Tài liệu Tối ưu quy trình phân tích đa hình vùng promoter của gen ugt1a1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ne an dP ha r NGUYỄN HUY HOÀNG ma c y, KHOA Y DƢỢC ed ici TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ho ol of M KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH BÁC SĨ ĐA KHOA Co p yri gh t@ Sc KHÓA 2012-2018 Hà Nội - 2018 VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ne an dP ha r NGUYỄN HUY HOÀNG ma c y, KHOA Y DƢỢC ed ici TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ho ol of M KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH BÁC SĨ ĐA KHOA KHÓA 2012-2018 ThS. Phạm Thị Hồng Nhung TS. BS. Trần Quốc Hùng Co p yri gh t@ Sc Ngƣời hƣớng dẫn: Hà Nội - 2018 VN U LỜI CÁM ƠN y, Tôi xin đặc biệt gửi lời cám ơn đến ThS. Phạm Thị Hồng Nhung đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và ma c hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin gửi lời cảm tạ sâu sắc nhất tới TS. BS. Trần Quốc Hùng, Khoa ung bướu Bệnh viện 198 Bộ Công an đã tạo điều kiện giúp ha r tôi thu thập số liệu nghiên cứu và cho tôi những góp ý chuyên môn vô cùng giá trị. ne an dP Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số CS.15.09. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô và cán bộ nghiên cứu Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn ủng hộ và nhiệt tình giúp đỡ cho tôi có điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu khoa học tại đây. ici Tôi xin cảm ơn các bạn sinh viên Bùi Xuân Nhật, Nguyễn Thùy Linh và Kiều Hồng Nhung đã hỗ trợ tôi thực hiện các nghiên cứu và cho tôi những góp ý chân thành khi viết khóa luận. Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed Để có được sự thành công của khóa luận này, tôi xin cảm ơn gia đình đã quan tâm động viên, khuyến khích giúp tôi vững vàng vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid) bp CN1 Cặp bazơ nitơ (Base pair) Hội chứng Crigler – Najar type 1 CN2 dNTP DHPLC Hội chứng Crigler – Najar type 1 Deoxyribo Nucleic triphosphat Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high perfomance liquid chromatography) EDTA Axit ethylene diamine tetraacetic (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) HRM Kĩ thuật phân tích phân giải cao nhiệt độ nóng chảy (High resolution melt) kb NCBI Kilobazơ (=1000 bp) Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc Gia – Mỹ (National Center for Biotechnology Information) OD PCR UDP UGT UGT1A1 Mật độ quang học (Optical density) Phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction) Uridine 5’ diphosphat Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1 UGT1A1 RFLP Gen mã hóa cho Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism) Đa hình di truyền đơn nucleotit (Single nucleotide polymorphism) Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand conformation polymorphism) yri ma c ha r ne an dP ici ed ho ol of M Sc gh t@ TAE y, ADN SNP SSCP Co p VN U DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Đệm Tris base/ axit acetic/ EDTA VN U DANH MỤC CÁC BẢNG Trang ma c y, Bảng 1. Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến ...................................................... 4 Bảng 2. Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu mô đúc paraffin bằng phương pháp đo mật độ quang OD ......................................................................................... 22 ha r Bảng 3. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR............................................... 25 Bảng 4. Đa hình vùng promoter của UGT1A1 ở 38 bệnh nhân nghiên cứu ............. 27 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP Bảng 5. Chỉ định xét nghiệm UGT1A1*28 khi sử dụng một số loại thuốc .............. 30 VN U DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang ma c y, Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các protein UGT .................................................. 2 Hình 1.2 Phản ứng chuyển nhóm glycosyl nhờ UGT ................................................ 3 Hình 1.3 Sơ đồ locus UGT1A1 ở người ...................................................................... 3 ha r Hình 1.4 Tỉ lệ mắc và tử vong của 10 ung thư phổ biến nhất năm 2012 .................... 9 Hình 1.5 Đa hình di truyền UGT1A1 và sự chuyển hóa irinotecan .......................... 10 Hình 1.6 Irinotecan và phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến kiểu ne an dP gen UGT1A1 .............................................................................................. 11 Hình 1.7 Biên độ nhiệt của các đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 ............... 15 Hình 1.8 Kết quả điện di của kiểu gen (TA)6/(TA)7 và (TA)6/(TA)8 sử dụng gel agarose 3% ................................................................................................. 15 Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN bằng cột silica đơn giản ................................... 17 Hình 2.2 Quy trình PCR ........................................................................................... 19 Hình 3.1 Điện di trên gel agarose 0.7% sản phẩm tinh sạch ADN từ mẫu máu ..... 21 ed ici Hình 3.2 Điện di trên gel agarose 1.5% của thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi PCR nhân vùng promoter của UGT1A1 ............................................................ 23 Hình 3.3 Điện di trên gel agarose 1.5% của thí nghiệm tối ưu nồng độ ADN ho ol of M PCR nhân vùng promoter của UGT1A1 .................................................... 24 Co p yri gh t@ Sc Hình 3.4 Điện di trên gel agarose 1.5% sử dụng quy trình PCR tối ưu nhân vùng promoter của UGT1A1 chạy với 10 mẫu bệnh nhân ................................. 24 Hình 3.5 Kết quả giải trình tự kiểu gen đồng hợp (TA)6/(TA)6 ............................... 25 Hình 3.6 Kết quả giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6 ................................................ 26 Hình 3.7 Kết quả giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6................................................ 26 Hình 3.8 Tần số các alen UGT1A1*28, UGT1A1*36 và UGT1A1*6 ở một số quần thể ............................................................................................................... 28 VN U MỤC LỤC Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP ha r ma c y, MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................2 1.1. Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1 ......................2 1.2. Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A ..............................................5 1.2.1 Hội chứng Gilbert ...........................................................................................5 1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar ..............................................................................6 1.3. Đa hình di truyền UGT1A1*28 ......................................................................7 1.4. Ung thƣ đại trực tràng và mối liên quan giữa irinotecan với đa hình di truyền UGT1A1*28....................................................................................................8 1.5. Các phƣơng pháp phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28 ....................11 1.5.1 Giải trình tự ADN .........................................................................................11 1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand conformation polymorphism - SSCP): .........................................................................................12 1.5.3 Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis): ...............................................13 1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) .........................................................................................13 1.5.5 Real – time PCR ...........................................................................................14 1.5.6 Phân giải cao nhiệt độ chảy ..........................................................................14 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................16 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................16 2.2. Hóa chất .........................................................................................................16 2.3. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu ..................................................................16 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................17 2.4.1. Tách chiết ADN tổng số...............................................................................17 2.4.2. Đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số ................................18 2.4.3. Phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter của UGT1A1 ............................18 2.4.4. Xác định kiểu gen UGT1A1*28 bằng phương pháp giải trình tự ................20 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................21 3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số .......................................................................21 3.3 Kết quả giải trình tự kiểu gen UGT1A1*28 ....................................................25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC VN U MỞ ĐẦU Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP ha r ma c y, Ung thư hiện đang ảnh hưởng rất nhiều tới sức khỏe và chất lượng cuộc sống. Theo tổ chức Y tế thế giới, ung thư đứng hàng thứ 2 trong các nguyên nhân tử vong, với khoảng 14 triệu người mắc mới vào năm 2012 và tiếp tục có xu hướng tăng lên. Ung thư đại trực tràng là một trong những ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệ mắc mới đứng hàng thứ tư và tỉ lệ tử vong cao thứ năm ở cả hai giới [33]. Mặc dù đã có các tiến bộ trong chẩn đoán sớm và điều trị, tuy nhiên tỉ lệ bệnh nhân ung thư đại trực tràng tiến triển đến giai đoạn muộn (giai đoạn IV) vẫn còn cao. Một trong các thuốc điều trị chính ở giai đoạn muộn là Irinotecan, nhưng việc điều trị còn gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là các tác dụng không mong muốn của thuốc. Thời điểm hiện tại cá thể hóa điều trị đang là một xu hướng tất yếu và ngày càng ảnh hưởng sâu rộng đến quá trình điều trị ung thư đại trực tràng của các bác sĩ. Một trong các công cụ rất hữu ích với các bác sĩ lâm sàng trong việc đối đầu với ung thư đại trực tràng chính là sinh học phân tử. Các nghiên cứu đã chỉ ra đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1 có ảnh hưởng lớn đến quá trình chuyển hóa của irinotecan, liên quan chặt chẽ đến hiệu quả điều trị và mức độ trầm trọng do các tác dụng không mong muốn của thuốc. Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration, viết tắt là FDA) đã đưa ra khuyến cáo nên xét nghiệm gen UGT1A1*28 khi dùng irinotecan và có hướng dẫn về điều trị tương ứng với từng kiểu gen[23]. Tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về gen UGT1A1 cũng như đa hình di truyền UGT1A1*28 ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”. Kết quả của đề tài sẽ cung cấp một công cụ hỗ trợ đắc lực cho các bác sĩ không chỉ trong việc điều trị ung thư đại trực tràng mà còn trong việc chẩn đoán một số bệnh lý di truyền như hội chứng Gilbert hay hội chứng Crigler – Najar. Mục tiêu nghiên cứu: Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1. Nội dung nghiên cứu: 1. Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1 trên mẫu mô bệnh phẩm đúc trong paraffin và mẫu máu. 2. Áp dụng quy trình phân tích gen trên các mẫu bệnh phẩm thu từ Bệnh viện 198. Bước đầu xác minh tần số alen và tần số kiểu gen của đa hình di truyền vùng promoter thuộc gen UGT1A1 trong nhóm mẫu nghiên cứu. 1 VN U CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1 ma c y, Uridine 5’ diphosphat glucurosyltransferases A1 (viết tắt là UGT1A1) là một thành viên trong họ enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferase (viết tắt ho ol of M ed ici ne an dP ha r là UGT), đóng vai trò xúc tác cho các hoạt động chuyển hóa cũng như giải độc của gan. UGT là một họ lớn bao gồm 22 loại protein, được chia làm 5 họ và 6 phân đoạn căn cứ vào cơ sở giải trình tự gen cấu trúc (Hình 1.1) [25]. Hình 1.1. Cây phát sinh chủng loại các protein UGT [25] Các protein UGT chủ yếu xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm glucosyl của Sc axit uridine 5’ diphosphat glucuronic đến một cơ chất phù hợp hình thành các chất hòa tan trong nước. Các cơ chất được gắn nhóm glucosyl bao gồm các chất không gh t@ phân cực kích thước phân tử nhỏ như các steroit, bilirubin, các hormon và các thuốc. Phản ứng chuyển hóa xúc tác bởi UGT được mô tả trong Hình 1.2 [25]. Trong các UGT, các protein thuộc phân họ UGT1A được quan tâm hơn cả, đóng vai trò then chốt trong việc chấm dứt các hoạt động sinh học và tăng cường việc đào yri thải các chất không phân cực của thận. Chính vì vậy, chúng giúp duy trì nồng độ Co p các chất và đảm bảo cân bằng nội môi [25]. UGT1A tập trung chủ yếu ở gan và đường ống tiêu hóa (dạ dày, ruột non, đại tràng). Bên cạnh đó còn ghi nhận sự biểu hiện của UGT1A ở phổi, buồng trứng, tinh hoàn, tuyến vú và tuyến tiền liệt [17]. 2 VN U ma c y, Uridine 5’ diphosphat glucuronic Nucleophin ne an dP ha r Enzym UGT Gốc glucuronyl Uridine 5’ diphosphat ici Hình 1.2. Phản ứng chuyển nhóm glycosyl nhờ UGT UGT1A1 được mã hóa bởi gen UGT1A1 nằm trên nhiễm sắc thể số 2 (2q37), ed gồm có 13 exon chia làm 2 nhóm. Nhóm 1 bao gồm 9 exon được kí hiệu là A1, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10). Nhóm 2 gồm bốn exon, được kí hiệu từ 2 đến 5 ho ol of M (Hình 1.3). 9 exon nhóm 1 mã hóa cho vị trí liên kết với cơ chất với enzym và đều có một promoter riêng. Sau phiên mã tổng hợp mARN, mỗi exon nhóm 1 nối với 4 exon nhóm 2, tạo ra các chuỗi mARN khác nhau, từ đó tạo thành các polypeptit yri gh t@ Sc khác nhau [2]. Co p Hình 1.3. Sơ đồ locus UGT1A1 ở người. Mỗi gen UGT1A bao gồm một exon nhóm 1 (A) và 4 exon nhóm 2 phía sau (exone 2-5). Các exon nhóm 1 luân phiên nối với 4 exon nhóm 2 phía sau tạo thành 9 loại protein khác nhau [25] 3 VN U Trong số các exon này, gen UGT1A1 mã hóa cho enzym UGT1A1 được quan tâm nhiều hơn cả vì những ảnh hưởng của nó với thực tiễn lâm sàng. Hơn 100 đa hình di truyền của UGT1A1 đã được mô tả, một vài trong số chúng làm tăng, y, giảm hoạt động hoặc bất hoạt enzym UGT1A1 (Bảng 1) [25]. UGT1A1*1 Protein bị thay đổi thay đổi Kiểu dại Dịch khung/ mất nu 878 – mất acid 890 amin UGT1A1*3 1124 C -> T UGT1A1*4 Exon Bệnh liên CN1 S375F Sai nghĩa 4 CN1 1069 C -> T Q357X Vô nghĩa 3 CN1 UGT1A1*5 991 C -> T Q331X Mất đoạn 2 CN1 UGT1A1*6 221 G -> A G71R Sai nghĩa 1 Gilbert UGT1A1*11 923 G -> A G308E Sai nghĩa 2 CN1 UGT1A1*12 524 T -> A L175Q Sai nghĩa 1 CN2 Mất đoạn 1 CN1 UGT1A1*14 UGT1A1*15 UGT1A1*16 UGT1A1*21 508- 510 mất F170 mất ho ol of M UGT1A1*13 ed 2 ici quan Mất đoạn UGT1A1*2 nu acid amin 826 G -> C G276R Sai nghĩa 1 CN1 529 T -> C C177R Sai nghĩa 1 CN2 1070 A -> G O357R Sai nghĩa 3 CN1 1223 thêm G Dịch khung Dịch khung 4 CN2 875 C -> T A292V Sai nghĩa 2 CN1 UGT1A1*26 973 mất G Dịch khung Dịch khung 2 CN2 UGT1A1*27 686 C -> A P229Q Sai nghĩa 1 Gilbert UGT1A1*28 TAA(TA)7 UGT1A1*29 1099 C -> G gh t@ Sc UGT1A1*22 yri Co p ne an dP 877 T -> A / Loại đột biến ha r Alen Nucleotit bị ma c Bảng 1. Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến [25]. Thêm trình tự ở vùng lặp lại R367G Sai nghĩa Ghi chú : CN1: Hội chứng Crigler – Najar type 1 CN2: Hội chứng Crigler – Najar type 2 Gilbert: Hội chứng Gilbert 4 Promoter Gilbert 4 Gilbert VN U Như Bảng 1 thống kê, đa số các alen mới được phát sinh chủ yếu là các dạng biến đổi do thay thế nucleotit (đa hình di truyền đơn nucleotit), thêm và mất một y, đoạn trình tự ADN. Trong số các đa hình trên, phần lớn gây ảnh hưởng đến hoạt động của enzym UGT1A, dẫn đến các rối loạn bệnh lý như hội chứng Crigler – 1.2. Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A ha r 1.2.1 Hội chứng Gilbert ma c Najar type 1,2 hay hội chứng Gilbert. Hội chứng Gilbert là một tình trạng di truyền thường gặp, đặc trưng chủ yếu bởi tăng bilirubin không liên hợp trong máu, không có bệnh lý về tế bào gan hoặc ne an dP huyết tán. Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1901 bởi Augustin ed ici Gilbert và Pierre Lereboullet [10]. Nguyên nhân của bệnh được xác định là do sự suy giảm hoạt động của enzym UGT1A, có liên quan mật thiết đến đa hình di truyền UGT1A1*28. Những triệu chứng điển hình của hội chứng Gilbert có thể kể đến như vàng da nhẹ liên tục ở thanh thiếu niên, billirubin gián tiếp tăng sau mất nước, tiêu chảy, kinh nguyệt. Các triệu chứng không điển hình khác đau bụng, đau dạ dày, mệt mỏi, sụt cân [10]. Về vàng da, trong hội chứng Gilbert cơ thể sản xuất một lượng bilirubin tự ho ol of M do cao hơn bình thường trong máu và không gây ra hậu quả nghiêm trọng. Vàng da gh t@ Sc có thể xuất hiện sau khi bệnh nhân bị stress, nhiễm trùng, gắng sức,…, nhưng thường là không có triệu chứng [26]. Cũng đã có các báo cáo cho thấy hội chứng Gilbert góp phần thúc đẩy sự khởi đầu của bàng da sơ sinh, đặc biệt là trong trường hợp tăng tan máu như trong bệnh thiếu enzym G6PD. Tình trạng này có thể trở nên đặc biệt nghiêm trọng nếu không nhanh chóng điều trị nồng độ bilirunbin tăng cao trong máu, gây ra ảnh hưởng về thần kinh không thể phục hồi trong bệnh vàng da nhân não [13]. Về khả năng chuyển hóa thuốc, những bất thường liên quan đến enzym UGT1A1 trong hội chứng Gilbert cũng ảnh hưởng đến vài khả năng của gan trong giải độc thuốc của gan. Hội chứng Gilbert có liên quan đến tình trạng tiêu chảy Co p yri nặng và sự giảm bạch cầu trung tính ở những bệnh nhân được điều trị với Irinotecan (một thuốc điều trị ung thư), là cơ chất của UGT1A1. Paracetamol không được chuyển hóa bởi UGT1A1 nhưng enzym chuyển hóa nó cũng có bất thường trong hội chứng Gilbert. Nên các BN có hội chứng Gilbert có nguy cơ ngộ độc paracetamol cao hơn. 5 VN U Hội chứng Gilbert có ảnh hưởng đến hệ Tim mạch. Bilirubin có đặc tính chống oxi hóa mạnh trong ống nghiệm, làm giảm quá trình oxy hóa huyết tương [8]. Một vài phân tích cho thấy những người bị hội chứng Gilbert và đái tháo đường có nguy cơ bị các bệnh mạch vành thấp hơn người bình thường [16]. ma c y, Hội chứng Gilbert là một tình trạng lành tính, do vậy không cần một chế độ quản lý, điều trị đặc biệt và không cần bất kỳ một chế độ ăn kiêng nào. 1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar ha r Hội chứng Crigler-Najjar (CNS) là một rối loạn di truyền hiếm gặp gây rối ne an dP loạn chuyển hóa bilirubin. Hội chứng Crigler-Najjar được phân thành 2 loại. Type 1 được mô tả bởi Crigler và Najjar vào năm 1952 có liên quan đến tăng bilirubin gián tiếp ở trẻ sơ sinh sơ sinh và vàng da nhân. Type 2 (còn gọi là hội chứng Arias) được Arias phát hiện vào năm 1962, với mức bilirubin trong máu thấp hơn và đáp ứng với điều trị phenobarbital [32]. Hội chứng CNS liên quan đến sự thiếu hụt enzym UGT do đột biến trong trình tự mã hóa enzym UGT. Trong hội chứng Crigler-Najjar type 1, cơ thể gần như ho ol of M ed ici thiếu hụt hoàn toàn enzym UGT, dẫn đến nống độ bilirubin trong máu sau sinh cao (có thể lên đến 50 mg/dl). Trong khi đó, Crigler-Najjar type 2 có nồng bilirubin thấp hơn (khoảng 20 mg/dl). Đối với các trường hợp này, điều phenobarbital có thể thúc đẩy sự hoạt động của enzym UGT, làm giảm nồng bilirubin trong máu khoảng 25% [32]. rất độ trị độ gh t@ Sc Trong hội chứng Crigler-Najjar type 1, bệnh nhân sẽ có biểu hiện vàng da kéo dài sau sinh. Đối với type 2, vàng da có thể không biểu hiện cho đến khi bệnh nhân đến độ tuổi thiếu niên. Hậu quả nghiêm trọng nhất của tăng bilirubin máu là vàng da nhân và tình trạng này xảy ra ở hầu hết bệnh nhân type 1 không được điều trị, đặc biệt trong những ngày đầu sau sinh. Biến chứng vàng da nhân não do tăng bilirubin hiếm gặp ở type 2, nhưng có thể bị thúc đẩy bởi các yếu tố nhiễm trùng, thuốc mê, hay sử dụng thuốc. Biểu hiện lâm sàng của vàng da nhân gồm giảm trương lực cơ, điếc, liệt vận nhãn, hôn mê và tử vong. Với các bệnh nhân mắc hội chứng Crigler-Najjar type 2 có thể không cần Co p yri điều trị hay được điều trị bằng phenobarbital. Ngược lại, khi xuất hiện biến chứng vàng da nhân trên bệnh nhân type 1, cần được nhanh chóng điều trị nhằm hạn chế các di chứng thần kinh. Các thuốc phenobarbital (luminal, barbita) được sử dụng để hạn chế các di chứng thần kinh trong bệnh nhân type 1và điều trị các triệu chứng thần kinh đối với type 2 [19]. 6 VN U Điều trị khẩn biến chứng não do tăng bilirubin bao gồm truyền huyết tương, nhằm loại bỏ albumin đã bão hòa bilirubun trong máu, đồng thởi cung cấp protein tự do để gắn kết với bilirubin trong mô, giảm nồng độ bilirubun [15]. Truyền huyết tương cần điều trị kèm chiếu đèn trong thời gian dài, giúp ma c y, chuyển đổi bilirubin gián tiếp sang bilirubin trực tiếp để có thể thải ra theo nước tiểu. Sử dụng canxi photphat cũng có thể hỗ trợ cho liệu pháp chiếu đèn [15]. 1.3. Đa hình di truyền UGT1A1*28 ha r Trong số các đa hình di truyền của UGT1A1, đa hình di truyền UGT1A1*28 phổ biến và được quan tâm nhiều nhất. UGT1A1*28 gây suy giảm hoạt tính của ne an dP enzym UGT1A1, dẫn đến các rối loạn về chuyển hóa cũng như chức năng giải độc ed ici của gan với các thuốc. UGT1A1*28 được ghi nhận có liên quan đến nhiều bệnh lý chuyển hóa và sự gia tăng những tác dụng không mong muốn của các thuốc, đặc biệt là irinotecan trong điều trị ung thư đại trực tràng. UGT1A1*28 là đa hình di truyền với sự lặp lại 7 lần của trình tự thymineadenine (TA) ở vùng promoter của UGT1A1[17]. Ở dạng kiểu dại trình tự (TA) chỉ lặp lại 6 lần và được kí hiệu là alen UGT1A1*1. Độ dài của trình tự TA ở vùng promoter của exon UGT1A1 liên quan chặt chẽ đến hoạt tính của enzym UGT1A1. Chính vì vậy đa hình UGT1A1*28 đã được ghi nhận gây giảm hoạt tính của enzym ho ol of M UGT1A1. Người mang 1 alen UGT1A1*28 có hoạt tính enzym UGT1A1 giảm 25% và giảm đến 70% ở người có kiểu gen đồng hợp UGT1A1*28 (mang 2 alen gh t@ Sc UGT1A1*28) [5],[6]. Tần số xuất hiện của alen UGT1A1*28 dao động nhiều ở các quần thể khác nhau: 26% đến 31% ở quần thể người da trắng, 42% đến 56% ở quần thể người Châu Phi và 9% đến 16% ở các quần thể người Châu Á. Ảnh hưởng lớn nhất của alen UGT1A1*28 liên quan đến quá trình chuyển hóa của một số thuốc và tình trạng tăng nồng độ bilirubin không liên hợp (bilirubin gián tiếp). Bilirubin là sản phẩm thoái hóa của nhân hem trong hemoglobin của hồng cầu, chủ yếu được tạo ra ở hệ thống tổ chức liên võng, ngoài hệ thống tuần hoàn. Đây là một chất không tan trong nước có ái lực cao với lipid và albumin của huyết thanh. Do có ái lực cao với lipid của màng tế bào nên sự kết hợp với lipid Co p yri màng của bilirubin gây hư hại chức năng màng tế bào đặc biệt của hệ thống thần kinh. Bilirubin được vận chuyển vào máu và kết hợp với albumin của huyết thanh, sau đó được vận chuyển đến gan và được giải phóng nhanh chóng khỏi albumin. Ở tế bào gan, bilirubin được glucuronic hóa nhờ các UGT tạo thành bilirubin liên hợp, là chất tan trong nước, dễ dàng đào thải qua phân và nước tiểu [2]. 7 VN U Hoạt tính của enym UGT, đặc biệt là UGT1A1 suy giảm sẽ làm tăng nồng độ bilirubin không liên hợp trong máu, gây ra tình trạng vàng da. Đột biến UGT1A1*28 đã được quan sát thấy ở các bệnh nhân mắc hội chứng Crigler – Najar type I và được ghi nhận là dấu hiệu của hội chứng Gilbert [12]. ma c y, Nhiều thuốc khác đã được xác định là chất ức chế hoạt động của enzym UGT1A1 như Indinavir (kháng retrovirus, sử dụng trong điều trị HIV), Atazanavir (điều trị HIV), Sorafenib (điều trị ung thư gan và thận)…[17]. Nhiều nghiên cứu cho thấy xác định sự có mặt của alen UGT1A1*28 ở những bệnh nhân điều trị với ha r Atazanavir, Indinavir có thể giúp họ tránh bị tăng bilirubin không liên hợp [4], [24]. Một số thuốc khác đã được xác định là cơ chất của UGT1A1 như raloxifene (điều ne an dP trị loãng xương), raltegravir (ức chế virus, sử dụng trong điều trị HIV)… đặc biệt là irinotecan (thuốc điều trị ung thư đại trực tràng) được quan tâm nhất. Ảnh hưởng của alen UGT1A1*28 đến bệnh nhân điều trị bằng irnotecan sẽ được trình bày cụ thể hơn ở bên dưới. Đến nay, mối tương quan giữa đa hình UGT1A1*28 và đáp ứng của cơ thể với các thuốc khác nhau vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu. ici 1.4. Ung thƣ đại trực tràng và mối liên quan giữa irinotecan với đa hình ed di truyền UGT1A1*28 Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế ho ol of M giới cũng như ở Việt Nam. Trong điều trị bệnh, irinotecan được sử dụng thường xuyên cho những bệnh nhân ở giai đoạn IV. Tuy nhiên thuốc có nhiều tác dụng gh t@ Sc không mong muốn như tiêu chảy nặng, suy tủy, xuất huyết… UGT1A1*28 được ghi nhận có liên quan chặt chẽ đến các tác dụng không mong muốn này. Do vậy trong thực hành lâm sàng, các bác sĩ cần cân nhắc xét nghiệm UGT1A1*28 trước khi quyết định điều trị bằng irinotecan và điều chỉnh liều lượng thuốc phù hợp cho bệnh nhân để tránh các tác dụng không mong muốn nặng. Theo tổ chức Y tế thế giới, ung thư là nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ hai, với khoảng 14 triệu trường hợp mắc mới vào năm 2012 và sẽ tăng khoảng 70% trong vòng 2 thập kỷ tới. Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình [16]. Việt Nam cũng không phải ngoại lệ. Theo Co p yri thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII năm 2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000 người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ngày và con số này dự báo sẽ ngày càng tăng cao. Tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong của các ung thư phổ biến được thể hiện trong Hình 1.4. 8 VN U Trong số các ung thư phổ biến, ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao nhất ở cả 2 giới. Trên thế giới, ung thư đại trực tràng có tỉ lệ mắc cao thứ 4 (17,2%) và tỉ lệ tử vong cao thứ 5 (8,3%). Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng nằm trong số 5 bệnh ung thư thường gặp với tỉ ma c y, lệ mắc là 10,1% và tỉ lệ tử vong là 7,0%. So với các ung thư đường tiêu hóa khác, ung thư đại trực tràng có tiên lượng tốt hơn. Tỉ lệ sống 5 năm phụ thuộc vào giai đoạn bệnh: giai đoạn I >90%, giai đoạn II>60%, giai đoạn III > 30% và giai đoạn IV<5% [17]. Tuy nhiên các chương trình sàng lọc ung thư đại trực tràng mới được ne an dP ho ol of M ed ici bệnh ở giai đoạn muộn vẫn còn cao. ha r triển khai trong những năm gần đây, hơn nữa sự tiếp cận của người dân với các phương pháp chẩn đoán sớm còn hạn chế nên tình trạng bệnh nhân phát hiện ra gh t@ Sc Hình 1.4. Tỉ lệ mắc và tử vong ở cả hai giới của 10 ung thư phổ biến nhất năm 2012 [33] Irinotecan (CPT-11,7-ethyl-10-[4-(1-(piperidino)-1-piperidino] carbonyl camptothecin, Camptosar®) là thuốc điều trị chính để điều trị ung thư đại trực tràng giai đoạn muộn, khi ung thư di căn, tái phát hoặc tiến triển sau điều trị ban đầu. Co p yri Thuốc thường được sử dụng kết hợp với các thuốc khác trong các phác đồ. Pháp đồ điều trị phối hợp irinotecan thông thường là FOLFIRI (FOLONIC acid, Fluoroucacil hoặc leucovorin, IRInotecan) [17]. Irinotecan là một dẫn xuất tổng hợp của thuốc chống ung thư camptothecin (lần đầu tiên được phân lập từ cây Camptotheca). Giống như camptothecin, 9 VN U irinotecan ức chế enzym topoisomerase I (là một enzym trong nhân tế bào). Enzym này xúc tác cho một số quá trình trong nhân tế bào như điều hòa cấu trúc cuộn xoắn, quá trình sao chép và sửa chữa của ADN. Irinotecan là tiền chất của SN38. Dạng hoạt hóa SN38 có hoạt tính mạnh gấp ma c y, 100 -1000 lần so với Irinotecan [18]. SN-38 có tác dụng gây độc tế bào bằng cách liên kết với phức hợp topoisomerase-ADN, làm gián đoạn quá trình cắt sợi đơn, ngừng quá trình sao chép. Việc quá trình sao chép bị ngừng đột ngột và sự tương tác của các enzym sao chép với phức hợp SN38-topoisomerase-ADN phá vỡ cấu ha r trúc sợi kép của ADN, gây ra những tổn thương ADN không hồi phục, đưa các tế bào vào quá trình apotosis (chết theo chu trình). Chính vì tác dụng như vậy mà ne an dP irinotecan ngăn cản sự phát triển và tiêu diệt các tế bào ung thư. Nhưng cũng vì thế thuốc ảnh hưởng đến các mô, cơ quan có các tế bào có khả năng phân chia mạnh như đường tiêu hóa, tủy xương. Hậu quả là thuốc thường gây nên các tác dụng không mong muốn có thể dẫn đến tử vong như tiêu chảy nặng, suy tủy, dễ chảy máu… do tích tụ sản phẩm chuyển hóa . Tuy nhiên, nhờ có enzym UGT1A trong Sc ho ol of M ed ici gan, SN-38 được glucuronyl hóa tạo thành sản phẩm không độc và đào thải được (Hình 5). gh t@ Hình 1.5. Đa hình di truyền UGT1A1 và sự chuyển hóa irinotecan. a) Sự chuyển hóa của irinotecan nhờ enzym UGT1A1 ở gan. b) Đa hình di truyền vùng promoter của alen UGT1A1*28 ảnh hưởng tới hoạt tính glucuronul hóa của enzym UGT1A1 Co p yri Dưới sự xúc tác của enzym UGT1A1, SN-38 liên hợp với axit glucuronic hình thành SN-38 glucuronit không còn hoạt tính gây độc, được đào thải chủ yếu qua mật, khoảng 30% qua thận[14]. Chính vì vậy, những bệnh nhân mang alen UGT1A1*28 làm giảm biểu hiện của UGT1A1 sẽ gây tích tụ SN-38 trong cơ thể, gây nguy cơ xuất hiện các tác dụng phụ ở mức độ nặng khi điều trị bằng irinotecan 10 VN U [11]. Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration, viết tắt là FDA) đã đưa ra khuyến cáo nên xét nghiệm gen UGT1A1*28 khi dùng irinotecan và có hướng dẫn về điều trị tương ứng với từng kiểu gen (Hình 1.6) [23]. ma c y, Chưa có một liều lượng irinotecan cụ thể được thiết lập cho alen UGT1A1*28. Tuy nhiên Innocenti và cộng sự năm 2006 đã đưa ra khuyến cáo giảm 20% liều cho bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp UGT1A1*28. Liều lượng thuốc có thể điều chỉnh tăng hoặc giảm trong lần điều trị thứ 2 dựa trên các đáp ứng của khối ho ol of M ed ici ne an dP ha r u với thuốc và quá trình theo dõi các tác dụng không mong muốn. Hình 1.6. Irinotecan và phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến kiểu gen UGT1A1[16] 1.5. Các phƣơng pháp phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28 gh t@ Sc Hiện tại có rất nhiều phương pháp khác nhau để phân tích các đa hình di truyền. Các phương pháp này dựa trên những nguyên lý khác nhau như trình bày bên dưới. Tuy nhiên phương pháp giải trình tự theo nguyên lý của Sanger và PCRRFLP được ứng dụng trong phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28 nhiều hơn cả. Với nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác, phương pháp giải trình tự theo nguyên lý của Sanger được lựa chọn cho nghiên cứu này. 1.5.1 Giải trình tự ADN Co p yri Phần lớn các phương pháp được nói phía dưới ứng dụng cho việc để sàng lọc bước đầu đột biến điểm/ các SNP. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 11 VN U 1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotit (gọi tắt là phương pháp dideoxy) [35]. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này dựa trên sự bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các deoxynucleotit (dNTP) là 2’,3’-dideoxynucleotit (ddNTP). Các ddNTP thiếu nhóm 3’- OH, nên một khi được gắn vào mạch ADN đang tổng ma c y, hợp thì quá trình tổng hợp ADN sẽ dừng lại. Theo phản ứng tổng hợp ADN, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một đoạn oligonucleotit ngắn là đoạn ADN có trình tự xác định trước, thường được tổng hợp hóa học, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. ha r Các mồi oligonucleotit được kéo dài nhờ tác dụng của enzym ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại dNTP và ddNTP để ngắt phản ứng kéo dài ne an dP chuỗi. Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN [1], [27]. Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên. Với ho ol of M ed ici sự phát triển của các enzym ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phương pháp này cho phép sàng lọc các SNP hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đã miêu tả trên. Cho đến nay, giải trình tự thế hệ mới và sử dụng chất huỳnh quang cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao. Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí và có thể tiến hành phân tích với nhiều đột biến điểm cùng lúc [2]. gh t@ Sc Tuy vậy hạn chế của phương pháp này là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền. Thời gian cần thiết để tiến hành giải trình tự cũng kéo dài hơn so với các phương pháp như Real – time PCR và PCR - RFLP. Tuy nhiên, giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm. Bên cạnh đó, giải trình tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ của đối tượng tham gia nghiên cứu. [1] Co p yri 1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand conformation polymorphism - SSCP): Đây là một phương pháp đơn giản được sử dụng trong nghiên cứu đột biến điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN. Cấu trúc 12 VN U không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môi trường chứa chúng. Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi, cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotit và bất cứ thay đổi nào trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn. Phương pháp này sử dụng PCR để khuếch ma c y, đại đoạn gen mong muốn. Sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamit không biến tính, các nucleotit trên phân tử ADN sợi đơn sẽ bắt cặp bổ sung lại với nhau, dẫn đến hình thành cấu hình không gian khác nhau do sự khác biệt về trình tự nucleotit. Các phân tử ADN sợi đơn này sẽ di chuyển với tốc độ ha r không giống nhau và phân tách ra. Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể được sử dụng để tăng khả năng phân tách. ne an dP Nhìn chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự khác nhau [22], [29]. 1.5.3 Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis): Cũng giống như phương pháp SSCP, nguyên lý của phương pháp phân tích dị sợi kép dựa trên sự hình thành của ADN dị sợi kép. Các ADN của một mẫu có ho ol of M ed ici kiểu dại đã được xác định trước được trộn lẫn với mẫu ADN cần phân tích. Các phân tử ADN sợi kép được biến tính ở nhiệt độ cao để phân tách 2 mạch đơn. Nếu mẫu cần phân tích có kiểu gen dị hợp thì trong mẫu trộn lẫn sau biến tính sẽ bao gồm các sợi bổ sung và các sợi có chứa một cặp basơ không bổ sung (tương ứng với vị trí của SNP). Sau đó hạ nhiệt độ xuống chúng sẽ liên kết lại với nhau hình thành Sc ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Chính sự xuất hiện của cặp basơ ghép đôi không chính xác này làm giảm tốc độ di chuyển khi điện di của các phân tử ADN dị sợi kép so với các phân tử ADN đồng sợi kép. Hiện nay phương pháp này đã được cải tiến bằng cách khuếch đại các đoạn ADN của mẫu kiểu gen hoang dại và kiểu gen cần phân tích [22], [29]. gh t@ 1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzym giới hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh Co p yri nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo chiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamit và/hoặc được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot. Trên màng lai có những đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ 13