Tài liệu Tối ưu hóa quá trình làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase

i LỜI CÁM ƠN Trước tiên xin cám ơn trường đại học Nha Trang nói chung và khoa Chế Biến nói riêng đã truyền đạt những kiến thức và kĩ năng hữu ích trong suốt 4 năm qua để em hoàn thành chương trình đại học ngày hôm nay. Em xin gửi lời cám ơn tới TS Nguyễn Minh Trí đã nhiệt tình hướng dẫn em thực hiện đề tài. Cám ơn Ths Đặng Thu Hương, giáo viên chủ nhiệm lớp 49TP2, cô đã nhiệt tình giải đáp, hướng dẫn em khi thực hiện tính toán các số liệu, phương thức bố trí thí nghiệm trong quá trình thực hiện. Cám ơn cô Lê Thiên Sa, giáo viên phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ thực phẩm, luôn ủng hộ và giúp đỡ em trong quá trình thực hành ở phòng thí nghiệm. Cám ơn mẹ, gia đình, bạn bè đã ủng hộ và giúp đỡ để hoàn thiện được đề tài tốt nghiệp. ii MỤC LỤC 1.1 Giới thiệu chung về nho .................................................................................3 1.1.1 Hình dạng, cấu tạo ...................................................................................3 1.1.2 Thành phần hóa học .................................................................................5 1.1.2.1 Đường..............................................................................................6 1.1.2.2 Acid hữu cơ......................................................................................6 1.1.2.3 Hợp chất phenol ..............................................................................7 1.1.2.4. Hợp chất nito...................................................................................8 1.1.2.5. Hợp chất thơm.................................................................................8 1.1.2.6. Chất khoáng ....................................................................................8 1.1.2.7. Hợp chất pectin ...............................................................................9 1.2. Tổng quan về enzyme....................................................................................9 1.2.1 Đặc điểm của enzyme ..............................................................................9 1.2.2 Enzyme pectinase................................................................................... 13 1.2.2.1 Giới thiệu về enzyme pectinase ...................................................... 13 1.2.2.2 Ứng dụng của enzyme pectinase .................................................... 16 1.2.2.3 Những nghiên cứu sử dụng enzyme pectinase làm trong dịch quả .. 25 1.3 Giới thiệu về phép thử cảm quan cho điểm................................................... 26 1.3.1 Giới thiệu về phép thử............................................................................ 26 1.3.2 Phương pháp tiến hành........................................................................... 27 1.3.3 Xử lý kết quả.......................................................................................... 27 CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 28 2.1 Nguyên liệu ............................................................................................... 28 2.1.1 Nho ........................................................................................................ 28 2.1.2 Enzyme pectinase................................................................................... 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 29 iii 2.2.1 Quy trình................................................................................................ 29 2.2.2 Xác định các thông số biên..................................................................... 30 2.2.2.1 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về nhiệt độ .......................... 30 2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về thời gian ......................... 31 2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định giá trị biên về nồng độ .......................... 31 2.2.3 Bố trí thí nghiệm tối ưu phương pháp làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase ......................................................................................................... 32 2.2.4 Đánh giá cảm quan khi sử dụng các phương pháp làm trong ................. 33 2.2.4.1 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp lọc ..................... 34 2.2.4.2 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp ly tâm ................ 34 2.2.4.3 Đánh giá cảm quan làm trong bằng phương pháp sử dụng enzyme pectinase .................................................................................................... 35 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................…..36 3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình làm trong dịch nho sử dụng enzyme pectinase ............................................................................................... 36 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình làm trong ................. 36 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ trong quá trình làm trong................ 38 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme trong quá trình làm trong....... 40 3.2 Xử lý kết quả quá trình tối ưu hóa theo phương pháp thực nghiệm ............... 41 3.3 Kết quả đánh giá cảm quan của các phương pháp làm trong dịch nho ép ...... 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ................................................................................. 54 Kết luận ............................................................................................................. 54 Đề xuất ý kiến .................................................................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 55 Phụ lục 1 ................................................................................................................................... 62 Phụ lục 2 ................................................................................................................................... 64 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nho Phan Rang........................................................................................3 Hình 1.2 Cấu tạo nho .............................................................................................5 Hình 1.3 Cơ chế phản ứng của Pectinesterase và Polygalacturonase..................... 16 Hình 1.4 Quy trình sản xuất nước táo ép ............................................................. 18 Hình 1.5 Quy trình sản xuất rượu vang ................................................................ 22 Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm.............................................................................. 29 Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình lọc trong dịch nho bằng enzyme pectinas.................................................................................... 30 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đối với quá trình lọc trong dịch nho bằng enzyme pectinase .................................................................................. 31 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme đối với quá trình làm trong dịch nho bằng enzyme pectinase ................................................................. 31 Hình 2.5 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp lọc..... 34 Hình 2.6 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp ly tâm34 Hình 2.7 Đánh giá cảm quan đối với dịch ép làm trong bằng phương pháp sử dụng enzyme................................................................................................................. 35 Hình 3.1:Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình làm trong dịch nho bằng enzyme pectinase......................................................................................... 37 Hình 3.2 : Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đối với độ đối với quá trình làm trong dịch nho bằng enzyme pectinase .......................................................................... 39 Hình 3.3 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ đối với độ đối với quá trình lọc trong dịch nho bằng enzyme pectinase .......................................................................... 40 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nho Phan Rang...................................................5 Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm quy hoạch tối ưu hóa quá trình làm trong bằng enzyme pectinase................................................................................................................ 32 Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm tâm............................................................................. 33 Bảng 3.1: Số liệu tương ứng giữa độ đục với nhiệt độ khi làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase .......................................................................................... 36 Bảng 3.2: Số liệu tương ứng giữa độ đục và thời gian trong quá trình làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase............................................................................... 38 Bảng 3.3: Số liệu tương ứng giữa nồng độ và độ đục trong quá trình làm trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase............................................................................... 40 Bảng 3.4: Kết quả bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm..... 41 Bảng 3.5: Hệ số bj ................................................................................................. 42 Bảng 3.6: Kết quả thí nghiệm tâm ......................................................................... 42 Bảng 3.7: Kết quả tính Sbj ...................................................................................... 43 Bảng 3.8: Kết quả tính tj ........................................................................................ 43 Bảng 3.9: Kết quả kiểm định sự tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher .............................................................................................................................. 44 Bảng 3.10: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóa ..................................................... 45 Bảng 3.11 Kết quả đánh giá của cảm quan viên về độ trong và màu sắc theo phương pháp cho điểm ....................................................................................................... 46 Bảng 3.12: Bảng phân tích phương sai .................................................................. 48 Bảng 3.13: Bảng số điểm trung bình của các mẫu sắp xếp theo chiều giảm dần..... 49 Bảng 3.14: Kết quả đánh giá của cảm quan viên về mùi theo phương pháp cho điểm .............................................................................................................................. 50 Bảng 3.15: Xử lý kết quả ....................................................................................... 50 Bảng 3.16: Bảng phân tích phương sai .................................................................. 51 vi Bảng 3.17: Kết quả đánh giá của cảm quan viên về mùi theo phương pháp cho điểm .............................................................................................................................. 51 Bảng 3.18: Xử lý kết quả ....................................................................................... 52 Bảng 3.19: Bảng phân tích phương sai .................................................................. 52 1 LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay trên thị trường Việt Nam có khoảng 300 loại nước giải khát các loại, mỗi loại đều đánh vào những thị hiếu khác nhau như giải nhiệt, đẹp da, giảm béo, chữa bệnh... Trước đây thị trường nước giải khát ở nước ta đa phần là sản phẩm nước uống có gas, rất ít những sản phẩm chiết xuất từ trái cây và không có gas. Nhưng mấy năm gần đây do xu hướng người tiêu dùng ưa chuộng các sản phẩm nước không gas nên doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã mạnh dạn đầu tư dây chuyền mới để tung ra hàng loạt sản phẩm theo nhu cầu của khách hàng. Kết quả bán hàng năm 2004-2005 của Công ty nước giải khát hàng đầu Việt Nam Bidrico cho thấy, gần 50% người tiêu dùng thành phố đang chuyển sang các loại nước uống có chứa vitamine, ít ngọt, mùi vị tự nhiên. Năm 2010 các doanh nghiệp kinh doanh nước giải khát đã tăng sản lượng trên mức 20% so với năm 2009: Vinamilk tăng 30% sản lượng nước trái cây nhãn hiệu Fresh; Pepsi tăng 30% sản lượng nước giải khát không gas. Các nhà nhập khẩu cũng làm đa dạng thêm thị trường bằng những mặt hàng cùng loại có thương hiệu: Ligo, Welch"s, Regain, Berri, Drwitt... Công ty Delta cũng khẳng định sẽ sản xuất nhiều sản phẩm nước trái cây, đặc biệt là các loại sử dụng nguyên liệu có tác dụng thanh nhiệt: atisô, mía lau, sâm, bí đao... Nhờ ưu thế là một nước nhiệt đới có nhiều loại trái cây đa dạng, hiện nay nước giải khát sản xuất từ trái cây đang được nhiều doanh nghiệp Việt Nam quan tâm khai thác. Theo công bố nhu cầu tiêu thụ nước giải khát không gas, đặc biệt là nước trái cây tại Việt Nam tăng rất mạnh, đạt gần 30%/năm. Nắm bắt được xu hướng đó, việc tính nghiên cứu phát triển sản phẩm mới và nâng cao chất lượng nước trái cây được đẩy mạnh ở từng doanh nghiệp thực phẩm. Thường trong các công đoạn sản xuất nước quả có sử dụng các enzyme để nâng cao chất lượng và hiệu suất sản xuất. Ứng dụng của các enzyme đã được chứng minh tính hiệu quả cao từ lâu. Những enzyme thường được sử dụng như amylase, protease, pectinase… ứng dụng khá nhiều, đặc biệt là pectinase trong công nghệ chế 2 biến nước giải khát. . Vì thế việc sử dụng enzyme trong ngành công nghệ giải khát là cần thiết để nâng cao chất lượng sản phẩm. Trong lĩnh vực thức uống, enzyme pectinase có tác dụng là một chất làm trong dịch quả nhằm tránh tình trạng sản phẩm bị phân tầng trong thời gian bảo quản. Những nghiên cứu về enzyme pectinase cho thấy enzyme này hoạt động tốt ở khoảng nhiệt độ 30-60oC với thời gian ủ 60-120 phút và ứng dụng với dịch chuối nhiệt độ tối ưu là 43,2oC với thời gian ủ 80 phút [69], dịch sapoche ở nhiệt độ tối ưu là 40oC, thời gian ủ 120 phút [28]. Trong luận văn này tôi nghiên cứu sâu hơn quá trình lọc trong dịch nho ép bằng enzyme pectinase để tìm ra nhiệt độ, thời gian ủ và nồng độ tối ưu. Mục tiêu đề tài Mục tiêu của đề tài nhằm xác định các thông số về nồng độ enzyme pectinase nhiệt độ ủ, thời gian xử lý trong quá trình làm trong dịch nho ép. Nội dung nghiên cứu của đề tài  Xác định các thông số trong quá trình làm trong dịch nho ép - Xác định khoảng nghiên cứu của nhiệt độ ủ, thời gian xử lý, nồng độ enzyme pectinase - Tối ưu hóa các thông số của nhiệt độ ủ, thời gian xử lý, nồng độ enzyme pectinase trong quá trình làm trong dịch nho  So sánh chất lượng cảm quan của dịch nho ép giữa các phương pháp làm trong khác nhau 3 CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về nho Nho là nguyên liệu thô quan trọng để làm rượu và dịch quả vì thế khi hiểu rõ tính chất vật lý và thành phần hóa học sẽ cải thiện tốt hơn chất lượng sản phẩm. Hình 1.1 Nho Phan Rang Nguồn: http://vi.wikipedia.org 1.1.1 Hình dạng, cấu tạo Nho là loại quả mọng, mọc thành chùm trên các cây dạng dây leo thân gỗ, sinh trưởng lớn hơn 2 năm và rụng lá theo mùa. . Nho khi chín có thể được sử dụng trực tiếp hoặc dùng làm mứt, nước ép, thạch, dấm, rượu, chiết xuất dịch từ hạt, nho khô, mật đường và chiết xuất dầu từ hạt. Nho thường được sử dụng nhiều trong sản phẩm có chứa nhiều đường. Nó có hình dạng cầu và elips đặc trưng. Các phần chính trong quả nho là vỏ, thịt và hạt. Vỏ nho Nho có lớp vỏ mỏng được xem như là lớp vỏ ngoài bao xung quanh trái, gồm có 6-10 lớp tế bào, nó được bao phủ bởi láp sáp gọi là cutin. Không giống như các loại thực vật khác, cấu trúc của vỏ nho rất ít các lỗ khí. Vì thế hàm lượng nước muốn thoát ra phải qua lớp sáp cutin và thường thì tốc độ thoát hơi nước rất chậm. Dưới lớp vỏ mỏng bên ngoài thì nho còn một lớp mỏng gọi là lớp dưới da gồm các tế bào hình dạng phẳng. Những tế bào này có xu hướng tạo ra hợp chất 4 phenol nồng độ cao khi nho chín, đây cũng là hợp chất ảnh hưởng tới mùi, vị, màu sắc của nho đồng thời các yếu tố cảm quan của sản phẩm từ nho như nước ép, rượu vang. Thành phần chính của lớp vỏ: yếu tố tạo màu, tannin, hợp chất thơm, kiềm và các chất khoáng. Thịt quả Tế bào chủ yếu trong thịt quả thường có kích thước lớn và hình cầu khác so với tế bào ở vỏ. Những tế bào này thưòng có kích thước không bào lớn, nơi này sẽ bị thay thế bởi các hợp chất đường, acid, hợp chất phenol khi nho chín. Những tế bào thịt quả phân chia rất nhanh sau ba tuần nho ra hoa, và tỉ lệ phân chia còn phụ thuộc vào yếu tố môi trường. Sau giai đoạn phân chia thì các tế bào hoạt động chậm lại, và thường có xu hướng tổng hợp để tăng kích thước. Kích thước thịt quả thường được quyết định bởi số lượng và kích thước của các tế bào bên trong. Tế bào thịt quả chứa nhiều khoảng không bào lớn bên trong có dịch hoặc chất dinh dưỡng. Khi nho bị dập, những tế bào trong thịt quả thường bị phá vỡ và làm thoát dịch ra ngoài. Hạt nho Hạt nho thường có lớp vỏ bao ngoài, nội nhũ, phôi, thường khi mới phát triển, nội nhũ sẽ là nguồn dinh dưỡng để nuôi phôi của hạt. Kích thước của nho cũng bị ảnh hưởng bởi số hạt có bên trong nó. Vỏ hạt cũng chứa hàm lượng tannin cao, cũng như hợp chất phenol. Tuy nhiên hợp chất phenol này giảm dần khi nho chín và phenol thì thường tạo vị đắng chát nếu sử dụng hạt nho. 5 Hình 1.2 Cấu tạo nho Nguồn: http://wikipedia.org/grape 1.1.2 Thành phần hóa học Nho tươi chứa 70-80% lượng nước và nhiều chất hòa tan khác bên trong. Những chất hòa tan này bao gồm cả chất hữu cơ và vô cơ. Một số chất quan trọng như:  Đường  Acid hữu cơ  Hợp chất phenol  Hợp chất nito  Hợp chất thơm  Hợp chất pectin  Khoáng Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nho Phan Rang Nguồn:http//Wikipedia.com/nhophanrang Chỉ tiêu Nước pH (%) Đường Acid Pectin (g/l) tổng số (g/l) Tro (%) Nito (g/l) (g/l) Tỷ lệ 90 3,3 126 6,45 2,196 0,68 0,276 6 1.1.2.1 Đường Trong nho, đường chiếm một phần lớn trong hàm lượng chất tan. Glucose và fructose là 2 đường chính ở trong dịch ép. Hàm lượng đường trong nho chín có thế đạt từ 100-150g/l dịch ép. Đối với nho chưa chín thì hàm lượng glucose chiếm nhiều hơn. Khi nho bắt đầu chín thì tỉ lệ glucose và fructose hiện diện ngang nhau, còn nho chín quá thì hàm lượng fructose vượt quá glucose nhiều lần. Fructose, glucose và sucrose có độ ngọt khác nhau, sắp xếp theo thứ tự tăng dần theo độ ngọt thì : fructose, sucrose, glucose. Nếu tính theo tỉ lệ fructose là 100 thì sucrose là 84 và glucose là 66. Đây là một yếu tố quan trọng đối với nhà sản xuất rượu hoặc nước giải khát. Ví dụ nếu nhà sản xuất mong muốn nước giải khát có vị ngọt cao thì họ sẽ cần nhiều sucrose hơn fructose để đạt tới điểm cảm quan mong muốn. Glucose và fructose là những loại đường có thể lên men. Trong suốt quá trình lên men, nấm men sẽ chuyển hóa đường thành rượu và CO2. Hàm lượng alcohol sản sinh ra có liên quan tới hàm lượng đường ban đầu trong dịch ép, vì thế để khống chế hàm lượng alcohol trong dịch thì nên khống chế hàm lượng đường ban đầu. Có thể tham khảo thêm công thức giữa lượng đường và alcohol trong rượu: o Brix x 0,55 = % alcohol trong rượu. Hàm lượng đường trong dịch nho ép thường được biểu hiện thông qua độ Brix. Đơn vị Brix được biểu hiện cho hàm lượng đường có trong 100gram dịch ép, tuy nhiên thông thường thì có thể quy đổi thành hàm lượng đường có trong 100ml dịch ép. Thông số này có thể được đo bằng thiết bị khúc xạ kế. Hàm lượng đường cũng có thể đo bằng tỷ trọng kế sau đó chuyển đổi qua độ Brix. 1.1.2.2 Acid hữu cơ Cũng như hàm lượng đường thì acid hữu cơ cũng đóng vai trò quan trọng trong dịch ép và rượu nho. Nó đóng vai trò tạo vị chua và ảnh hưởng tới các tính chất ổn định, màu sắc và pH trong rượu. Các acid quan trọng được tìm thấy trong nho là: tartaric, malic và citric. Nhiều acid hữu cơ khác như amino acid cũng được thấy tuy nhiên acid tartaric và malic đã chiếm trên 90% tổng acid có trong nho. Ở 7 giai đoạn đầu phát triển thì hàm lượng acid trong nho tăng dần tuy nhiên khi nho càng chin, hàm lượng đường càng nhiều thì hàm lượng acid lại giảm. Nhìn chung acid malic giảm nhiều nhát vì thế khi nho trưởng thành thì lượng acid tartaric chiếm nhiều hơn acid malic. Nho là một trong những trái cây chứa nhiều acid tartaric và muối của nó. Bitartrate là một hợp chất quan trọng ảnh hưởng tới pH và sự ổn định ở nhiệt độ thấp của rượu. Thành phần acid trong nho bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như giống loài, điều kiện địa lý, phương thức trồng trọt… Nồng độ acid ở khí hậu ấm thấp hơn so với khí hậu lạnh. Hàm lượng acid có thể đo bằng đơn vị TA, đây là thông số quan trọng dùng để đánh giá chất lượng của dịch ép và rượu. 1.1.2.3 Hợp chất phenol Hợp chất phenol là nhóm chất có cấu trúc đa dạng và đóng vai trò quan trọng trong tạo màu và vị của rượu. Nhóm chức này cũng góp phần vào phản ứng hóa nâu trong nho và rượu. Hợp chất phenol có nhiều trong hạt và vỏ của nho, dịch ép chỉ chứa lượng nhỏ từ 3-5% trên tổng số. Rượu nho trắng ít bị ảnh hưởng bởi vì đã bỏ xác trong quá trình lên men nên hàm lượng phenol thấp, chỉ từ 100-250mg/l đối với acid gallic (GAE) . Rượu nho đỏ thì khi lên men có cả hạt và vỏ nên hàm lượng phenol cao hơn, tùy theo thời gian mà hàm lượng ừ 1000-3500mg/l GAE. Hai chất chính trong hợp chất phenol là anthocyanins và tannins. Anthocyanin là yếu tố màu quyết định màu của nho là đỏ hay tím. Ở nho đỏ chưa chín thì anthocyanins ở dạng tự do, chưa liên kết, đến khi nho chin thì chất này mới liên kết với các chất khác trong nhóm phenol. Ở trạng thái liên kết thì chất màu này góp phần vào sự ổn định cho rượu vang đỏ. Tannin là loại hợp chất phức tạp có phân tử lượng lớn trên 500. Nó có thể màu vàng, nâu hoặc đỏ và có vị chát. Trong suốt quá trình chế biến và làm chin rượu thì tannin bị polyme hóa nên sẽ làm tăng kích thước 8 phân tử. Khi nho dần chín thì cấu trúc của thành phần hợp chất tannin thay đổi, vì thế nho bớt đắng, ngon và thơm hơn. 1.1.2.4. Hợp chất nito Nho chứa nhiều hợp chất nito như ammonium cation và hợp chất nito hữu cơ như amino acid, peptide, protein. Hàm lượng hợp chất nito phụ thuộc vào giống nho, khí hậu, thổ nhưỡng, phân bón và kỹ thuật canh tác. Tổng lượng nito tăng dần khi nho sinh trưởng. Lượng nito chứa trong hợp chất rất quan trọng bởi vì nó là nguồn dinh dưỡng cho nấm men và vi khuẩn lactic sinh trưởng. Nito ảnh hưởng tới sự tạo thành sinh khối của vi khuẩn và nấm, tỉ lệ lên men, các yếu tố cảm quan khác. Protein (hợp chất nito) có tác dụng tạo sự ổn định trong rượu. Nếu thiếu hàm lượng nito thì sẽ làm giảm sự lên men và có thể tạo nên hợp chất H2S có mùi trứng thối. Để hạn chế vấn đề này thì nên bổ sung DAP (Diammonium phosphate) vào dịch nho trước khi lên men. Tỉ lệ lớn nhất DAP cho phép bổ sung là 958,7mg/L hoặc 8lbs/1000 gal. 1.1.2.5. Hợp chất thơm Nhiều hợp chất thơm bay hơi được tìm thấy trong rượu vang. Những hợp chất này có thể xuất phát từ nho, quá trình lên men hay ủ rượu. Phần lớn các hợp chất thơm trong nho nằm trong lớp vỏ hoặc trong tế bào bên dưới. Sự tập trung của các chất này tăng dần trong quá trình chin nên tốt nhất thu hoạch nho khi mùi thơm đạt tới điểm cao nhất. Nhiều yếu tố ảnh hưởng tới mùi thơm trong nho nên khi thực hiện thủ công hay các công đoạn phải cẩn thận để sản phẩm có hương thơm cao nhất như mong muốn. 1.1.2.6. Chất khoáng Chất khoáng có trong nho là được hấp thụ từ nguồn đất nơi trồng và thường chiếm từ 02-0,6% trọng lượng nho tươi. Những chất khoáng quan trọng như: kali, natri, sắt, phosphate, sulfate và chlorie..trong những chất trên thì kali là quan trọng nhất, chiếm từ 50-70% cation của dịch. Trong quá trình chín, hàm lượng kali trong 9 nho tăng lên, và nó chuyển dần sang trạng thái kali bitartrate nên làm giảm lượng acid và tăng pH của dịch. 1.1.2.7. Hợp chất pectin Hợp chất pectin chứa nhiều trong thành tế bào, đây là loại polysaccharide phức tạp được tạo thành từ các phân tử galacturonic liên kết với nhau. Trong quá trình chín thì pectin bị thủy phân tự nhiên từ các enzyme pectolytic. Ở trong dịch ép thì pectin gây nên hiện tượng đục và tạo phân tầng. Để khắc phục vấn đề này thì nhiều phương pháp sử dụng enzyme thương mại được áp dụng. 1.2. Tổng quan về enzyme 1.2.1 Đặc điểm của enzyme Khái niệm chung và đặc tính của enzyme Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác. Người ta đã khám phá rằng các enzyme đã có xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hóa, tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cần đối theo những chiều hướng xác định. Như vậy enzyme đã đảm bảo cho sự trao đổi thường xuyên giữa cở thể sống và môi trường bên ngoài. Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn lần so với các chất vô cơ và hữu cơ khác. Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường, pH môi trường gần với pH sinh lý, enzyme có khả năng lựa chọn cao đối với các phản ứng mà nó xúc tác, cũng như đối với chất mà nó tác dụng. Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme  Bản chất của enzyme Enzyme đa phần là những protein có hoạt tính sinh học, do vậy nó có đủ tính chất như một protein thông thường. 10 Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn 12000 Dalton. Giống như các protein khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi phân cực...Enzyme dễ dàng bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học vốn làm kết tủa protein. Enzyme không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ thấp ngược lại dưới tác dụng của yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc, muối kim loại nặng ở nhiệt độ cao,enzyme thường bị mất hoạt tính xúc tác.  Cấu trúc của enzyme Enzyme của nấm mốc cũng như các enzyme khác được chia thành hai loại sau : o Enzyme một cấu tử (enzyme đơn giản) : trong thành phần phân tử chỉ có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân. o Enzyme hai cấu tử (enzyme phức tạp) : trong thành phần cấu tạo của nó gồm hai thành phần là protein (apenzyme) và phi protein (coenzyme) những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng oxy hóa-khử, các quá trình vận chuyển. Trung tâm hoạt động cua phân tử enzyme chỉ chiếm một tỷ lệ khá nhỏ so với phân tử enzyme và nó bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau. Ở enzyme một cấu tử thì trung tâm hoạt động là một số nhóm chức nhất định của các acid amin như (-SH, -OH, -COOH...) Trung tâm hoạt động của enzyme hai cấu tử là do phần polypeptide kết hợp đặc biệt tham gia vào việc tạo thành trung tâm hoạt động và các nhóm chức của coenzyme, ngoài ra các trung tâm này còn có sự tham gia của các ion kim loại. Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào tổng hợp các nhóm tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động, nếu vì một lí do nào đó mà trung tâm hoạt động này bị phá vỡ thì hoạt tính xúc tác của enzyme mất đi.  Cơ chế tác dụng của enzyme Enzyme (E) là chất xúc tác sinh học, khi tác dụng với cơ chất (S) để ra sản phẩm (P) trải qua các giai đoạn theo cơ chế sau : E+S  ES  P+E 11 o Trong giai đoạn thứ nhất : enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. o Trong giai đoạn thứ hai : xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của enzyme dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này. Kết quả làm cho cơ chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn. o Trong giai đoạn thứ ba : sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóng dưới dạng tự do để tiếp tục tham gia tác dụng với cơ chất khác. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ các chất phản ứng, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme...  Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phản ứng cho enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ. Theo quy luật của phản ứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chất của enzyme là protein nên nhiệt độ chỉ tăng cao đến mức nhất định. Đa số các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 60oC trở lên, trông nhiệt độ thích hợp nếu cứ tăng lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 1,5-2 lần. Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố : thời gian tác dụng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp. Ngoài ra còn phụ thuộc vào nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng sẽ làm biến đổi tác dung của nhiệt độ.  Ảnh hưởng của pH : enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường. Mỗi enzyme chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme 12 Một số enzyme hoạt động ở pH thấp như pepsin pH=1,8-2,2 và hoạt động ở pH cao như tripsine pH=5-9, cùng một số loại enzyme thu được ở các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau.  pH của môi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do: - pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm của enzyme. - pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme, nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất.  Ảnh hưởng của thời gian : trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để. Mặt khác nếu thời gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để, như vậy hiệu suất thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gây lãng phí nguyên vật liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu.  Ảnh hưởng của nồng độ muối : muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụng bảo quản nguyên liệu trong quá trình thủy phân. Mặt khác, muối ăn còn điều vị mặn tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì thúc đẩy enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm hãm sự hoạt động của enzyme.  Ảnh hưởng của ion kim loại : một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệt của sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiều enzyme khác chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kim loại. Có những ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động của một số enzyme, nhưng một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzyme này.  Ảnh hưởng của chất kìm hãm : chất kìm hãm là chất làm yếu hoặc chấm dứt toàn bộ phản ứng của enzyme. Có hai loại chất kìm hãm : 13 Kìm hãm cạnh tranh : là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu trúc tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làm giảm vận tốc xúc tác. Kìm hãm không cạnh tranh : là chất kết hợp ở vị trí khác với trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốc phản ứng xúc tác.  Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khả năng làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạng không hoạt động thành dạng hoạt động. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hổi hoạt độ của enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp. Hoạt hóa không gián tiếp : làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếp phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme. Hoạt hóa gián tiếp : chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác. 1.2.2 Enzyme pectinase 1.2.2.1 Giới thiệu về enzyme pectinase Enzyme pectinolytic có nhiều trong thực vật và vi sinh vật [74]. Đây là yếu tố quan trọng trong thực vật mà có thể củng cố thành tế bào [70] và giúp làm mềm các mô tế bào trong quá trình chín và bảo quản [61,5]. Enzyme này cũng là nhân tố góp phần vào việc cân bằng môi trường khi phân hủy và tái chế các phần thừa thực vật [34]. Vi sinh vật sản sinh pectinase cũng được nghiên ngứu nhiều trong những năm gần đây [36]. Các nghiên cứu về enzyme pectinase từ vi khuẩn [15,14,12], nấm men [13,56] và nấm [21,56]. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm hiện tại của pectinase 14 được chiết xuất từ nguồn nấm [65]. Aspergillus niger được xem là loại nấm phổ biến nhất để sản xuất hệ enzyme pectinase công nghiệp [50,26]. Hợp chất pectinase được phân loại [61] [52] như sau: o Protopectinase: chuyển hóa hợp chất protopectin không tan thành pectin hòa tan. o Esterases: cắt và ngăn quá trình ester hóa của hợp chất pectin bằng cách cắt các nhóm methoxyl ester. o Depolymerases: cắt và thủy phân mạch α-(1-4)-glycosidic của acid D- galacturonic trong hợp chất pectin. Phản ứng de-polyme trên hợp chất pectin có 2 cơ chế khác nhau, thủy phân và cắt các mạch của pectin có sự tham gia của nước và oxy hoặc là cắt bộ khung pectin nhưng không có sự hiện diện của các phân tử nước [6,16]. Depolymerase có thể chia thành 4 loại khác nhau, phụ thuộc vào hợp chất enzyme nền là gì, cơ chế chung đều là cắt các mạch glycosis [57]. Polygalacturonase và polymethylgalacturonase cắt các mạch pectate và pectin, chủ yếu là dùng cơ chế thủy phân. Tuy nhiên, polygalacturonate lyase và polymethylgalacturonate lyase cắt các mặc pectate và pectin bằng loại trừ nhóm β. Phụ thuộc vào yếu tố phản ứng, ngẫu nhiên hay có mục đích thì enzyme được chia thành enzyme nội bào hay enzyme ngoại bào [27]. Polygalacturonase (PGases) là hệ enzyme pectinolytic cắt các mạch acid polygalacturonic cùng với sự tham gia của nước và oxy. Có nhiều nghiên cứu sâu về các loại enzyme trong hệ này. Hệ enzyme PGases thủy phân hợp chất pectin gồm có endo-PGase (E.C.3.2.1.15) và exo-Pgases (E.C.3.2.1.67). PGases có những ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm. Endo-PGases có nhiều trong nấm, vi khuẩn và nấm men [42]. Nó được tìm thấy nhiều trong loại giun tròn kí sinh [63], hay nhiều loài như Aureobasidium pullulans [64], Rhizoctonia solani Kuhn [48], Fusarium moniliforme [19], Neurospora crassa [55], Rhizopus stolonife [47], Asppergillus sp.[49], Thermomyces lanuginosus [40], Peacilomyces clavisporus [66]. Endo-PGases thường được tìm thấy trên nhiều loài vi sinh vật. Tuy nhiên, exo-PGases ít thấy hơn.