 1.2. Điều trị bệnh xơ gan trong hiện tại Ngăn ngừa tiếp xúc với tác nhân gây xơ gan Ở xơ gan do rượu, việc ngừng uống rượu sẽ giúp dừng tiến triển xơ gan. Tương tự, việc ngừng dùng thuốc độc đối với gan hoặc loại bỏ chất độc ngoài môi trường sẽ dừng tiến triển xơ gan. Sự điều trị các bệnh chuyển hóa, như điều trị chứng thừa sắt trong hội chứng hemochromatosis hay thừa đồng trong bệnh Wilson cũng là những liệu pháp có hiệu quả. Các bệnh viêm gan B và C có thể đáp ứng với việc điều trị bằng interferon và viêm gan tự miễn có thể tiến triển với prednisone và azathioprine (Imuran). Các loại thuốc như ursodiol (Actigall) có thể làm chậm tiến triển của xơ gan do tắc mật nguyên phát và bệnh viêm xơ chai đường mật. Điều trị biến chứng Ở những bệnh nhân bị xơ gan, việc chữa trị chủ yếu hướng vào các biến chứng. Chứng giãn tĩnh mạch xuất huyết thực quản có thể được điều trị bằng liệu pháp xơ hóa nội soi hoặc thắt dây cao su. Cổ trướng và phù thủng thường đáp ứng tốt với khẩu phần ăn ít Natri. Cổ trướng và phù thủng nặng hơn có thể sử dụng liệu pháp lợi tiểu. Viêm phúc mạc tự phát do vi khuẩn nên được chữa trị nhanh chóng bằng các kháng sinh thích hợp. Những thuốc chuyển hóa ở gan nên cẩn thận khi sử dụng. Các chứng rối loạn đông máu thỉnh thoảng sẽ đáp ứng với vitamin K. Đối với tăng áp tĩnh mạch cửa, có thể sử dụng thuốc beta-blocker hoặc nitrat. Bệnh não do gan được điều trị bằng cách rửa ruột với lactulose. Có thể bổ sung kháng sinh nếu cần thiết. Với bệnh nhân xơ gan bị suy gan-thận nên được điều trị thẩm tách máu và bổ sung thuốc làm tăng lượng máu đến thận. Những điều trị khác hướng về các nguyên nhân đặc trưng của xơ gan. Đối với viêm gan siêu vi, sử dụng interferon và các thuốc kháng virus. Đối với viêm gan tự miễn, có thể sử dụng corticosteroid và các thuốc khác. Ghép gan Ghép gan là một cách chữa trị hiệu quả cao cho xơ gan giai đoạn cuối. Ghép gan thường cần đến khi các biến chứng như bệnh não, cổ trướng hay giãn tĩnh mạch xuất huyết không thể kiểm soát được hoặc khi chức năng sinh hóa bị suy giảm nghiêm trọng. Ở những bệnh nhân bị xơ gan do tắc mật nguyên phát, mức bilirubin tăng biểu thị một tiên lượng xấu và những bệnh nhân này nên được cân nhắc ghép gan ngay khi nồng độ bilirubin bắt đầu tăng. Các chuyên gia sẽ xác định các nguy cơ và lợi ích của ghép gan cho từng bệnh nhân. Tỉ lệ tử vong đã được cải thiện hơn nhiều năm qua nhờ 3 sử dụng các thuốc suy giảm miễn dịch và giữ cho gan được ghép vào không bị tấn công và tổn thương. Trung bình hơn 80% bệnh nhân được ghép gan có thể kéo dài cuộc sống sau năm năm. Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân cần ghép gan vượt xa số lượng gan hiến tặng. Một bệnh nhân cần ghép gan phải trải qua một quá trình đánh giá phức tạp trước khi được cho vào danh sách chờ ghép gan. Nói chung, gan được ghép cho những bệnh nhân được tiên đoán có cơ hội sống sót dài nhất sau khi cấy ghép. Sự sống sót sau khi ghép gan cần sự theo dõi chặt chẽ và kết hợp với sự chăm sóc chu đáo. Xơ gan và ung thư gan là căn bệnh phổ biến trên thế giới. Theo thống kê, năm 2008 trên thế giới có 740.000 trường hợp mới được chẩn đoán bị bệnh ung thư gan trong đó có 696.000 trường hợp tử vong, đứng thứ ba trong các trường hợp tử vong liên quan đến ung thư (Ju Dong Yang và Lewis R. Roberts, 2010). Ung thư gan khởi phát từ bệnh gan cấp tính rồi tiến triển thành bệnh gan mãn tính dẫn tới xơ gan và ung thư gan. Có nhiều nguyên nhân có thể dẫn tới tiến trình này trong đó có thể kể đến: Do uống rượu, nhiễm virus Hepatitis, do hoá chất như aflatoxin… Bệnh này có thể được ngăn ngừa bằng cách kiểm soát các yếu tố kể trên. Tuy nhiên, khi bệnh tiến triển đến giai đoạn xơ gan và ung thư găn thì việc điều trị gặp nhiều khó khăn. Trong đó các biện pháp điều trị phổ biến hiện nay là hoá chất, cấy ghép gan, tuy nhiên hiệu quả điều trị của các phương pháp này còn thấp. Hơn nữa, phương pháp cấy ghép gan là phương pháp xâm lấn, ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ của người bệnh và thường gặp hiện tượng thải loại khi ghép. Trước tình hình đó, nhiều liệu pháp mới ra đời nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, có thể kể đến như: liệu pháp gene, liệu pháp dẫn thuốc đến đúng mục tiêu, trong đó liệu pháp tế bào dựa trên những kết quả thí nghiệm trên mô hình chuột và trên bệnh nhân hứa hẹn nhiều triển vọng và tiềm năng ứng dụng cao. 1.3. Điều trị bằng tế bào gốc Cơ sở lý thuyết của việc sử dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan Sự tăng sinh, sự biệt hóa, sự tiết và các chức năng của tế bào cấy ghép và tế bào nội sinh tại gan bị ảnh hưởng bởi vi môi trường tại vùng xơ gan. Các bệnh liên quan đến sự suy thoái tế bào như xơ gan đều do sự ảnh hưởng của vi môi trường ngoại bào. Chứng cứ ban đầu của sự tái tạo gan là sau khi cắt bỏ 1 phần gan, người ta nhận thấy sự xuất hiện các tín hiệu quan trọng từ prostaglandin; đây là yếu tố quyết định cho sự tái tạo gan. Tín hiệu này liên quan đến sự tăng yếu tố tăng trưởng TGF-beta 1. Gan bị xơ hóa có nồng độ TGF-beta 1 cao, điều này dẫn đến sự apoptosis của tế bào gan cũng như tác động sự kháng phân bào và sự xơ hóa. Không chỉ có vi môi trường của cơ thể chủ ảnh hưởng đến các tế bào ghép, các tín hiệu do tế bào ghép tiết ra cũng làm thay đổi vi môi trường. Sự thay đổi tại vi môi trường vùng xơ gan góp phần cho sự thành công của các ca ghép gan. Việc cấy ghép các tế bào gốc trong điều trị xơ gan trên động vật đã chỉ ra vai trò của tế bào gốc tại vi môi trường vùng xơ gan. Một số nghiên cứu đã chỉ ra khả năng tiết các yếu tố kích thích sự phân chia tế bào, các yếu tố ngoại bào dẫn đến sự tái tạo nội sinh ở cơ thể chủ và giúp cơ thể sống sót (Makowka et al.). Chẳng hạn, các tế bào gốc trung mô có thể tiết ra một số các yếu tố ức chế các cytokine đáp ứng viêm trên mô hình chuột bệnh xơ hóa phổi. Các tế bào ghép vào vùng tổn thương giúp làm giảm đáp ứng viêm tại vi môi trường vùng tổn thương, tiết các yếu tố kích thích tế bào gốc nội sinh do đó giúp cải 4 thiện tình trạng tổn thương. Mặt khác MSC có thể được cảm ứng để tuần hoàn vào máu ngoại vi trong mô hình động vật trong điều kiện cụ thể. Tín hiệu hóa ứng động để dẫn dụ tế bào gốc vào vi môi trường thích hợp hoặc cảm ứng sự luân chuyển của nó vẫn chưa được hiểu rõ. Một số chemokine được đề xuất như SDF-1 và các yếu tố tăng trưởng (Growth factor_GF) được cho là các yếu tố hóa ứng động trên MSC, tuy nhiên cơ chế điều hòa của nó thì vẫn chưa được hiểu rõ. Điều này giải thích cho khả năng “di cư” của tế bào gốc đến vùng tổn thương Điều trị xơ gan bằng cấy ghép tế bào gan tự thân A.Schwarz và cộng sự tại viện Angewandte Zellkultur (Đức) đã tiến hành thử nghiệm phương pháp điều trị xơ gan bằng cách chuyển tế bào gan tự thân cùng một lượng nhỏ tế bào tụy lên một tấm scaffold bằng polymer. Sau đó chuyển ngược lại vào cơ thể bệnh nhân. Bằng phương pháp này đã ứng dụng điều trị trên 57 bệnh nhân bị xơ gan, tỉ lệ sống sót sau một năm cấy tế bào là 75% trên tổng số bệnh nhân. Cấy ghép tế bào tiền thân gan (tế bào oval) J.M. Lemire et al (1991) và X. Wang et al. (2003) chứng minh rằng tế bào oval có khả năng biệt hoá thành các tế bào gan trưởng thành và tế bào biểu mô ống mật. M.I. Yovchev et al. (2008) đã cấy ghép tế bào oval cho thấy sự tăng sinh và hoà nhập với 90% tế bào gan ở gan nhận được thay thế bởi tế bào oval cho trên mô hình chuột. C.X. Wu et al. (2009), tiêm tế bào oval vào gan chuột Wistar bị xơ gan có thể tăng tỉ lệ sống sót. Điều trị xơ gan bằng ghép tế bào gốc tuỷ xương Năm 2004, Isao Sakaida và cs cấy ghép tế bào gốc tuỷ xưởng kết hợp với CCl4 vào chuột bị xơ hoá gan trong báo cáo “Transplantation of Bone Marrow Cells Reduces CCl4 Induced Liver Fibrosis in Mice”. Kết quả cho thấy, chuột mô hình bệnh xơ gan giảm đáng kể sự xơ hoá gan. Các nhà khoa học Nhật bản thuộc đại học Y Yamaguchi và đại học y Tokyo đã tiến hành thử nghiệm điều trị xơ gan trên mô hình chuột bị gây xơ gan bằng Carbontetrachloride. Tế bào từ tủy xương được chuyển GFP để quan sát sự di cư và biệt hóa của tế bào ghép. Kết quả cho thấy các tế bào tủy xương tập trung tại mô gan bị xơ và biệt hóa thành tế bào gan sản xuất albumin, và biểu hiện mạnh metalloproteinases (MMPs), làm tăng cường chức năng gan, đặc biệt là sự biểu hiện hoạt tính của MMP-9, làm tăng cường tỷ lệ sống sót của chuột bị xơ gan. F. Anjos-Afonso et al. (2004), dùng tế bào gốc tuỷ xương chuột cấy ghép qua tĩnh mạch đuôi cho thấy sự chuyển biệt hoá thành tế bào giống tế bào gan trong chuột nhận NOD/SCID. M.R. Alison et al. (2000), thử nghiệm lâm sàng trên người, sử dụng nhiễm sắc thể giới tính để phân biệt tế bào cấy ghép từ người nhận có giới tính khác biệt. M. Korbling et al. (2002), và N.D. Theise et al. (2000), tế bào gốc từ tuỷ xương có thể hoà nhập vào gan và chuyển biệt hoá thành tế bào gan trưởng thành. S. Nikeghbalian et al., 2011, ghép tự thân tế bào đơn nhân và có CD133+ từ tủy xương vào các bệnh nhân cho kết quả khả quan trong việc điều trị xơ gan. Sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ A. Banas et al. (2009) cấy ghép tế bào gốc từ mô mỡ thông qua tiêm tĩnh mạch đuôi chuột , kết quả cho thấy có sự biệt hoá của tế bào ghép thành tế bào gan trưởng thành ở chuột BALB/c nude bị xơ gan do cảm ứng CCl4 5 Sử dụng tế bào gốc từ máu cuống rốn P.C. Tsai et al. (2009) tiến hành tiêm 5x105 tế bào vào thuỳ phải gan chuột bị xơ, kết quả cho thấy có sự kiềm chế xơ gan, dù chúng không biệt hoá thành tế bào gan trưởng thành. Tác giả đề nghị: các tế bào gốc không biệt hoá có thể tiết ra các cytokine nhất định như human cutaneous T cell-attracting chemokine, leukemia inhibitory factor, và prolactin sẽ giúp duy trì chức năng gan và kích thích sự tái tạo gan nội sinh. Nhóm tác giả Philip N Newsome đã sử dụng tế bào gốc từ máu cuống rốn trong điều trị xơ gan trên mô hình chuột (Philip N Newsome, 2003). Kết quả cho thấy, tế bào gốc người đã biệt hoá thành công thành tế bào gan trưởng thành với khả năng tiết mật bình thường trong điều kiện in vivo của cơ thể chuột NON-SCID. Sử dụng tế bào gốc trưởng thành từ máu ngoại vi để điều trị bệnh xơ gan Bệnh viện Hammersmith tại London, Anh đã điều trị cho hơn 30 bệnh nhân với phương pháp này và đã thu được những kết quả đầy hi vọng. Máu của bệnh nhân được thu nhận sau đó thu lấy tế bào và nuôi cấy tăng sinh tế bào và đưa tế bào ngược trở lại gan thông qua động mạch. Có sự giảm đáng kể bilirubin sau 12 tuần tiêm tế bào và giảm alanine transaminase và aspartate transaminase sau một tuần tiêm tế bào. Sử dụng tế bào gốc phôi trong điều trị xơ gan D.C. Hay et al., (2008) chỉ ra rằng tế bào gốc phôi có khả năng biệt hoá thành tế bào giống tế bào gan. T. Teratani et al. (2005), và Y. Kumashiro et al. (2005) tiến hành cấy ghép tế bào gan thu từ tế bào gốc phôi vào lách hoặc gan tổn thương của 3 chuột nhận, tình trạng xơ gan được hạn chế, chức năng gan và khả năng sống được cải thiện. J. Cai et al. (2007), dùng tế bào gốc phôi người cấy vào lách của chuột suy giảm miễn dịch cho thấy các tế bào cấy ghép có thể hoà nhập vào gan tổn thương. Sử dụng tế bào gốc cảm ứng đa tiềm năng (iPS) trong điều trị xơ gan D. Xu et al. (2008), cấy ghép tế bào tiền thân nội mô biệt hoá từ tế bào iPS vào gan chuột bị bệnh ưa chảy máu giúp cải thiện hội chứng và tỉ lệ sống, iPS có thể sử dụng cho các rối loạn di truyền ở người trong tương lai. 1.4. Tế bào gốc trung mô (MSC) 1.4.1. Giới thiệu Tế bào nền tủy xương được mô tả lần đầu tiên bởi Friedenstein, quần thể tế bào này có khả năng bám trải hình dạng giống nguyên bào sợi và có khả năng biệt hóa thành xương, Friedenstein cũng xem tế bào này như là dạng tế bào tiền thân tạo xương. Các nghiên cứu tiếp theo chỉ ra rằng các tế bào này có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào thuộc lớp trung mô bao gồm sụn, gân và nguyên bào cơ. Dựa trên khả năng biệt hóa đa dòng này, Caplan đã đưa ra thuật ngữ tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell – MSC), mặc dù có nhiều thuật ngữ khác cũng được đưa ra để mô tả quần thể tế bào không đồng nhất và đa tiềm năng này. Dù MSC là quần thể tế bào gốc (có khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào), nhưng câu hỏi được đặt ra là liệu rằng đặc tính gốc này có hay không khi chúng ở dạng tế bào đơn. Chính vì vậy, trong thời gian gần đây người ta đề xuất thuật ngữ tế bào nền trung mô đa tiềm năng (mesenchymal stromal cells) để mô tả các tế bào có khả năng bám vào bề mặt plastic khi nuôi cấy in vitro và có hình dạng giống nguyên bào sợi. Bonnet và cs đã chứng minh rằng các tế bào đơn từ quần thể MSC tủy xương chuột biểu hiện kháng 6 nguyên đặc biệt của phôi, chúng có khả năng biệt hóa in vivo, do vậy chúng thật sự mang các đặc điểm của tế bào gốc. MSC có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào như xương, mỡ, sụn [2]. Các nghiên cứu cho thấy các tế bào đa tiềm năng này không chỉ biệt hóa thành dòng trung mô mà còn biệt hóa thành các dòng thuộc nội bì và ngoại bì thần kinh bao gồm tế bào thần kinh, tế bào gan và tế bào nội mô. Các tế bào gốc đa tiềm năng được hiểu với nhiều tên gọi như tế bào tiền thân trưởng thành đa tiềm năng (multipotent adult progenitor cells – MAPCs), tế bào gốc đa tiềm năng từ tủy xương (BM-derived multipotent stem cells – BMSCs), tế bào có thể cảm ứng đa tiềm năng từ tủy xương (marrow isolated adult multilineage inducible cells –MIAMIs) hoặc là tế bào gốc giống tế bào gốc phôi rất nhỏ (very small embryonic-like stem cells – VSELs). Các tế bào này đòi hỏi điều kiện nuôi cấy chuyên biệt và nghiêm ngặt bao gồm huyết thanh bào thai bò, đĩa nuôi cấy được xử lý bề mặt, môi trường chứa các yếu tố tăng trưởng chuyên biệt và quá trình nuôi cấy kéo dài ở mật độ tế bào thấp. Việc nuôi cấy các tế bào này ở mật độ cao làm cho chúng dễ biệt hóa thành các tế bào tiền thân trung mô và giới hạn khả năng biệt hóa của nó. Mặc dù nguồn gốc của MSC được thu nhận từ tủy xương, nhưng gần đây người ta cũng có thể thu nhận được các quần thể tương tự MSC từ mô mỡ, máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối. Hiện tại, MSC không có marker chuyên biệt hoặc sự liên kết các marker nào. Về kiểu hình, MSC ex vivo biểu hiện một số marker không chuyên biệt như: CD105 (SH2 hoặc endoglin), CD73 (SH3 hoặc SH4), CD90, CD166, CD44, và CD29. MSC âm tính với các marker tạo máu và nội mô như: CD11b, CD14, CD31, và CD45. PHẦN 2: ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU 1. Tên đề tài luận án: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan trên mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế bào gốc 2. Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Gan là cơ quan có khả năng tái sinh nhưng trong các trường hợp tổn thương mạn tính khả năng tự tái tạo của gan không còn và sau đó dẫn đến tình trạng xơ hóa. Xơ gan là một bệnh nguy hiểm, tần suất cao, điều trị khó khăn. Việt Nam là nước có tỷ lệ viêm gan và xơ gan rất cao (~20%) so với nhiều nước trên Thế giới. Các biện pháp điều trị xơ gan hiện tại chưa thực sự mang lại kết quả như mong đợi. - Hiện phương pháp điều trị có hiệu quả cho xơ gan (xơ hóa gan) là cấy ghép gan. Mặc dù cấy ghép gan là liệu pháp tốt giúp kéo dài đời sống cho bệnh nhân, nhưng việc hiến tặng cơ quan là rào cản lớn nhất của liệu pháp. Số lượng bệnh nhân chờ ghép gan ngày càng tăng, trong khi mô hiến tặng thì ngày một khan hiếm. - Với các kiến thức nền tảng và chuyên sâu về tế bào gốc và y học tái tạo, các nhà khoa học có thể đặt niềm tin vào việc sử dụng tế bào gốc trong tái tạo mô gan ở các bệnh nhân xơ gan. Liệu pháp sử dụng tế bào gốc trưởng thành có 7 nhiều ưu điểm như: nguồn thu nhận dồi dào, có thể ghép tự thân, vượt qua rào cản về đạo lí. - Mô hình động vật xơ gan bằng CCL4 đã được nghiên cứu nhiều, do vậy các kết quả thử nghiệm trên động vật xơ gan có độ tin cậy cao. - Việc phát triển liệu pháp mới ứng dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan là rất cấp thiết và sẽ mở ra 1 hướng mới trong điều trị xơ gan nói riêng và các bệnh về thoái hoá tế bào nói chung. - 3. Mục đích nghiên cứu của luận án Mục tiêu chung: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm chuột bệnh xơ gan bằng tế bào gốc. Mục tiêu cụ thể: Thu nhận được tế bào gốc từ các nguồn mẫu: tủy xương và mô mỡ chuột. Nghiên cứu khả năng chuyển biệt hóa của MSCs thành tế bào gan dưới sự tác động của hóa chất và của dịch chiết gan Gây tạo được mô hình bệnh xơ gan trên chuột. Phân tích và đánh giá hiệu quả điều trị thực nghiệm của tế bào gốc được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau (tủy xương, mô mỡ,…) trên chuột bệnh xơ gan theo các phác đồ khác nhau 4. Đối tượng, phương pháp nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Nghiên cứu này được tiến hành trên dòng tế bào gốc trung mô người hay chuột, và chuột nhắt trắng (hoặc chuột Bald-C). - Các phương pháp chính sử dụng nghiên cứu: Phương pháp 1: Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương và mô mỡ chuộc Phương pháp 1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương Nguyên tắc: Trong tủy xương, các quần thể tế bào có thể thu nhận được là: 1. Tế bào hồng cầu (trưởng thành và chưa trưởng thành); 2. Tế bào bạch cầu (trưởng thành và chưa trưởng thành); 3. Tế bào nền tủy xương; 4. Tế bào mỡ; 5. Tế bào gốc. Trong các quần thể tế bào trên, quần thể hồng cầu, bạch cầu trưởng thành và tế bào mỡ là không có khả năng bám vào bề mặt nuôi cấy hoặc chỉ trong thời gian ngắn. Vì vậy, trong điều kiện nuôi cấy bám dính, các tế bào này sẽ bị loại bỏ sau các lần thay môi trường. Tế bào bạch cầu chưa trưởng thành, một số tế bào nền tủy xương có khả năng bám dính chọn lọc, tuy nhiên điều kiện môi trường nuôi cấy không thích hợp nên đời sống của các tế bào này rất ngắn. Quần thể tế bào gốc chứa 2 loại chính: tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô, trong 2 loại này chỉ có tế bào gốc trung mô là có khả năng bám dính và tăng sinh vô hạn trong điều kiện in vitro. Phương pháp 1.2. Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột Mô mỡ chuột được thu nhận và sử dụng bộ kít tách chiết tế bào gốc mô mỡ ADSC extract Kit (GW Ltd.) để phân tách tế bào gốc. Tế bào sau khi thu nhận được nuôi cấy trong môi trường MSC Cult Pro Kit (GW Ltd.). Phương pháp 2: Khẳng định tế bào gốc sau thu nhận là tế bào gốc trung mô 8 Nguyên tắc: Dựa vào khả năng bám dính của MSC vào bề mặt nuôi cấy, sau từ 3-5 lần cấy chuyền sẽ thu được quần thể tế bào tương đối đồng nhất. Thông thường để khẳng định tế bào gốc chuột ứng viên là MSC dựa vào các chỉ tiêu sau: - Về hình thái tế bào: các tế bào có hình dạng giống nguyên bào sợi khi bám dính vào bề mặt dụng cụ nuôi cấy. - Về marker bề mặt: các MSC từ tủy xương chuột dương tính với CD44, Sca-1 và CD90 trong khi đó lại âm tính với CD34, CD11b, CD31, CD106 (Vcam-1), CD117 (ckit) và CD135. - Về khả năng biệt hóa: các MSC có khả năng biệt hóa thành xương, sụn và mỡ. Trong nghiên cứu này, các MSC được đánh giá dựa vào tất cả các đặc điểm trên. Về mặt hình thái tế bào, sử dụng kính hiển vi để quan sát hình dạng các tế bào trong suốt thời gian nuôi cấy sơ cấp và thứ cấp. Marker tế bào được đánh giá bằng kỹ thuật Flow cytometry. Khả năng biệt hóa được đánh giá thông qua khả năng biệt hóa của MSC thành 2 dạng tế bào: xương và mỡ. Phương pháp 3: Biệt hóa tế bào gốc trung mô Phương pháp 3.1. Biệt hóa thành nguyên bào xương Nguyên tắc: Sự biệt hóa thành xương được xác định là trạng thái biệt hóa cuối cùng của các dòng MSC. Một vài cocktail được sử dụng cảm ứng tế bào MSC thành các nguyên bào xương. Sự tiếp xúc một thời gian dài của MSC với công thức dexamethasone, AsAP và beta-glycerolphosphate cho kết quả là sự tích tụ calcium trong chất nền và sự biểu hiện các marker tạo xương như sialoprotein xương osteocalcin và osteonectic. Quy trình biệt hóa thành xương: - Môi trường biệt hóa xương DMEM bổ sung 10mM β-glycerolphosphate (Sigma), 50µg ascorbate (Sigma), 10-7 M dexamethasone (Sigma) (Eslami nejad et al., 2006; Phạm Văn Phúc và cs, 2009). - Trải tế bào khoảng 10.000 tế bào/cm2 trong lớp đơn. - Nuôi cấy trong khoảng 14-21 ngày và thay môi trường 2 lần/tuần. - Nuôi cấy lớp đơn để cố định cho phân tích mô học. - Đánh giá kết quả: tế bào sau biệt hóa 21 ngày được đánh giá sự biểu hiện của calciumphosphate bằng nhuộm hóa mô. Các tế bào dương tính thuốc nhuộm với xét nghiệm này được cho là biệt hóa thành công. Phương pháp 3.2. Biệt hóa thành tế bào mỡ Nguyên tắc: Sự biệt hóa tạo mỡ của MSC có một số điểm quan trọng. Sự biệt hóa của MSC thành tế bào xương và mỡ được điều hòa tế nhị và cân bằng. Với việc bổ sung dexamethasone, indomethacin và ascorbate, MSC trong nuôi cấy lớp đơn sẽ đi vào sự biệt hóa tạo mỡ. Quy trình biệt hóa tạo mỡ - Môi trường biệt hóa mỡ DMEM bổ sung 50 µg indomethacin (Sigma), 50µg ascorbate (Sigma), 10-7 M dexamethasone (Sigma) (Eslami nejad et al., 2006; Phạm Văn Phúc và cs, 2009). - Tế bào đạt 80% độ bao phủ khi nuôi cấy lớp đơn thích hợp cho cảm ứng biệt hóa. 9 Nuôi cấy trong khoảng 21-28 ngày và thay môi trường 2 lần/tuần. Nuôi cấy lớp đơn để cố định cho phân tích mô học. Lipid có thể nhìn thấy rõ vào ngày 7 và có thể quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược. Đánh giá kết quả: Tế bào sau khi biệt hóa 21 ngày được đánh giá sự tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất bằng cách quan sát dưới kinh hiển vi và bằng nhuộm Oil Red. Có sự biện diện của các tế bào tích tụ những giọt mỡ được cho là quá trình biệt hóa thành công. Phương pháp 4: Nhuộm hóa mô và tế bào Phương pháp 4.1. Phương pháp nhuộm Alizarin Red Nguyên tắc: Alizarin(1,2-dihydroxyanthraquinone) là một loại thuốc nhuộm có nguồn gốc thực vật. Trong rễ cây thiên thảo (Rubia tinctorum), chúng tồn tại ở dạng glycoside. Alizarin còn bao gồm một nhóm các thuốc nhuộm tổng hợp từ các dẫn xuất nhựa than đá. Alizarin red là dẫn xuất của Alizarin, được sử dụng để phát hiện ra ion calci có trong các mẫu mô hay tế bào. Sự kết hợp giữa ion calci và Alizarin red tạo ra một phức hợp Alizarin Red S-calci có màu đỏ cam. Phương pháp 4.2. Phương pháp nhuộm Oil red Nguyên tắc: Oil red là thuốc nhuộm có màu đỏ, hòa tan trong lipid. Khi nhuộm mẫu tế bào cố định, bất kì nơi nào có chứa các giọt mỡ, Oil Red sẽ hòa tan vào trong đó làm chúng có màu đỏ. Đánh giá kết quả: những tế bào mỡ sẽ có tích trữ các giọt mỡ màu đỏ của thuốc nhuộm. Phương pháp 4.3. Phương pháp nhuộm Hoechst Nguyên tắc: Hoechst 33258 là thuốc nhuộm DNA, nó gắn vào liên kết A-T trên DNA. Các tế bào không cần tăng sự thấm trước khi nhuộm, nhưng cần điều kiện sinh lý thích hợp bởi vì sự hấp thu thuốc nhuộm là một quá trình vận chuyển chủ động. Điều kiện nhuộm thay đổi tùy theo loại tế bào. Quy trình dưới đây được sử dụng cho hầu hết các trường hợp nhuộm Hoechst. Phương pháp 5: Đánh giá marker tế bào bằng kỹ thuật dòng chảy tế bào (Flow cytometry) Nguyên tắc: Flow cytometry là công nghệ định lượng và phân tích đa đặc điểm của đơn vật thể thông thường là tế bào khi chúng chảy thành dòng xuyên qua một chùm ánh sáng. Các tính chất được định lượng bao gồm kích thước, tính chất hạt hoặc mức độ phức tạp bên trong và mật độ phát huỳnh quang. Các đặc điểm này được quyết định bởi việc sử dụng hệ thống đôi quang học – điện tử, chúng ghi nhận sự phát quang của tế bào. Quy trình chuẩn bị tế bào cho phân tích Flow cytometry (theo hướng dẫn của BD Science). Trong nghiên cứu này, việc đánh giá marker của MSC sau nuôi cấy được tiến hành dựa theo quy trình này và các tế bào ở lần cấy chuyền 3-5 được chọn để phân tích marker đặc trưng cho MSC. Phương pháp 6: Đánh dấu tế bào bằng thuốc nhuộm PKH 26 (Sigma) PKH26GL cell linker kit là công nghệ đánh dấu màng tế bào kết hợp với thuốc nhuộm phát quang gắn vào vùng lipid của màng tế bào. Kít đi kèm với dung dịch đồng áp suất - 10 thẩm thấu (Diluent C) không chứa muối hoặc dung dịch đệm, chất tẩy hoặc dung môi hữu cơ và dung dịch này được thiết kế để duy trì khả năng sống sót của tế bào trong suốt quá trình nhuộm. Kiểu hình tế bào nhuộm phụ thuộc vào kiểu tế bào và màng tế bào. PKH26 là chất phát quang màu đỏ và có thể kiểm tra bằng nhiều hệ thống thiết bị nên thường ứng dụng trong đánh dấu tế bào in vitro và ex vivo, nghiên cứu sự tăng sinh tế bào in vitro và theo dấu tế bào in vitro và in vivo. Phương pháp 7: Đánh giá sự biểu hiện các gen thuộc dòng tế bào gan bằng phương pháp Real time RT-PCR - Thu nhận RNA của tế bào sau biến nạp đã được chọn lọc. - Tổng hợp cDNA từ RNA (1µg) sử dụng Superscript First-strand synthesis system (Gibco BRL). - Phản ứng reverse transcription được tiến hành ở nhiệt độ 420C trong 2 giờ gồm các thành phần: 1RT buffer, 1.25 mM Mgcl, 5 mM DTT, 2.5 g random hexamer, 0.5 mM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, và 50 units enzyme Superscript II (Gibco BRL), (tổng thể tích phản ứng là 20 µl). Sau bước này, dùng 2 unit RNase để loại RNA. - Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt Phương pháp 8: Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào thuộc dòng tế bào gan MSC sau khi được nuôi cấy và khẳng định marker và tiềm năng biệt hóa sẽ được nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào gan trong thời gian khoảng 10 ngày. Các tế bào sau biệt hóa được đánh giá sự biệt hóa ở mức phiên mã và hình thái tế bào. Phương pháp 9: Đánh giá tỉ lệ sống chết bằng phương pháp đếm tế bào nhuộm nhân tự động (theo qui trình của nhà sản xuất Nucleo Counter) Phương pháp 10: Gây tạo mô hình chuột xơ gan Chuột được phân chia thành 2 lô: Lô Đối chứng: cho uống dầu bắp 0,2 ml/con Lô Thí nghiệm: cho uống CCl4 liều 0,5 – 1.2 ml/kg pha trong dầu olive. Cho uống 2 lần/ tuần liên tục trong 8 tuần. Phương pháp 11: Cấy ghép tế bào vào chuột xơ gan Quy trình 11.1. Ghép tế bào vào tĩnh mạch đuôi Trên mô hình chuột, việc tiêm các loại thuốc hay tế bào cấy ghép vào tĩnh mạch đuôi chuột là phương pháp đơn giản nhất và thường được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng. Trong nghiên cứu này, tế bào được đưa vào tĩnh mạch đuôi chuột đã xơ gan. Nhóm nghiên cứu hy vọng tế bào sẽ nhận được các tín hiệu từ gan và di cư đến gan, cải thiện tình trạng xơ gan. Quy trình 11.2. Ghép tế bào vào tĩnh mạch cửa gan Tĩnh mạch cửa còn gọi là tĩnh mạch gánh, vì nó chia nhánh ở 2 đầu. Tĩnh mạch cửa được tạo nên bởi: tĩnh mạch lách, tĩnh mạch mạc treo tràng trên, tĩnh mạch mạc treo tràng dưới. Thân tĩnh mạch cửa khá dài và có đường kính lớn. Khi tới gan tĩnh mạch cửa phân chia nhỏ dần: đầu tiêu là hai nhánh gan trái, gan phải, rồi các nhánh của tiểu thuỳ cho tới tận các xoang gan, rồi từ xoang gan máu lại đổ vào các tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ, các tĩnh mạch này dần dần tụ lại thành các nhánh của tĩnh mạch trên gan, cuối cùng đổ vào tĩnh mạch chủ dưới và về tim. 11 Trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu ghép tế bào trực tiếp vào tĩnh mạch cửa gan với hy vọng tế bào gốc sẽ di cư đến vùng gan bị xơ nhanh nhất. Mặt khác do tĩnh mạch cửa gan có đường kính tương đối lớn nên tạo điều kiện dễ dàng cho thao tác tiêm tế bào. Khi tế bào đi qua vùng gan bị xơ, các tĩnh mạch sẽ nhỏ dần, tế bào sẽ có điều kiện thuận lợi hơn để định cư tại gan. Phương pháp 12: Đánh giá sự tồn tại, sự sống sót và sự di cư của tế bào sau cấy ghép trong in vivo. Các tế bào trước khi cấy ghép được đánh dấu màng tế bào bằng một chất phát huỳnh quang (theo phương pháp 6). Dựa trên đặc điểm này có thể theo dõi sự tồn tại và di cư của tế bào trên cơ thể chuột. Nhằm đánh giá sự sống sót của tế bào sau khi ghép, tiến hành thu nhận vùng mô được ghép sau 24 giờ, tiến hành nhuộm nhân tế bào bằng thuốc nhuộm Hoechst. Phương pháp 13: Phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang Hóa mô miễn dịch là quá trình các protein trong tế bào của mô gắn với kháng thể tương ứng của chúng theo nguyên tắc kháng nguyên kháng thể. Các kháng thể được gắn với các chất chỉ thị hoặc phát quang để dễ dàng quan sát. 5. Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành các nội dung sau: Nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy và xác định đặc điểm của tế bào gốc Trong nội dung này, các tế bào gốc được thu nhận từ nhiều nguồn mẫu khác nhau như tủy xương và mô mỡ. Các nguồn thu nhận này đều nhằm hướng đến việc cấy ghép tự thân để hạn chế khả năng thải loại miễn dịch. Việc thực hiện nội dung này được tiến hành như sau: MSC từ tủy xương và mô mỡ được thu nhận theo Phương pháp 1. Các tế bào gốc trung mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền được xác định - Về hình thái tế bào: được quan sát dưới kính hiển vi - Về độ tinh sạch dựa vào sự biểu hiện các marker: như CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD90, CD166 và HLA-DR bằng kĩ thuật flow cytometry trên máy FACSCalibur của BD Bioscience (theo phương pháp 5) - Về khả năng biệt hóa: biệt hóa thành tế bào tạo xương và mỡ (theo phương pháp 2, 3 và 4) Nội dung 2: Gây tạo mô hình chuột bệnh xơ gan bằng CCl4 CCl4 là một tác nhân gây độc gan điển hình, được sử dụng rộng rãi trong nhiều mô hình thực nghiệm khác nhau trên thế giới và Việt Nam. Liều xử lý CCl 4 thường sử dụng gây độc gan trong khoảng 0,5 – 1 ml/kg (Ming-Ling Chang và cộng sự, 2005; Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2007). 12 Chuột được uống CCl4 liều 0,5 – 1.2 ml/kg pha trong dầu olive, 2 lần/ tuần liên tục trong 8 tuần. Sau khi kết thúc xử lí CCl4 tiến hành đánh giá sự xơ gan dựa trên các chỉ tiêu: Chỉ tiêu 1: Xét nghiệm sinh hóa (ALT, AST huyết thanh) Chỉ tiêu 2: Đánh giá mô học Nhuộm HE, trichrome, PAS, reticulin để đánh giá tình trạng nghịch sản, viêm gan, xơ gan trên mô gan xung quanh u. Tình trạng viêm và xơ hóa theo thang điểm HAI gồm các đặc điểm: hoại tử quanh khoảng cửa, hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm, hoại tử trong tiểu thùy, viêm khoảng cửa, giai đoạn xơ hóa. Chúng tôi đánh giá mức độ viêm gan và giai đoạn xơ hóa dựa theo chỉ số hoạt tính mô học Knodell-Ishak ( Ishak Modified HAI): mức độ viêm, giai đoạn xơ hóa, liên quan giữa tổng số điểm và mức độ hoạt tính của viêm. Nội dung 3: Xác định sự biểu hiện gen liên quan đến dòng tế bào gan của tế bào MSC và cảm ứng MSC thành tế bào gan in vitro Nội dung 3.1. Xác định sự biểu hiện gen liên quan đến dòng tế bào gan của tế bào MSC in vitro Mục tiêu: đánh giá sự biểu hiện các gen có liên quan đến dòng tế bào gan nhằm bước đầu nhận định tiềm năng của MSC trong trị liệu các bệnh xơ gan và suy thoái tế bào gan nói chung. - Nguyên tắc và tiến hành: Tiềm năng điều trị của MSC có thể được tiên đoán thông qua sự biểu hiện gen. MSC biểu hiện các gen đặc trung cho tế bào thuộc lớp trung bì như xương, sụn và mỡ. Ngoài ra, MSC cũng biểu hiện các gen thuộc biểu mô, nội mô và tế bào thần kinh. Nhiều nghiên cứu đã và đang tiến hành đánh giá các gen liên quan đến sự phát triển tế bào gan. Nhằm mục đích đánh giá tiềm năng chữa trị và thay thế của MSC, nội dung nghiên cứu này được thiết kế để đánh giá sự biểu hiện gen của MSC ở các thế hệ tế bào khác nhau. Việc khảo sát sự biểu hiện profile gen của MSC ở các thế hệ khác nhau nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của việc nuôi cấy trên sự biểu hiện gen của tế bào. Nội dung này được tiến hành như sau: Các MSC được thu nhận từ Nội dung 1 được nuôi cấy và tăng sinh để đảm bảo đủ số lượng và thế hệ phục vụ cho nghiên cứu. Tế bào ở thế hệ thứ 3, 5 và 10 được tiến hành khảo sát sự biểu hiện gen ở mức phiên mã theo Phương pháp 7. Các gen dự định tiến hành phân tích bao gồm các gen liên quan đế sự phát triển và biệt hóa tế bào gan albumin, Muc-1, AFP, ALB, CK18 và CK19. Kết quả của nội dung: kết quả so sánh sự biểu hiện gen liên quan đến tiềm năng biệt hóa thành tế bào gan của 3 nguồn MSC ở các thế hệ tế bào khác nhau. Nội dung 3.2. Cảm ứng biệt hóa MSC thành tế bào gan - Mục tiêu: đánh giá và khẳng định khả năng chuyển biệt hóa của MSC thành tế bào gan. - Nguyên tắc và tiến hành: theo nhiều nghiên cứu MSC khi chưa biệt hóa có biểu hiện một số gen quan trọng liên quan đến sự phát triển, biệt hóa tế bào gan. Điều này cho 13 thấy, MSC hoàn toàn có khả năng biệt hóa thành tế bào gan khi được cảm ứng với một kích thích nhất định. Nhiều nhóm nghiên cứu đã tiến hành cảm ứng MSC trong các môi trường cơ bản cho tế bào gan nhằm mục đích chứng minh khả năng chuyển biệt hóa của MSC thành tế bào gan. Nội dung này được tiến hành như sau: Nội dung 3.2.1: Đánh giá sự thay đổi của MSCs dưới tác động của hóa chất cảm ứng định hướng thành tế bào gan. Các MSC được nuôi cấy trong môi trường cảm ứng (IMDM bổ sung 20 ng/mL HGF, 0.5 uM dexamethasone, and 50 mg/mL ITS+) trong 14 ngày. Sau đó , nuôi cấy trong môi trường trưởng thành cho tế bào gan (IMDM bổ sung 20 ng/mL OSM, 0.5 uM dexamethasone, and 50 mg/mL ITS+), thời gian cảm ứng biệt hóa từ 30-40 ngày. Nội dung 3.2.2: Đánh giá sự thay đổi của MSCs dưới tác động của dịch chiết gan Các MSC được nuôi cấy trong môi trường bổ sung dịch chiết gan (gan lành và gan xơ) ở các nồng độ khác nhau. Sau đó, các tế bào đã biệt hóa được đánh giá: - Sự thay đổi kiểu hình tế bào - Sự thay đổi trong sự biểu hiện các gen Muc-1, AFP, CK18, CK19 alpha-1 antitrypsin (AAT), tyrosine amino transferase (TAT), LDL receptor (LDLR), và glucose 6-phosphatase (G6P) (theo phương pháp 7). Kết quả này được so sánh với house keeping gene và MSC đối chứng chưa biệt hóa. - Chức năng của tế bào đã biệt hóa được đánh giá thông sự biểu hiện protein ALB, AAT, albumin bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (phương pháp 13). Nghiên cứu này được tiến hành lặp lại ít nhất 3 lần, số mẫu được sử dụng ít nhất là 10 mẫu cho mỗi lô; số lượng tế bào được đánh giá trong mỗi mẫu ít nhất là 105 tế bào. Tất cả các số liệu thu được được phân tích bằng phần mềm thống kê, với độ tin cậy 95%. Nội dung 4: Thử nghiệm điều trị chuột bệnh xơ gan bằng cấy ghép tế bào gốc Tế bào gốc thu nhận từ nội dung 1 và chuột xơ gan từ nội dung 2 được sử dụng cho nội dung nghiên cứu này. Chuột xơ gan bằng CCL4 đạt yêu cầu về chỉ tiêu sinh hóa và mô học sẽ được sử dụng để nghiên cứu. Trong nghiên cứu này gồm các nghiệm thức sau: Tiến hành theo các nghiệm thức sau: 14 Tủy xương chuột (đồng ghép) Mô mỡ người (Ghép tự thân) Tế bào gốc trung mô Tĩnh mạch Chuột mô hình xơ gan Xét nghiệm sinh hóa Tĩnh mạch cửa gan Đánh giá mô học - Nghiệm thức 1: chuột xơ gan đối chứng không ghép tế bào (tiêm PBS) - Nghiệm thức 2: chuột không gây mô hình bệnh (chuột thường) - Nghiệm thức 3,4,5: ghép 106 tế bào từ tủy xương vào lần lượt tĩnh mạch, tĩnh mạch cửa gan - Nghiệm thức 6,7,8: ghép 106 tế bào từ mô mỡ vào lần lượt tĩnh mạch, tĩnh mạch cửa gan Chuột sau khi ghép tế bào sẽ được kiểm tra, đánh giá sự hồi phục dựa trên các chỉ tiêu: Về sự phục hồi sức khỏe chuột và phục hồi bệnh - Sự thay đổi men gan thông qua các xét nghiệm sinh học - Sự thay đổi cấu trúc mô học Về vai trò của tế bào gốc - Sự di cư/cư trú của tế bào ghép sau khi ghép - Sự biệt hóa tế bào ghép sau khi sát nhập - Sự hình thành khối u sau khi ghép 6. Dự kiến kết quả đạt được - Quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ tủy xương và mô mỡ - Kết quả về sự biểu hiện các gen liên quan đến dòng tế bào gan của MSC in vitro ở các thế hệ tế bào khác nhau. - Kết quả biệt hóa MSC thành tế bào gan. - Mô hình chuột bệnh xơ gan do CCl4 - Kết quả điều trị chuột bệnh xơ gan bằng MSC với các phác đồ khác nhau 15 7. Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận án Nghiên cứu này sẽ thực hiện tại: PTN Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc, ĐH KHTN, ĐH Quốc gia Tp.HCM 8. Các tài liệu tham khảo được sử dụng khi viết đề cương [1] Autologous bone marrow cells in the treatment of cirrhosis of the liver; Chernykh ER, Starostina NM, Paltsev AI, Leplina OY, Shevela EY, et al.; Bull Exp Biol Med; 2007; 144: 640–645. [2] Autologous Transplantation of Bone Marrow-derived Mononuclear and CD133+ Cells in Patients with Decompensated Cirrhosis; Saman Nikeghbalian MD1*, Behshad Pournasr MSc, Nasser Aghdam, Alireza Rasekhi, Bita Geramizadeh, Seyed Mohammad Kazem Hosseini-Asl, Mani Ramzi, Farzad Kakaei, Mehrnaz Namiri, Reza Malekzadeh, Ahmad Vosough Dizaj, Seyed Ali Malek-Hosseini, Hossein Baharvand; Archives of Iranian Medicine, 2011, 14 (1) [3] Cell-delivery therapeutics for liver regeneration; Wenxia Zhang, Lisa Tucker-Kellogg, B.C. Narmada, Lakshmi Venkatraman, Shi Chang, Yin Lu, Nancy Tan, Jacob K. White, Ruirui Jia, Sourav Saha Bhowmick, Shali Shen, C. Forbes Dewey Jr., Hanry Yu; Advanced Drug Delivery Reviews, 2010, 62: 814–826 [4] Critical review of clinical trials of bone marrow stem cells in liver disease; Houlihan DD, Newsome PN; Gastroenterology; 2008; 135: 438 – 450. [5] Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy; Terai S, Ishikawa T, Omori K, Aoyama K, Marumoto Y, Urata Y, et al.; Stem Cells. 2006; 24: 2292 - 2298. [6] Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial; Kharaziha P, Hellstrom PM, Noorinayer B, Farzaneh F, Aghajani K, Jafari F, et al. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009; 21: 1199 – 1205. [7] Liver cell transplantation: the road to clinical application; K.J. Allen, H.E. Soriano; J. Lab. Clin. Med.; 2001; 138: 298–312. [8] Liver fibrosis: from mechanisms to treatment; Scott L. Friedman; Gastroenterol Clin Biol 2007; 31: 812-814 [9] Liver fibrosis; Ramón Bataller1 and David A. Brenner2; The Journal of Clinical Investigation 2005 115 (2):209–218 [10] Liver transplantation: from Child to MELD ; J.F. Gallegos-Orozco, H.E. Varga;, Med. Clin. North Am.; 2009; 93: 931–950 ix. [11] Mechanisms of Hepatic Fibrogenesis; Scott L. Friedman; Gastroenterology; 2008 May; 134(6): 1655–1669. [12] Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor; Tsutomu Fujii†1, Bryan C Fuchs†1, Suguru Yamada1, Gregory Y Lauwers2, Yakup Kulu1, Jonathan M Goodwin3, Michael Lanuti3 and Kenneth 16 K Tanabe*1; BMC Gastroenterology 2010, 10:79 [13] Phase 1 trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis; Mohamadnejad M, Alimoghaddam K, Mohyeddin-Bonab M, Bagheri M, Bashtar M, Ghanaati H, et al. Arch Iran Med. 2007; 10: 459 – 466. [14] Reduction of Liver Fibrosis by Xenogeneic Human Umbilical Cord Blood and Adipose Tissue-derived Multipotent Stem Cells without Treatment of an Immunosuppressant; Yeong-Geon Lee, Jae-Woong Hwang, Sang-Bum Park, IlSeob Shin, Soo-Kyung Kang, Kwang-Won Seo, Yong-Soon Lee1 and KyungSun Kang; Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2008, 5 ( 4~6): 613621. [15] Stem cell therapy for liver disease: parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells; Kuo TK, Hung SP, Chuang CH, Chen CT, Shih YR, Fang SC, et al.; Gastroenterology. 2008; 134: 2111 – 2121, 2121 e1–3. [16] Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver _brosis in mice; Sakaida I, Terai S, Yamamoto N, Aoyama K, Ishikawa T, Nishina H, et al. Hepatology; 2004; 40: 1304 – 1311. [17] Transplanted Human Amniotic Membrane-Derived Mesenchymal Stem Cells Ameliorate Carbon Tetrachloride-Induced Liver Cirrhosis in Mouse; DingGuo Zhang, MinYue Jiang, DengShun Miao*; PLoS ONE; 2011; 6(2): e16789. [18] Treatment of cirrhosis and liver failure in rats by hepatocyte xenotransplantation ; H. Nagata, M. Ito, J. Cai, A.S. Edge, J.L. Platt, et al.; Gastroenterology; 2003; 124: 422–431. [19] Treatment of liver failure in rats with end-stage cirrhosis by transplantation of immortalized hepatocytes ; J. Cai, M. Ito, H. Nagata, K.A. Westerman, D. Lafleur, et al.; Hepatology; 2002; 36: 386–394. 17
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan