Tài liệu Tối ưu quy trình xác định đột biến atp7b trên bệnh nhân nhân wilson

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đồng là một nguyên tố vi lượng thiết yếu cho cơ thể sinh vật, tham gia vào cấu tạo nhiều enzym quan trọng, tuy nhiên, nồng độ đồng caogây độc cho tế bào. Bệnh Wilson là một trong số những bệnh lý gây ra bởi sự nhiễm độc đồng, lần đầu tiên được mô tả năm 1912 do nhà thần kinh học người Anh, Samuel Alexander Kinnier Wilson. Bệnh Wilson hay còn gọi là bệnh thoái hoá gan- nhân đậu hoặc bệnh thoái hoá gan não, là một bệnh gây ra do rối loạn chuyển hoá đồng, đặc trưng bởi sự tích luỹ đồng trong gan, não và một số mô khác [2, 3]. Trong bệnh Wilson, đồng không được chuyển hoá thành ceruloplasmin để vận chuyển vào máu mà tích luỹ trong gan gây tổn thương tế bào. Khi tế bào gan mất chức năng, đồng vào máu dưới dạng tự do và kết tủa ở nhiều mô đặc biệt là thận, mắt và não. Mặc dù là một bệnh hiếm gặp song do ảnh hưởng đến nhiều mô và cơ quan, người bệnh dễ dẫn đến tử vong nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Các nghiên cứu về bệnh Wilson có nhiều thành công trong đó, một trong những nghiên cứu có giá trị nhất được công bố năm 1993, Cox,D.W và Bull,P.C cùng các cộng sự về mối liên quan giữa bệnh Wilson và các đột biến trên gen ATP7B quy định cấu trúc của một protein vận chuyển đồng. Theo đó, bệnh Wilson chịu sự chi phối của quy luật di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường. Bố và mẹ mang kiểu gen dị hợp tử có thể sinh ra con bị bệnh Wilson. Vì vậy, việc nghiên cứu sinh học phân tử phát hiện đột biến ở bệnh nhân và người nhà bệnh nhânkhông chỉ có vai trò trong chẩn đoán bệnh mà còn có ý nghĩa trong tư vấn di truyền. 2 Mặt khác,đột biến trên gen ATP7B ảnh hưởng đến các vùng chức năng khác nhau của protein, làm mất hoàn toàn hoặc một phần chức năng vận chuyển đồng của protein, như vậy theo thời gian sự lắng đọng đồng trong các mô ngày càng nhiều, mức độ tổn thương tế bào càng nghiêm trọng. Sử dụng thuốc điều trị nhằm giảm lượng đồng tích luỹ phải phù hợp với từng thể bệnh, mức độ bệnh, tuổi phát bệnh… những biểu hiện kiểu hình này đều có mối liên hệ với các đột biến trên gen. Dó đó, nghiên cứu “Tối ưu hoáquy trình xác định đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson”được thực hiện nhằm mục tiêu: 1. Áp dụng quy trình xác định đột biến trên gen ATP7B gây bệnh Wilson bằng phương pháp giải trình tự gen. 2. Bước đầu xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh Wilson 1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh Từ cuối thế kỉ XIX, một bệnh lý với biểu hiện xơ gan kết hợp thần kinh đã được biết đến, song không được mô tả hoàn thiện về triệu chứng và nguyên nhân gây bệnh. Cho đến năm 1912, nhà thần kinh học người Anh, Samuel Alexander Kinnier Wilson (1878-1937), đã công bố báo cáo về 12 trường hợp “rối loạn thần kinh hiếm gặp” bao gồm 8 bệnh nhân đã được đề cập đến trong y văn trước đó và 4 bệnh nhân do ông theo dõi[4]. Theo ông, “một tác nhân gây bệnh” dẫn đến các biểu hiện lâm sàng có thể là kim loại. Ông cũng chứng minh rằng hàm lượng đồng tăng trong não cũng như trong gan ở những bệnh nhân này[5]. Sau đó, căn bệnh này được biết đến với tên gọi là bệnh Wilson. 1948, báo cáo của Cuming đã chỉ ra có sự xuất hiện một lượng kim loại dư thừa trong cả gan và não ở những bệnh nhân Wilson đã tử vong[6]. Năm 1985, bất thường về gen gây bệnh Wilson được nhận định nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 13[7]. Năm 1993, Peter Bull và cộng sự xác định vị trí và phân lập được đoạn gen. Protein mà gen này mã hoá là một protein thuộc nhóm ATPase loại P vận chuyển đổng qua màng tế bào có ảnh hưởng đến bệnh Wilson, tuy nhiên vị trí chính xác và chức năng của nó trong tế bào gan vẫn chưa được làm rõ [8, 9]. Từ đó, hàng trăm công trình nghiên cứu xác định đột biến, biến đổi cấu trúc, chức năng protein, phân tích mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình được thực hiện, dần làm sáng tỏ cơ chế gây bệnh của đột biến[10, 11, 12, 13]. 4 5 1.1.2. Dịch tễ học Wilson là bệnh di truyền có thể gặp ở mọi dân tộc trên thế giới với tỉ lệ mắc bệnh xấp xỉ 1/30000 trẻ sơ sinh[14], tần số alen là 0,56%; tần số người mang alen đột biến là 1/90. Tỉ lệ này không đồng nhất ở các vùng dân cư: ở cộng đồng người Mỹ da trắng là 1/55000[15];trong khi đó, ở cộng đồng người Hàn Quốc là 1/37000 [16]. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu sàng lọc bệnh Wilson trên thực tế tại các khu vực khác nhau trên thế giới lại cho thấy con số lớn hơn rất nhiều: cộng đồng Đông Á có tỉ lệ ~1/1500[17]đến ~1/3000[18]; cộng đồng Ireland, tần số gen là 0,41% cho thấy cứ 122 người có 1 người mang gen đột biến[19]; ở Anh, tỉ lệ này là ~1/7000; đặc biệt tỉ lệ mắc bệnh cao nhất là ở một ngôi làng nhỏ trên đảo Crete với tỉ lệ mắc là 1/15 trẻ sơ sinh và tần số người mang đột biến là 1/11[20]. Wilson là một bệnh bẩm sinh nhưng các triệu chứng không xuất hiện ngay từ lúc sinh ra, thường xuất hiện ở độ tuổi từ 5 đến 35, cũng có nghiên cứu cho thấy tuổi khởi phát từ 3 đến 70 tuổi[2], tuổi trung bình phát bệnh là 15,9[21]. Đa số bệnh nhân có biểu hiện thần kinh khi còn nhỏ (dưới 12 tuổi) và chủ yếu trong số đó không có triệu chứng về gan hoặc chỉ xuất hiện sau một năm theo dõi[1]. Bệnh Wilson do đột biến gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường,nên về mặt lý thuyết thì tỉ lệ mắc bệnh ở hai giới là như nhau. Một số báo cáo phân tích thấy được tỉ lệ mắc bệnh ở nam giới cao hơn nữ giới một phần nhỏ (52%)[22]. Tại thời điểm chẩn đoán, nam giới có triệu chứng thần kinh cao hơn nữ giới (75% và 58%), có tỉ lệ mắc bệnh gan thấp hơn (25% và 41%). Một số nghiên cứu khác thấy rằng nữ giới có khả năng phát triển suy gan cấp tính do bệnh Wilson cao hơn nam giới[23, 24]. Nghiên cứu sự khác nhau giữa 6 hai giới về thể gan và thể thần kinh ở bệnh Wilson trên 627 bệnh nhân cho thấy, thể thần kinh chiếm ưu thế ở cả hai giới. Bệnh gan xảy ra thường xuyên hơn ở nữ và thường phát triển các triệu chứng thần kinh muộn hơn gần hai năm so với nam giới. Các nhà khoa học cho rằng sự khác biệt này có thể do tác dụng bảo vệ của estrogen và chuyển hoá sắt khác nhau[22]. 1.1.3. Triệu chứng, chẩn đoán và điều trị 1.1.3.1. Triệu chứng lâm sàng Do sự tích luỹ đồng dẫn đến tổn thương ở nhiều mô khác nhau nên biểu hiện lâm sàng trên hầu hết các bệnh nhân Wilson là không giống nhau. Tuy nhiên, luôn có biểu hiện về gan hoặc thần kinh bị tổn thương[25, 26, 27]. Thể gan: gan to không triệu chứng (có hoặc không có lách to), viêm gan cấp hoặc mạn, suy gan cấp (có thể kèm theo thiếu máu tan máu). Tăng huyết áp tĩnh mạch, xơ gan không rõ nguyên nhân, phù, giãn mạch, cổ trường hoặc các rối loạn chức năng gan khác (chậm dậy thì, vô kinh, rối loạn đông máu..) cũng có thể là những biểu hiện của bệnh Wilson[28]. Ung thư biểu mô tế bào gan hiếm gặp ở những bệnh nhân Wilson[29]. Rối loạn thần kinh có thể âm thầm hoặc đột ngột với các triệu chứng run, rối loạn vận ngôn, co cứng, biểu hiện bệnh Parkinson, hạn chế phối hợp vận động, múa vờn, suy giảm trí tuệ hoặc rối loạn hành vi[28]. Giai đoạn toàn phát, nổi bật là tăng trương lực cơ lan toả kiểu ngoại tháp ở mặt, cổ, gáy và thắt lưng. Cổ điển mô tả bộ mặt “Wilson” với các đặc điểm bất động mặt, miệng, hầu. Có thể xảy ra cơn động kinh, cơn đột quỵ. Triệu chứng tâm thần cũng rất phổ biến từ thay đổi hành vi đến trầm cảm và rối loạn tâm thần[30, 31]. Vòng Kayser-Fleischer phát sinh do sự lắng đọng đồng ở màng Descemet cũng có thể xuất hiện ở bệnh nhân với triệu chứng của thể gan, hầu hết là suy gan tối cấp, thường không gặp ở trường hợp viêm gan mạn[32], nhưng nó luôn luôn xuất hiện ở bệnh nhân có các biểu hiện về thần kinh[28]. 7 Hình 0.1: Vòng Kayser-Fleischer[33] Các dấu hiệu và triệu chứng khác phản ánh tổn thương tế bào do lắng đọng đồng trong các mô khác bao gồm thiếu máu tan máu, bệnh cơ tim, rối loạn nội tiết[3, 34]. Ở trẻ em, thể gan thường phổ biến nhất, với độ tuổi trung bình 10 -13, khởi phát sớm hơn khoảng 10 năm so với thể thần kinh[32]. Khoảng 45% bệnh nhân ở thể gan, 35% có dấu hiệu thần kinh, 20% có rối loạn tâm thần và các triệu chứng khác[25]. 1.1.3.2. Chẩn đoán Chẩn đoán Wilson dựa trên các tiêu chí lâm sàng và cận lâm sàng. Triệu chứng lâm sàng thường gặp: viêm gan cấp hoặc mạn không rõ nguyên nhân, biểu hiện thần kinh, xuất hiện vòng Kayser-Fleischer, tan máu cấp tính, rối loạn tâm thần, thay đổi hành vi, hội chứng Fanconi hoặc bệnh về xương (loãng xương, gãy xương không rõ nguyên nhân) hay các hiểu hiện về cơ, khớp[28]. Các chỉ số hoá sinh bổ sung cho chẩn đoán xác định bệnh Wilson: nồng độ ceruloplasmin <20mg/dl; nồng độ đồng trong nước tiểu 24h > 100mg/ngày[35]; nồng độ đồng trong gan trên 250mg trong 100g trọng lượng khô [35]. Tuy nhiên, một số bệnh nhân Wilson có lượng đồng và nồng độ ceruloplasmin trong huyết thanh cao trên mức tham chiếu[36]. 8 Phân tích đột biến bởi việc giải trình tự toàn bộ gen có thể giúp chẩn đoán ở những trường hợp khó khăn trên lâm sàng và xét nghiệm hoá sinh, sàng lọc ở người nhà cấp 1 của bệnh nhân[36]. 1.1.3.3. Điều trị Wilson là một trong những bệnh về gan đầu tiên đáp ứng tốt với việc điều trị bằng thuốc. Các loại thuốc được sử dụng chủ yếu theo cơ chế tạo phức với đồng để loại bỏ đồng tích luỹ trong mô,giảm sự hấp thu đồng, đi kèm với chế độ ăn nghèo đồng. Các thuốc được sử dụng và công nhận hiệu quả điều trị: D-penicillamine, Trientine, kẽm. 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh Bệnh Wilson hay còn gọi là bệnh thoái hoá gan- nhân đậu hoặc bệnh thoái hoá gan não, là một bệnh gây ra do rối loạn chuyển hoá đồng, đặc trưng bởi sự tích luỹ đồng trong gan, não và một số mô khác [2, 3]. Trong tế bào gan bình thường, hấp thụ đồng thông qua protein Ctr1 (constitutive triple response – 1)[37], sau đó một lượng đồng liên kết với metallothioneins[11]giúp bảo vệ tế bào khỏi độc tính của đồng; những phân tử còn lại liên kết với protein HAH1 và sẽ được vận chuyển vào bộ máy Golgi thông qua tương tác protein – protein với ATP7B [11, 33, 38]. Hình 0.2: Chuyển hoá đồng trong tế bào gan[39] 9 Trong Golgi, đồng kết hợp với apo-ceruloplasmin thành ceruloplasmin, chất này được tiết vào máu và là dạng vận chuyển chủ yếu của đồng trong huyết tương. Khoảng 10% đồng lưu hành trong huyết tương còn lại liên kết với albumin hoặc gắn với amino acid, là các hình thức vận chuyển vào các mô khác nhau[33]. Lượng đồng dư thừa trong tế bào gan được chuyển ra ngoài tế bào vào mật cũng nhờ con đường qua ATP7B[40]. ATP7B là một protein xuyên màng, thực hiện chức năng vận chuyển đồng sử dụng ATP. Chu kì vận chuyển đồng bao gồm nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn đều có thể bị ảnh hưởng bởi đột biến trên gen. Đầu tiên, ATP7B gắn đồng vào vùng N-terminal và gắn ATP vào vùng nucleotid-binding. Sau đó, ATP bị thuỷ phân và ATP7B trở thành dạng phosphoryl hoá. Cuối cùng, phản ứng dephosphoryl giải phóng năng lượng và đồng được vận chuyển qua màng[10]. Hình 0.3: Chu kì vận chuyển đồng nhờ protein ATP7B[10] Bệnh nhân Wilson có mang đột biến trên gen ATP7B, có thể làm mất hoặc giảm chức năng protein, dẫn đến việc đồng trong tế bào không được vận chuyển vào mạng lưới Golgi. Như vậy, tế bào không tổng hợp được ceruloplasmin, tiết vào máu là apo-ceruloplasmin nhanh chóng bị phân giải[3]. Trong khi đó, đồng vẫn tiếp tục được vận chuyển từ huyết tương vào tế bào gan nhờ protein Ctr1, khiến cho hàm lượng đồng trong tế bào tăng lên, tích luỹ và cao hơn hàm lượng các protein liên kết với nó. Đồng tích luỹ trong 10 lysosome, tạo ra các gốc tự do có tính oxi hoá gây hại cho tế bào. Do nồng độ ceruloplasmin trong huyết tương giảm xuống, đồng dư thừa trong gan bài tiết vào máu, không liên kết với apo-ceruloplasmin nên đồng liên kết với albumin hoặc các acid amin mặc dù cơ chế chưa rõ ràng[39]. Kết quả, đồng không liên kết apo-ceruloplasmin tăng trong huyết tương được bài tiết vào nước tiểu, lắng đọng đồng trong các mô khác nhau như não, thận, giác mạc, khớp, xương[41]. Sắt cũng tích luỹ trong gan của bệnh nhân Wilson[42]. Ceruloplasmin có hoạt tính xúc tác phản ứng biến đổi Fe2+ thành Fe3+, giảm nồng độ ceruloplasmin trong bệnh Wilson phá vỡ sự cân bằng nồng độ sắt trong cơ thể[33]. Tổn thương gan trong bệnh Wilson có thể một phần nguyên nhân do tích luỹ sắt [42]. 1.1.5. Cơ sở phân tử 1.1.5.1. Cơ chế di truyền Bệnh Wilson tuân theo quy luật di truyền lặn, có nghĩa là tỉ lệ sinh con mắc bệnh ở bố mẹ dị hợp tử là 25%. Về mặt di truyền, bệnh nhân Wilson có thể có kiểu gen đồng hợp tử hoặc dị hợp tử hai loại đột biến khác nhau. Mỗi đột biến này đều ảnh hưởng đến chức năng của protein và được di truyền từ bố hoặc mẹ[2]. Người mang alen đột biến (dị hợp tử) có tỉ lệ trong quần thể là 1/90, là người mang một alen bệnh và một alen không gây bệnh trong kiểu gen[15, 19]. Hình 0.4: Phả hệ gia đình một bệnh nhân Wilson 11 Chú thích: Thế hệ I: bố mẹ có kiểu gen dị hợp tử, sinh ra một người con bị bệnh mang hai alen đột biến, một người con không bị bệnh mang kiểu gen dị hợp tử, và một người con bình thường không mang đột biến. Thế hệ II: người con bị bệnh lấy vợ có kiểu gen dị hợp tử sinh ra hai người con bị bệnh với hai alen đột biến và một người con không bị bệnh với kiểu gen dị hợp tử. 1.1.5.2. Ảnh hưởng của đột biến lên các vùng chức năng protein Khiếm khuyết trên gen ATP7B là cơ sở phân tử của bệnh Wilson. Sự thay thế, chèn, hoặc mất một nucleotid trên gen dẫn đến sự xuất hiện bộ ba kết thúc hoặc thay thế acid amin hoặc biến đổi một chuỗi các acid amin trong cấu trúc protein. Tuỳ từng vị trí đột biến mà ảnh hưởng đến chức năng của protein khác nhau.Những đột biến gây bệnh có thể có tác động mất chức năng phosphoryl hoá hoặc mất hoạt tính xúc tác, hoặc mất cả hai chức năng này của protein [10]. Ví dụ: đột biến Cys271Stop giảm khả năng gắn đồng[43];c.2495-2496insG rút ngắn chuỗi acid amin, chỉ có 6 vị trí gắn đồng và không có vùng chức năng khác[1];c.1216TCT>GCT không ảnh hưởng chức năng protein[1].Gần 500 đột biến đã được phát hiện và công bố, số đột biến mới vẫn tiếp tục được cập nhật và bổ sung trên websidehttp://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/. Nhiều nghiên cứu thiết lập mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình ở bệnh nhân Wilson. Các đột biến ảnh hưởng nghiêm trọng như đột biến vô nghĩa, đột biến dịch khung do chèn hoặc xoá nucleotid thường phá vỡ hoàn toàn chức năng protein và do đó được dự kiến sẽ mang một kiểu hình lâm sàng nặng hơn [10]. Một vài nghiên cứu chứng minh rằng đột biến nghiêm trọng dẫn đến khởi phát bệnh sớm hơn nhưng mối tương quan với các thể bệnh (gan hoặc thần kinh) chưa được tìm thấy[44, 45, 46]. Nghiên cứu trên bệnh nhân đồng hợp tử ở một alen cụ thể cho thấy ít sự tương quan giữa đột biến nhất định và tuổi khởi phát, đặc điểm lâm sàng, các chỉ số hoá sinh, hoặc mức độ ảnh 12 hưởng nghiêm trọng của bệnh[3, 47]. Ngoài ra, số lượng đột biến rất lớn, các đột biến phần lớn là hiếm gặp, bệnh nhân thường mang hai alen đột biến khác nhau nên việc nghiên cứu tương quan kiểu gen kiểu hình rất khó khăn. Một số đột biến trên ATP7B, cũng có thể có mối liên quan đến bệnh Alzheimer, nghiên cứu trên 2 SNPs K832R và R952K nằm trên ATP7B đưa ra kết luận “sự hiện diện của các locus nhạy cảm cho Alzheimer ở gen ATP7B, vai trò hỗ trợ rối loạn chức năng đồng, góp phần đẩy nhanh quá trình thoái hoá thần kinh hoặc dẫn đến Alzheimer”[45]. 1.2. Gen và protein ATP7B 1.2.1. GenATP7B Hình 0.5: Vị trí gen ATP7B trên nhiễm sắc thể 13. (genecards.org) ATP7B: ATPase, Cu2+ transporting, beta polypeptide thuộc họ P-type ATPasa. Vị trí: 13q14.3 [6]. Chiều dài: 51.891.085 đến 52.012.098 chia làm 21exon. 1.2.2. Protein ATP7B. Chiều dài: 1411 acid amin [9]. Gồm 4 vùng chức năng: vùng xuyên màng có chức năng vận chuyển đồng ra khỏi màng tế bào, vùng MBSs có chức năng là vị trí bám cho 6 nguyên tử đồng; Vùng P: phosphoryl hoá các phức hợp protein tham gia vào sự vận chuyển đồng; vùng N: bám ATP; vùng A: khử phosphoryl hoá [48]. 13 Hình 0.6: Cấu trúc của protein ATP7B [49] Protein ATP7B có mặt ở tất cả các mô, chủ yếu ở gan, thận, nhau thai, ít gặp ở tim, não, phổi, cơ, lách và ruột [33]. 1.2.3. Mối tương quan giữa gen và protein Trình tự nucleotid trên gen quy định trình tự acid amin trên protein, gen ATP7B có 21 exon nhưng protein lại chỉ có 6 vùng chức năng, như vậy, mỗi vùng chức năng được mã hoá bởi một hoặc một vài exon. Hình 0.7:Các vùng chức năng của protein tương ứng trên gen[1] 1-21: vị trí các exon trên gen ATP7B. Cu 1-6: vị trí gắn đồng trên protein; Tm 1-7: vùng protein xuyên màng; Ch Ph: Vùng phosphoryl hoá; ATP loop:vùng gắn ATP; Td: vùng khử phosphoryl hoá. 14 1.2.4. Một số nghiên cứu về đột biến gen ATP7B. Sau khi cơ chế di truyền của bệnh Wilson được làm rõ, cho đến nay, hàng trăm công trình nghiên cứu phát hiện đột biến, nghiên cứu ảnh hưởng đột biến, mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Wilson đã được tiến hành. Kết quả, hơn 500 đột biến được công bố, bao gồm các đột biến vô nghĩa, sai nghĩa, thêm hoặc bớt nucleotid gây dịch khung mã di truyền [43],[50],[20],[46]. Tần số mỗi đột biến khác nhau đáng kể ở các quốc gia, vùng lãnh thổ khác nhau. Đột biến p.H1069Q được đánh giá là phổ biến ở Châu Âu [51], tuy nhiên khi phân tích đột biến của 60 đối tượng trong 46 gia đình ở Brazil, không tìm thấy đột biến p.H1069Q và đột biến có tần số cao nhất là c.3402delC (30,8%) [52]. Ở Châu Á, các nhóm bệnh nhân nguyên cứu phát hiện đột biến R778L là dạng đột biến hay gặp nhất [21, 50], Nghiên cứu thực hiện trên 65 bệnh nhân Wilson ở Hồng Kông cho thấy đột biến p.R778L có tỉ lệ lớn nhất (17,3%) so với các đột biến khác trong cùng đề tài [53]. Trong một nghiên cứu khác trên những bệnh nhân Hàn Quốc, tần số đột biến này là 65% [54]. Ở Việt Nam, nghiên cứu phát hiện đột biến gen gây bệnh Wilson bước đầu được triển khai thu được kết quả khá tốt. Năm 2011, xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen gây bệnh Wilson[55]. Năm 2014, Nghiên cứu phát hiện đột biến trên gen ATP7B của TS. Trần Vân Khánh cùng cộng sự đã phát hiện 28 dạng đột biến trên gen ATP7B, bước đầu xây dựng được bản đồ đột biến gen gây bệnh Wilson ở người Việt Nam [56]. 1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử 1.3.1. Polymerase Chain Reaction ( PCR) PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp). PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo 15 ra nhiều bản sao) một đoạn DNA, thực hiện trong ống nghiệm, sử dụng các yếu tố cơ bản của quá trình sao chép diễn ra trong tự nhiên. Phương pháp PCR được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 và kể từ đó,PCR được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu sinh học và y học nhằm mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng dấu vân tay DNA, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen, xác định huyết thống… 1.3.1.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase. Với nguyên liệu là 4 loại nucleotid, enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi sự có mặt của mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn. 1.3.1.2. Các thành phần tham gia của phản ứng PCR DNA khuôn: Đoạn khuôn DNA (DNA template, DNA target) tinh sạch là một yếu tố quan trọng, giúp phản ứng PCR tạo được các sản phẩm chính xác. Kích thước đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả khuếch đại gen tốt nhất[55]. Mồi: Mồi là những đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30 nucleotid. Để thực hiện nhân một đoạn DNA bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồi thích hợp, bắt cặp đặc hiệu với DNA khuôn. Mỗi cặp mồi có một mồi xuôi và một mồi ngược[55]. Các nucleotide tự do: Gồm 4 loại deoxynucleotid triphosphate (dNTPs): dATP, dTTP, dGTP và dCTP, được dùng làm cơ chất tổng hợp DNA. Khi hàm lượng dNTP tự do quá ít, tạo sản phẩm PCR ít không đủ để phát hiện. Ngược lại nồng độ dNTP cao thì phản ứng PCR khó thực hiện[55]. 16 Enzym DNA polymerase: Là yếu tố đóng vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Enzym thường được sử dụng hiện nay là Taq DNApolymerase, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở nhiệt độ cao[55]. Hàm lượng enzym ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: cần đảm bảo các thành phần cần thiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như MgCl2, KCl, TrisHCl…Trong đó, Mg 2+ là thành phần ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả phản ứng PCR do ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn. 1.3.1.3. Các bước của phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 95ºC trong vòng 30-60 giây. Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 - 70 tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây. Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên 72ºC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq DNA polymerase, Tth polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn mồi, và 2 đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen[57]. 17 Hình 0.8: Thành phần và các giai đoạn phản ứng PCR (Nguồn:http://classroom.sdmesa.edu/) 1.3.1.4. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR Ưu điểm - Thời gian thực hiện nhanh. - Đơn giản và ít tốn kém. - Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. - PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn hay đột biến điểm. Hạn chế - Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. PCR không hoạt động được với những phân tử có kích thước lớn hơn 3kb. - Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn đặt ra đối với PCR. 1.3.2. Giải trình tự gen Năm 1977, Sanger và cộng sự đã công bố về kĩ thuật sinh học phân tử có khả năng xác định trình tự nucleotid trên DNA[58].Đây là một kĩ thuật sử dụng 18 enzym DNA polymerase và các dideoxyribonucleotid có tác dụng dừng chuỗi phản ứng. Kỹ thuật này giúp xác định trình tự nucleotid nhanh hơn, chính xác và vẫn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: giải trình tự để định danh, định type vi khuẩn, virus, nhận dạng cá thể, nhận dạng loài, xác định đột biến gen, sản xuất vaccine, điều trị đích ung thư....Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, giải trình tự gen hiện nay đều thực hiện trên máy tự động. Dựa trên phương pháp enzym của Sanger, máy giải trình tự tự động giúp việc thực hiện kĩ thuật trở nên dễ dàng và tiết kiệm thời gian hơn. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự bằng máy tự động. 1.3.2.1. Nguyên lý: Dưới tác dụng của enzym DNA polymerase, thực hiện phản ứng tổng hợp DNA trong môi trường có chứa các dideoxyribonucleotid (ddNTP) có tác dụng dừng chuỗi phản ứng, thực hiện lặp lại nhiều chu kì tổng hợp sẽ tạo ra nhiều sợi DNA có chiều dài từ vị trí mồi cộng 1 nucleotid đến vị trí cuối cùng của đoạn DNA, xác định trình tự nucleotid bằng việc điện di cả 4 giếng chứa 4 loại ddNTP trên gel polyacrylamid. Hình 0.9: Minh hoạ phương pháp giải trình tự gen (Nguồn:http://rsc.org) 19 1.3.2.2. Các thành phần tham gia giải trình tự DNA khuôn: đoạn DNA đích cần xác định trình tự. Tất cả các phân tử DNA có cùng chiều dài, được khuếch đại nhiều lần bằng PCR hoặc nhân dòng gen. Mồi: Mồi là những đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30 nucleotid, đặc hiệu với trình tự của DNA. Các nucleotide tự do: Gồm 4 loại deoxynucleotid triphosphate (dNTPs): dATP, dTTP, dGTP và dCTP. Các dideoxyribonucleotid (ddNTP) được đánh dấu phóng xạ huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP: ddATP màu xanh lá cây, ddTTP màu đỏ, ddGTP màu đen, ddCTP màu xanh da trời. Nồng độ của ddNTPs phải thấp hơn dNTPs nhiều lần. Nếu chỉ bổ xung dNTPs thì sản phẩm PCR sẽ là đoạn DNA hoàn chỉnh. Mặt khác, khi bỏ toàn bộ là ddNTPs, Taq polymerase sẽ gắn 1 ddNTPs vào phía trướcđoạn mồi và phản ứng kéo dài DNA sẽ dừng lại. Do vậy, phản ứng tổng hợp cả dNTPs và ddNTPs với tỷ lệ tối ưu là 100:1, và với tỉ lệ này DNApolymerase sẽ gắn dNTPs vào mạch DNA bổ xung vào có cơ hội gắn 1 ddNTP để dừng phản ứng kéo dài. Enzym DNA polymerase: chức năng kéo dài mạch. Dung dịch đệm cho phản ứng: Dung dịch đệm gồm các thành phần cần thiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như MgCl2, KCl, Tris-HCl… 1.3.2.3. Cấu tạo của máy giải trình tự tự động Gồm hai phần chính: phần điện di với gel polyacrylamid và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di có thể là một bản gel hay một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những “con mắt cảm quang” và chùm tia laser đi qua trước nó.Khi gặp ánh sáng laser, các vạch điện di phát sáng với cường độ khác nhau đặc trưng cho từng loại ddNTP. Ánh sáng này 20 được “mắt cảm quang” thu nhận tín hiệu, phân tích, so sánh với cường độ của từng loại Nu và đưa ra trình tự của đoạn DNA. Kĩ thuật giải trình tự đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định đột biến điểm. Phần lớn các đột biến gây bệnh Wilson là đột biến điểm nên sử dụng phương pháp giải trình tự gen ATP7B có hiệu quả cao.