Tài liệu Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong vaucheria spp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TẠO ĐƯỜNG GLUCOSE TỪ RONG VAUCHERIA SPP Ngành : MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD : CN ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH : PHAN CẨM BÌNH MSSV : 0851110016 - LỚP: 08DSH3 TP. Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Việt Nam có đường bờ biển dài 3.260 km và vùng đặc quyền kinh tế rộng trên 1 triệu km2 với nguồn tài nguyên sinh vật biển khá phong phú. Trong đó, nguồn kinh tế khai khác từ rong, tảo mang lại lơi nhuận khá lớn của ngành kinh tế biển. Tảo được ứng dụng rộng rãi và rất nhiều trên thế giới trên quy mô công nghiệp với nhiều sản phẩm được chiết xuất từ tảo phục vụ trong nhiều lĩnh vực như : trong y học, công nghệ mỹ phẩm, công nghiệp thực phẩm, năng lượng xanh... Hiện nay nước ta có khoảng 700 loài rong tảo thuộc 3 ngành Chlorophyta, Heterkontophyta, Rhodophyta. Nhiều loài mang lại giá trị kinh tế cao, có khoảng 121 loài đang được khai thác phục vụ nhu cầu con người. Với lợi thế về khí hậu nóng ẩm, và diện tích nước mặt nhiều nên rong tảo tại Việt Nam phát triển khá cao. Trong những năm gần đây, nguồn lợi từ rong tảo mang lại cho nước ta khá lớn. Nên như cầu khai thác cũng như tìm tòi, nghiên cứu những loài mới có ý nghĩa hết sức quan trọng. Tảo lục (Chlorphyta) là ngành lớn và rất đa dạng, phân biệt với các ngành tảo khác ở chỗ luôn có màu lục giống như ở thực vật. Đến nay trên toàn thế giới biết khoảng 500 chi và 8000 loài. Phần lớn chúng sống trong nước ngọt gần 90%, còn lại ở biển và đại dương hơn 10%. Trong các biển và đại dương thế giới đã biết 984 loài thuộc 112 chi , 18 họ và 8 bộ. Hiện nay có một số loại rong thuộc ngành rong lục Chlorophyta như Vaucheria Spp. là một loài mới đang trong quá trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học, thuộc ngành tảo vàng lục có phân bố nhiều ở những vùng nước ngọt nghèo chất dinh dưỡng phát triển tự nhiên khá nhiều ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long đã được khai thác và nuôi trồng rộng rãi. Một số loại rong cũng được nghiên cứu nuôi trồng kết hợp với thủy sản nhằm cải thiện môi trường nước và tăng năng suất tôm nuôi. Lợi ích mà nó mang lại khá lớn, không chỉ phục vụ như cầu sản xuất thực phẩm, y học, ngành công nghệ mỹ phẩm, chăn nuôi…mà còn là nguồn nhiên liệu mới trong ngành công nghệ năng lượng, sản xuất xăng sinh học. Tuy nhiên, khả năng sử dụng tất cả các loài rong nói trên hay một trong số chúng làm nguyên liệu đầu vào để sản xuất Trang 1 Đồ án tốt nghiệp nhiên liệu sinh học lại phụ thuộc rất nhiều vào thành phần hóa sinh và khả năng đường hóa. Hiện nay, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu về tiềm năng của việc sản xuất sinh nhiên liệu sinh học từ tảo và đã thu được nhiều kết quả khả quan từ nguồn nguyên liệu này. Và việc xác định các thành phần hóa sinh của rong tảo cũng như tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria Spp đóng vai trò quan trọng trong bước khởi đầu của việc tìm ra nguồn nguyên liệu phù hợp sản xuất xăng sinh học từ tảo. Đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân tạo đường Glucose từ rong Vaucheria spp.” là nhu cầu cấp thiết giải quyết vấn đề trên. 2. Tình hình nghiên cứu: Tình hình nghiên cứu rong biển trên thế giới: Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thực hiện theo nhiều khiá cạnh đa dạng sinh học, nguồn lợi, chế biến, nuôi trồng và tạo giống rong biển. Rong biển đã được nghiên cứu sử dụng trong thực phẩm, công nghiệp và dược phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Các thành phần chiết xuất từ rong có giá trị sinh học như βcaroten, các chất chống oxy hóa cũng đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Rong biển rất giàu protein và khoáng chất, có thể tận dụng sử dựng thực phẩm và thức ăn gia súc. ( Akiko Isa et al., 2009) Một số nghiên cứu đề cập tới ảnh hưởng của các điều kiện nuôi tới thành phần hóa sinh của rong. Hàm lượng protein trong rong biển khá cao và chịu ảnh hưởng bởi các điều kiện nuôi như ánh sáng và dưỡng chất ( Evan &Langdon 2000; Rosen et al. 2000) Một số tác giả cũng đã tìm hiểu về cấu tạo thành phần các polysaccharide của tế bào rong Ulva spp, Enteromorpha sp (Kausik Chattopadhyay, 2006; Bimalendu Ray, 2006). Kết quả cho thấy các thành phần carbonhydrat có thể chiếm tới 29% tổng lượng chất khô của rong. Polysacchride thành tế bào của rong thường chứa các thành phần cellulose và hemicellulose có cấu trúc phân nhánh khá phức tạp với các đường monosaccharide như rhamnose, xylose, glucose, galactose, Trang 2 Đồ án tốt nghiệp ..chiếm tỉ lệ chính và một lượng nhỏ hơn protein và sulphate. Khác với tảo đỏ hay tảo nâu, các loài tảo lục thường không chứa thành phần polysaccharide có tính nhầy nhưa agar và alginic acid (Akiki Asa at el., 2009) . Hàm lượng lignin cũng rất thấp trong tế bào. Những đặc tính về hóa lý, tính chất lưu biến và sinh học đặc biệt của các thành phần carbonhydrat thành tế bào rong biển đã và đang mở ra nhiều cơ hội sử dụng chúng trong tương lai. Tình hình nghiên cứu rong biển trong nước: Ở Việt Nam các nghiên cứu nuôi trồng rong cũng được thực hiện khá nhiều nhưng chủ yếu ở các giống rong câu Gracilariace và rong sụn Kappaphycus.Một số loài rong như G. Bailinae cũng đã được nuôi trồng thử nghiệm ở miền Trung Việt Nam năng suất có thể đạt 8-10 tấn khô/ha trong thời gian nuôi 6 tháng (Huỳnh Quang Năng & Nguyễn Hữu Dinh, 1999). Một số nghiên cứu nuôi trồng kết hợp rong với các loài thủy sảnh khác cũng đã được thực hiện. Nguyễn Hữu Khánh và cộng sự (2005) đã thử nghiệm nuôi trồng kết hợp tôm hùm với bào ngư , rong sụn và vẹm xanh. Huỳnh Quang Năng (2005) Đã xây dựng mô hình trồng rong sụn Kappaphycus alvarezii luân canh trong ao đìa nuôi tôm ven biển. Kết quả thu được rất là khả thi trong việc khai thác tiềm năng nước mặt. Một số tác giả cũng đã nghiên cứu về tác động môi trường, khả năng xử lý ô nhiễm và sinh trưởng của rong trong những điều kiện khác nhau. Ngô Quốc Bưu và cộng sự (2000) đã nghiên cứu về sử dụng rong biển để xử lý nhiễm bẩn hữu cơ trong nước thải ao nuôi tôm. Kết quả cho thấy 2 loài nghiên cứu là Gracilacia hecteroclada và rong sụn Kappaphycus alvarezii đều thể hiện khả năng hấp thụ nitơ và phosphor trong nước thải. Đối với rong bún (Enteromorpha or Ulva) và rong Tóc Đốt Chaetomorpha những nghiên cứu đầu tiên về sinh hóa và tiềm năng ứng dựng của chúng được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của Viện Sinh học nhiêt đới trong khuôn khổ dự án FSPSII/SUDA 3.3.4 năm 2009 (do DANIDA tài trợ). Các loài rong này lọc tự nhiên trong các ao nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long . Kết quả khảo sát sơ bộ cho Trang 3 Đồ án tốt nghiệp thấy, người nuôi tôm rất thích sự hiện diện của các loại rong này so với các loại rong khác và cho rằng sự xuất hiện của chúng đã cải thiện môi trường ao nuôi, làm thức ăn cho tôm và cải thiên năng suất tôm. Mặc dù rong có tiềm năng rất lớn để nuôi kết hợp tôm ở các vùng nước lợ, tuy nhiên, hiện nay, chưa có công trình nghiên cứu sâu nào để đánh giá hết vai trò của rong đối với môi trường ao nuôi, sức khỏe tăng trưởng của tôm. Tình hình nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển: Rong biển được coi là một trong những ứng viên tốt nhất cho con người trong việc tận dụng tài nguyên mặt nước và là đối tượng phù hợp để chuyển đổi cơ cấu nông nghiệp – thủy sản trong bối cảnh biến đổi khí hậu ở các vùng ven bờ và các vùng đất ngập mặn. Thực vật thủy sinh chưa bao giờ được xem xét một cách nghiêm túc làm nguồn cung cấp nhiên liệu sinh học cho mãi tới thời gian gần đây. Nhiều dự án khác nhau bắt đầu được thực hiện trong ba năm trời lại đây, là kết quả của yêu cầu giảm phụ thuộc vào lượng nước ngọt cho trồng trọt và chuyển hoá thực vật trên cạn. Nhật Bản là nước đi đầu trong nghiên cứu sử dụng rong lục (green algae) làm nguyên liệu đầu vào để sản xuất nhiên liệu sinh học. Akiko Isa (2009) đã xác định thành phần Carbonhydrate của một số loài rong Enteromorpha sp., Cheatomorpha sp., Cladophora sp., Ulva sp. Mọc tự nhiên ở Thái Lan, Việt Nam và Nhật. Kết quả cho thấy rong ở Việt Nam chứa hàm lượng glucose cao nhất (300mg/g sinh khối) và sử dụng cellulase có thể chuyển 95% carbonhydrate thành đường. Mặc dù rong biển đã bắt đầu được nghiên cứu sử dụng làm nguyên liệu đầu vào cho quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học tại nhiều nước trên thế giới nhưng hiện nay ở Việt Nam mới chỉ có đề tài của TS. Nguyễn Như Hậu – NITRA“Nghiên cứu đánh giá tiềm năng rong biển Việt Nam sử dụng làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu (Biofuel) đang được triển khai trong ba năm từ 2009 -2011, trong khuôn khổ đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025 (Bộ Công Thương). Trang 4 Đồ án tốt nghiệp Ở Việt Nam, nhìn chung đã có nhiều công trình nghiên cứu về rong biển và nuôi trồng rong biển, tuy nhiên chưa có công trình nào về phát triển sinh khối rong biển tại vùng nuôi tôm trọng điểm ở ĐBSCL và dùng nguồn sinh khối này làm nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học và các sản phẩm có giá trị khác. Việc chuyển hóa nguồn carbohydrat thành đường có thể lên men và sau đó thành ethanol và butanol là một cách tiếp cận mới mẻ và có triển vọng. 3. Mục đích nghiên cứu: Tìm ra nguồn vật liệu khởi đầu thích hợp cho việc nghiên cứu chuyển hóa nguồn carbohydrat thành đường có thể lên men và sau đó thành ethanol và butanol từ rong biển thông qua hàm lượng đường khử sau quá trình thủy phân tạo glucose. Giải quyết vấn đề năng lượng mới. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu: Xác định thành phần hóa sinh của rong Vaucheria spp. Xác định các thông số thích hợp cho quá trình tiền xử lý mẫu rong trước khi tiến hành thủy phân tạo đường. Xác định các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân. 5. Phương pháp nghiên cứu: Các thành phần hóa sinh của rong được xác định theo phương pháp LAPS ( Standard compositional laboratory analytical procedure ) được mô tả bởi Dien et al. 2010. Theo đó thì Protein dược xác định bằng phương pháp Kjeldahl, Lipid được xác định bằng phương pháp Soxhlet; Các chỉ tiêu Carbohydrat tổng, đường tổng, tinh bột, chất xơ , hàm lượng tro và ẩm dược xác định theo phương pháp của FAO và AOAC. Xác định các yếu tố thích hợp cho quá trình thủy phân tạo đường glucose từ rong Vaucheria spp như nồng độ H2SO4 trong giai đoạn tiền xử lý mẫu, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, pH, thời gian, nhiệt độ trong quá trình ủ mẫu. Trang 5 Đồ án tốt nghiệp Định lượng hàm lượng glucose sau quá trình ủ mẫu được xác định theo phương pháp của Miller dựa trên việc đo mật độ quang của phức màu đỏ sậm đặc trưng được tạo ra giữa đường khử với thuốc thử DNS ở bước sóng 540nm. Định lượng hàm lượng HMF của mẫu sau khi ủ bằng phương pháp so màu quang phổ kế. Định lượng độ brix của mẫu bằng thiết bị khúc xạ kế. Các quá trình tối ưu hóa được tiến hành theo quy hoạch thực nghiệm bậc 2. Các thí nghiệm được lặp lại 2- 3 lần để đảm bảo độ tin cậy. Kết quả được tính toán, xử lý trên phần mềm excel 2007 và Statgraphics . 6. Dự kiến kết quả đạt được của đề tài Kết quả cho được các số liệu cụ thể về các chỉ tiêu sinh hóa của rong Vaucheria spp. Xác định được các yếu tố thích hợp để sử dụng cho quá trình thủy phân như nồng độ Enzyme, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng. Xác định được hàm lượng carbohydrate, hàm lượng HMF, và độ brix có trong rong sau quá trình thủy phân. Trang 6 Đồ án tốt nghiệp Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát chung về rong, tảo: Rong tảo là những sinh vật có nhân thật, trong tế bào luôn có chất diệp lục nên chủ yếu sống tự dưỡng. Một số ít cộng sinh với Nấm thành Địa y. Rong tảo sống chủ yếu trong nước, một số ít sống trên đất ẩm hoặc trên vỏ cây. Từ thời Linné (1753), Tảo được coi như một nhóm tập hợp tất cả các “Thực vật bậc thấp” có diệp lục. Phần lớn các hệ thống phân loại công nhận quan điểm này. Theo quan điểm này, Tảo lam cũng nằm trong nhóm Tảo. Tuy nhiên, khi xét các đặc điểm về tế bào học và đặc biệt là sự có mặt của nhân thật dấu hiệu cơ bản nhất của sự tiến hóa, tảo lam vì chưa có nhân thật đã được tách khỏi nhóm tảo. Theo hệ thống sinh giới gồm 4 giới: nhóm tảo được xếp vào giới thực vật làm thành phân giới thực vật bậc thấp (theo P. Raven & G. Johnson (1989)) sự phân chia sinh giới nhất là nhóm có nhân chuẩn thành các giới đôi khi tùy tiện. Không có một hệ thống phân loại nào được toàn thế giới chấp nhận. Ngày nay, một số các nhà sinh học chấp nhận hệ thống sinh giới gồm 5 giới. Theo hệ thống này thì tảo được tách khỏi giới thực vật và được xếp vào giới Nguyên sinh (Protista). 1.1.1. Tổ chức cơ thể Tảo có cấu trúc rất đa dạng: đơn bào, tập đoàn hay đa bào. Mặc dù về cấu tạo, hình dạng, kích thước và màu sắc của tảo rất khác nhau nhưng các tảo cũng có 1 số điểm chung nhau như: Tảo có cơ thể dạng tản chưa phân hóa thành thân, rễ, lá gọi là tản thực vật (Thallophyta) và cũng chưa có các loại mô điển hình trong cấu trúc của tản. Tảo có một vài hình thức sinh sản cũng như môi trường phân bố gần giống nhau nên người ta thường gộp chúng thành một nhóm có ý nghĩa sinh học. 1.1.2. Cấu tạo tế bào Vách tế bào bằng cellulose và pectin. Một vài ngành tảo: Tảo silic, tảo vàng ánh: vách thấm thêm silic, hoặc tảo vòng, tảo đỏ: vách có thêm canxi cacbonat. Mỗi tế bào có 1 nhân, đôi khi nhiều nhân (ở tảo thông tâm). Trong chất nguyên sinh có những bản chứa chất màu (diệp lục và các chất màu phụ khác) gọi là Trang 7 Đồ án tốt nghiệp thể màu. Thể màu có hình dạng khác nhau: hình bản, sao, dải, hình mạng lưới, đĩa, hạt… và ổn định với từng chi. Trong thể màu có những thể nhỏ là hạch tạo bột, chung quanh có các hạt tinh bột lắng tụ (ở tảo lục, tảo vòng). Những chất dự trữ khác là các hydratcacbon đặc biệt (laminarin, amylodextrin…) ở trong hoặc ngoài thể màu. Nhiều dạng tảo đơn bào còn có roi, số lượng có thể là 1, 2 hoặc nhiều. Các roi này xuất phát từ đầu cùng của tế bào, có chức năng vận chuyển. Roi có cấu tạo giống với roi của các sinh vật có nhân thật. Một số tảo còn có một chấm đỏ ở gốc roi gọi là điểm mắt là cơ quan thụ cảm ánh sáng. Một số tảo đơn bào nước ngọt có không bào co bóp. 1.1.3. Sinh sản Tảo cũng rất đa dạng trong sinh sản. Các hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính, nhiều tảo có sự xen kẽ thế hệ. 1.1.3.1. Sinh sản sinh dưỡng Được thực hiện bằng những phần riêng rẽ của cơ thể, không chuyên hóa về chức phận sinh sản. Ở các tảo đơn bào, sinh sản sinh dưỡng thực hiện bằng cách phân đôi tế bào. Ở các tảo tập đoàn có một số tế bào phân chia nhanh hình thành những tập đoàn nhỏ bên trong tập đoàn mẹ (ở tảo Volvox, tảo lưới). Ở các tảo dạng sợi thực hiện bằng cách đứt đoạn gọi là tảo đoạn hay hình thành chồi ở Tảo vòng (Chara). 1.1.3.2. Sinh sản vô tính Được thực hiện bằng các bào tử chuyên hóa, có roi (bào tử động) hay không roi (bào tử bất động), hình thành trong túi bào tử, về sau bào tử nảy mầm thành tản mới. 1.1.3.3. Sinh sản hữu tính Được thực hiện bằng sự kết hợp của những tế bào chuyên hóa là giao tử, hình thành trong các túi giao tử đơn bào. Trang 8 Đồ án tốt nghiệp Dựa vào mức độ giống hay khác nhau của các giao tử mà có 3 hình thức sinh sản hữu tính: đẳng giao, dị giao và noãn giao. Ở một số tảo còn có quá trình sinh sản hữu tính đặc biệt theo lối tiếp hợp giữa hai tế bào sinh dưỡng và không tạo thành giao tử (ở Tảo xoắn). Một số tảo có sự xen kẽ thế hệ trong quá trình sống. Sự xen kẽ thế hệ có thể là đẳng hình hay dị hình. 1.1.4. Phân loại Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hệ thống phân loại tảo của nhiều tác giả: hệ thống của Pascher (1931), hệ thống của West & Fritsch (1927) và Fritsch (1935), hệ thống của Chadefaud (1960), hệ thống của Chadefaud được Fett sửa đổi (1967). Các hệ thống phân loại này đều dựa vào màu sắc và cấu trúc tản để phân loại. Hiện nay con số các ngành Tảo vẫn chưa thống nhất. Gần đây nhiều tác giả thường xếp nhóm tảo vào 9 ngành sau đây: Tảo giáp (Pyrrhophyta), Tảo vàng ánh (Chrysophyta), Tảo vàng lục (Xanthophyta), Tảo mắt (Euglenophyta), Tảo silic (Bacillariophyta), Tảo lục (Chlorophyta), Tảo vòng (Charophyta), Tảo nâu (Phaeophyta) và Tảo đỏ (Rhodophyta). 1.1.5. Khái quát ngành Tảo lục (Chlorophyta) Tảo lục là ngành lớn và rất đa dạng, phân biệt với các ngành tảo khác ở chỗ luôn có màu lục giống như ở thực vật. Tổ chức cơ thể: Đơn bào, tập đoàn hay đa bào hình sợi đơn, phân nhánh hay hình bản mỏng, có khi có cấu tạo cộng bào (tản hình ống thông trong chứa nhiều nhân). Cấu tạo tế bào: Vách tế bào bằng cellulose, pectin hóa nhày, một số dạng nguyên thủy có tế bào trần. Thể màu có nhiều hình dạng khác nhau: hình bản, dải xoắn, sao, hạt… chứa diệp lục a và b, carotin, xantophin, trong đó diệp lục a và b chiếm ưu thế so với các chất màu phụ khác nên tản luôn có màu lục. Trang 9 Đồ án tốt nghiệp Chất dự trữ là tinh bột tập trung quanh hạch tạo bột nằm trong thể màu, đôi khi chất dự trữ là những giọt dầu. Một số Tảo lục đơn bào hay tập đoàn có thể di động được ở trạng thái dinh dưỡng nhờ có roi, còn các tảo lục khác chỉ có bào tử hay giao tử có roi mới di động được. Sinh sản ở Tảo lục: Sinh sản sinh dưỡng: Tảo lục đơn bào sinh sản sinh dưỡng bằng phân đôi tế bào, tảo lục dạng sợi sinh sản sinh dưỡng bằng tảo đoạn. Sinh sản vô tính bằng động bào tử có 2 roi bằng nhau hay bào tử bất động. Sinh sản hữu tính bằng cả 3 hình thức: đẳng giao, dị giao và noãn giao, một số tảo lục Sinh sản hữu tính theo kiểu tiếp hợp. Phân bố và sinh thái: Tảo lục có khoảng 8.000 loài, phân bố rộng rãi khắp mọi nơi có ánh sáng, chủ yếu sống trong nước ngọt, một số trong nước mặn, trên đất ẩm, có khi trên thân cây hoặc bờ tường, vách đá ẩm; còn gặp những dạng kí sinh và cộng sinh. Một số đại diện thường gặp: Tảo lục đơn bào (chi Chlamydomonas): Tế bào hình trứng với 2 roi bằng nhau ở đầu, có điểm mắt ở gốc roi, trong chứa 1 thể màu lớn hình chén sống ở các ao hồ. Tảo tiểu cầu (chi Chlorella): Tảo đơn bào, hình cầu nhỏ, thể màu lõm hình chữ U chiếm gần hết khoang tế bào. Tế bào chứa lượng mỡ và đạm cao nên có giá trị trong chăn nuôi. Sống trong nước ngọt. Hiện nay có nhiều cơ sở đang nuôi loại tảo này để sản xuất thức ăn gia súc. Tảo cầu (chi Chlorococcus): Dạng cầu, lớn hơn loài trên, thể màu hình chén. Sống trong nước ngọt, trên vỏ cây, làm thành một lớp màu lục tươi. Tảo lưỡi liềm (chi Closterium): Tảo đơn bào, hình lưỡi liềm, nhân nằm giữa 2 thể màu hình bản, 2 đầu tế bào có 2 không bào co bóp. Thường gặp ở các ao hoặc rãnh nước bẩn, có khi sống với khuẩn lam dao động trân mặt đất ẩm. Trang 10 Đồ án tốt nghiệp Đoàn tảo (chi Volvox): Tập đoàn hình cầu, đường kính 0,52mm, gồm tới 2 vạn tế bào dàn ra ở phía ngoài, phía trong chứa chất nhầy. Gặp ở các ao tù nước ngọt. Tảo mắt lưới (chi Hydrodyction): Tập đoàn hình mạng lưới, các tế bào kết hợp với nhau thành những mắt lưới 4-6 cạnh, mỗi cạnh là một tế bào có nhiều nhân, ở giữa có 1 không bào lớn. Tảo xoắn (chi Spirogyra): Tảo dạng sợi, gồm nhiều tế bào hình chữ nhật dài, thể màu hình dải xoắn, trong thể màu chứa nhiều hạch tạo bột. Sinh sản hữu tính theo lối tiếp hợp. Tảo xoắn rất phổ biến ở nước ngọt, mọc thành đám ở mương rãnh hoặc ruộng lúa. Rau diếp biển (chi Ulva): Tản có dạng "lá" do 2 lớp tế bào tạo thành. Tản lớn, mép nguyên hay xẻ thành nhiều phiến. Phần gốc do những tế bào sinh dưỡng mất diệp lục kéo dài tạo thành rễ giả. Trong chu trình sống của tảo có xen kẽ thế hệ giống nhau (đẳng hình). Tảo thông tâm (chi Caulerpa): Tản khá lớn, phân hóa giống như "thân", "lá", "rễ" tuy chỉ là một ống liên tục, thường bám vào vách đá ven biển. 1.1.6. Khái quát về chi tảo Vaucheria spp Vaucheria thuộc lớp Tảo vàng lục (Xanthophyceae) Trang 11 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. phân loại sinh giới của chi Vaucheria spp Vaucheria Scientific classification Domain (Giới): Eukaryote Phylum (Ngành): Heterokontophyta Class ( Lớp ) : Xanthophyceae Order ( Bộ ) : heterosiphonales Family ( Họ ) : Vaucheriaceae Genus ( Chi ) : Vaucheria Tảo vàng lục khác với Tảo lục ở chỗ không có chlorophyll b và sản phẩm đồng hóa CO2 không phải là tinh bột mà là leucosin và lipid. Tảo vàng lục khác với Tảo vàng ánh và Tảo silic ở chỗ không có sắc tố Fucoxanthin và nhiều đặc điểm khác nữa. Hình thái tảo vàng lục rất đa dạng: hình monad, hình amíp, hình hạt... Sống đơn độc hay thành tập đoàn. Một số có dạng sợi đơn hay phân nhánh, dạng ống thông suốt chứa nhiều nhân. Thành tế bào cấu tạo bởi cellulose. Các dạng monad và động bào tử của các dạng khác thường có 2 lông roi không đều nhau, cũng có khi có 1 hay nhiều lông roi (xếp thành từng đôi không đều, đính ở phía cực tế bào). Lông roi dài thường có lông và dài gấp 4-6 lần lông roi ngắn . Lông roi dài hướng về phía trước còn lông roi ngắn trơn nhẵn hướng xiên so với trục dọc hay hướng hẳn về phía sau. Thành tế bào nguyên vẹn, trừ chi Tribonema thành tế bào gồm hai mảnh. Sắc lạp có từ 2 dến 6 trong mỗi tế bào, có hình khay. Thành phần sắc tố gồm có chlorophyll a, c, carotenoid, xanthophyll. Tản thường có màu vàng lục. Sinh sản sinh dưỡng theo cách phân đôi tế bào hay từ một phần của tập đoàn. Sinh sản vô tính bằng động bào tử. Động bào tử có hai lông roi lệch nhau, có khi chỉ Trang 12 Đồ án tốt nghiệp có 1 lông roi. Thường động bào tử được sinh ra từ nang động bào tử (zoosporangium). Có loài sinh sản vô tính bằng bào tử bất động. Có loài sinh sản vô tính bằng tự thân bào tử (autospore) hay bằng bào tử màng dầy. Sinh sản hữu tính rất ít khi gặp ở Tảo vàng lục. Tribonema có hai loại giao tử- bất động và di động. Botrydium có giao tử chuyển động, đẳng giao hay dị giao. Tảo vàng lục thường gặp trong các thủy vực nước ngọt có độ dinh dưỡng trung bình hay nghèo. Chúng có đời sống phù du hay sống bám. Một số loài sống trên đất hay trên thân cây ẩm ướt. Tảo vàng lục có các chi phổ biến sau đây: Hình 1.1. Chi tảo Vaucheria (noãn giao) 1.2. Tổng quan về enzyme 1.2.1. Khái quát chung Enzyme theo tiếng Hi Lạp là chất trong nấm men, là một chất xúc tác sinh học chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật. Enzyme đóng một vai trò rất quan trọng trong việc tham gia xúc tác cho các phản ứng sinh hóa của tế bào cơ thể trong điều kiện đẳng nhiệt, đẳng áp“sự sống có thể được định nghĩa là được điều phối của các phản ứng enzyme” Enzyme tham gia xúc tác cho các phản ứng trong hoặc ngoài tế bào, với đặc điểm này đã được con người chúng ta ứng dụng enzyme vào cuộc sống. Mỗi enzyme có tính đặc hiệu riêng biệt với một phản ứng nhất định. Dưới tác dụng của enzyme các phản ứng sinh hóa xảy ra đạt hiệu quả cao, nhiều phản ứng xảy ra đồng thời theo dây chuyền, ít tiêu tốn năng lượng. Enzyme là protein có tính đặc hiệu cao và có hiệu quả hơn gấp nhiều lần so với các chất xúc tác vô cơ. Trang 13 Đồ án tốt nghiệp Enzyme là chất rất khó chế biến bằng phương pháp tổng hợp hóa học mà nó được thu từ các nguồn vi sinh vật, thực vật, động vật vì vậy việc sử dụng chúng an toàn. Enzyme được thu từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chỉ có nguồn enzyme từ vi sinh vật mới đáp ứng được nhu cầu và sản xuất trên quy mô công nghiệp. Các enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính cao, đa dạng, dễ thu nhận. Đặc biệt là nguyên liệu sản xuất enzyme từ nguồn vi sinh vật đa dạng, phong phú, dễ kiếm và rẻ tiền. Hiện nay người ta khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt như công nghiệp chế biến thực phẩm như bia, rượu, nước chấm,bánh mỳ… 1.2.2. Lịch sử phát triển Trang 14 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Tóm tắt lịch sử phát triển của enzyme Nội dung nghiên cứu, phát triển stt Năm 1 1833 Payen và peoz tách được diatase từ malt. 2 1874 Hansen là người đầu tiên tách được gen từ bào tử cừu. 3 1876 Kiihne đầu tiên gọi chất xúc tác sinh học là enzyme. 4 1897 Hai anh em Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO2. 5 1900 Rohm sử dụng protease vào công nghiệp thuộc da và tẩy rửa. 6 1926 Samner kết tinh được uerase và Northrop kết tinh được protease. Fleming phát hiện ra penicilline. 7 1928 Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp. Sử dụng 8 1930 – 1945 glucoamylase thủy phân tinh bột. Boyeretal đưa ra kỹ thuật di truyền và được ứng dụng vào công 9 1972 nghệ enzyme sau này. Nito xác lập quy trình cơ bản tạo acrylamide và một loạt các quá 10 1984 trình sản xuất có sự tham gia của enzyme. Là giai đoạn của việc tạo ra hàng trăm loại enzyme khác nhau. 11 1984 - nay Enzyme được ứng dụng rộng rãi trong đời sống con người. Kỹ thuật enzyme cố định ra đời đã đưa công nghệ enzyme lên tầm cao mới 1.2.3. Tính chất của enzyme Bản chất sinh học Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen. Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng cả trong và ngoài tế bào. Một gen  một enzyme  một phản ứng Trang 15 Đồ án tốt nghiệp Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tính chất gây độc. Đa số enzyme hoạt động xúc tác phản ứng trong điều kiện nhiệt độ 20 – 450C, 1atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính. Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc phản ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học vì vậy enzyme cần dùng với lượng rất nhỏ. Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, thời gian xúc tác… Bản chất hóa học Gồm hai nhóm: Nhóm enzyme đơn cấu tử: Enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy nhất là protein. Nhóm enzyme đa cấu tử: Là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai thành phần gồm: Một thành phần là protein. Thành phần không phải protein. Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác 1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme Hiện nay người ta có nhiều cách thu nhận enzyme từ các nguồn sau: Nguồn enzyme từ động vật Enzyme có thể lấy từ các tuyến dịch hoặc trên các bộ phận khác trên cơ quan tiêu hóa như: Tuyến tụy, dạ dày, màng nhầy, tim…chủ yếu cho enzyme protease. Ưu điểm: Các enzyme lấy từ nguồn động vật có hoạt tính khá cao và ổn định Nhược điểm: Thu nhận khó, hiệu quả thu nhận và hiệu quả kinh tế không cao. Có nhiều rủi ro và không ổn định về nguồn nguyên liệu. Trang 16 Đồ án tốt nghiệp Chưa có nghiên cứu nào nhằm tạo ra giống động vật với mục đích thu nhận enzyme Nguồn enzyme từ thực vật Trong các bộ phận của thực vật có chứa rất nhiều enzyme và có hoạt tính rất cao. Phần lớn gồm các loại sau: Enzyme amylase: Từ đại mạch nảy mầm (malt). Enzyme papain: Từ quả đu đủ. Enzyme bromelin: Từ cây dứa. Enzyme ficin: Từ quả sung. Nhược điểm: Tuy các loài thực vật cho enzyme có hoạt tính cao nhưng cũng gặp rất nhiều khó khăn do lệ thuộc vào điều kiện thiên nhiên và thời gian thu hoạch dài, khó đáp ứng nhu cầu sử dụng. Nguồn enzyme từ vi sinh vật Đây là nguồn enzyme duy nhất được sử dụng để sản xuất enzyme trên quy mô công nghiệp, nó được quan tâm nhiều để phát triển về khối lượng và số lượng enzyme. Khác với nguồn động thực vật, các loài vi sinh vật là động vật đơn bào nên có những ưu điểm hơn hẳn như: Thời gian thu nhận enzyme tương đối ngắn, số lượng enzyme lớn… Hoạt tính của enzyme từ nguồn vi sinh vật cao hơn các nguồn động vật, thực vật. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật cao trong thời gian ngắn nên có thể thu được lượng sinh khối sau nuôi cấy lớn. Từ đó ta có thể chiết xuất ra lượng lớn enzyme. Ưu điểm lớn nhất của vi sinh vật là chúng rất nhỏ nên dễ dàng được đưa vào các thiết bị lên men, từ đó sẽ rất dễ dàng điều khiển và kiểm soát các điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, ánh sáng, lưu thông khí… nên ta có thể điều khiển được tốc độ sinh tổng hợp enzyme. Nguyên liệu dùng để nuôi vi sinh vật sản xuất enzyme là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm, thường là các phế liệu của các ngành công nghiệp. Trang 17 Đồ án tốt nghiệp Có nhiều phương pháp để nuôi cấy và thu nhận enzyme từ vi sinh vật tùy vào điều kiện khác nhau như: Nuôi cấy trong môi trường lỏng, nuôi trên môi trường bán rắn, nuôi trên môi trường rắn. Hiện nay việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường bán rắn đang được tập trung nghiên cứu và được đánh giá là mang lại hiệu quả cao trong việc thu nhận enzyme 1.2.5. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, 4-Oglucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác. Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1, 4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất. Hình 1.2. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase Trang 18 Đồ án tốt nghiệp Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase Một phức hệ enzyme cellulase gồm: endo-β-1,4-glucanase, exo-β-1,4glucanase, β-glucosidase. Trong đó: Endo- β-1, 4-glucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exo- β-1, 4-glucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose. β -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose. Hình 1.3. Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulase Tính chất lý hóa của enzyme cellulase Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định. Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp. Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 550C. Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0. Trang 19