Tài liệu Tinh chế Interleukin-2 của người tái tổ hợp cải biến trong Escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công thức bán thành phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------ Đào Trọng Khoa TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CẢI BIẾN TRONG ESCHERICHIA COLI Ở QUY MÔ NỒI LÊN MEN VÀ TẠO CÔNG THỨC BÁN THÀNH PHẨM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số chuyên ngành: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS. Trương Nam Hải PGS. TS. Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2015 Lời cảm ơn Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và PGS. TS. Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Tiếp đến tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học và Công ty TNHH Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (Vabiotech) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo động viên và cho tôi những lời khuyên quý giá trong công việc cũng như cuộc sống. Tôi xin gửi lời cám ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh nói riêng cũng như trong toàn Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin được gửi tới gia đình, bạn bè lời cảm ơn chân thành nhất vì đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội ngày 16 tháng 06 năm 2015 Học viên cao học Đào Trọng Khoa MỤC LỤC MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4 1.1. Tổng quan về bệnh ung thư ..................................................................................4 1.1.1. Khái niệm về bệnh ung thư ...........................................................................4 1.1.2. Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam .............................................8 1.1.3. Các phương pháp điều trị ung thư ...............................................................10 1.2. Tổng quan về Interleukin-2 ................................................................................11 1.2.1. Cấu trúc của Interleukin-2 ...........................................................................11 1.2.2. Vai trò và chức năng sinh học của Interleukin-2.........................................13 1.2.3. Ứng dụng của Interleukin-2 trong điều trị ung thư .....................................15 1.3. Hệ thống lên men nuôi cấy E. coli tái tổ hợp .....................................................17 1.4. Tinh sạch protein dạng thể vùi ...........................................................................19 1.4.1. Tổng quan về tinh sạch protein ...................................................................19 1.4.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..22 1.5. Công thức pha chế bán thành phẩm ...................................................................24 CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................28 2.1. Chủng giống và vật liệu nghiên cứu ...................................................................28 2.1.1. Chủng vi khuẩn E. coli BL21 DE3 ..............................................................28 2.1.2. Vector biểu hiện ..........................................................................................28 2.1.3. Hóa chất .......................................................................................................29 2.1.4. Máy móc và thiết bị .....................................................................................29 2.1.5. Các môi trường và dung dịch ......................................................................30 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................32 2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 trong E. coli ở quy mô nồi lên men 5 lít ...32 2.2.2. Phương pháp xử lý tiền tinh chế Interleukin-2 ............................................33 2.2.3. Phương pháp tinh chế Interleukin-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao .........34 2.2.4. Kiểm tra sản phẩm protein bằng điện di SDS-PAGE .................................35 ii 2.2.5. Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu miễn dịch Western Blot ........................................................................................................................36 2.2.6. Phương pháp nghiên cứu lập công thức bán thành phẩm và đông khô .......38 2.2.7. Phương pháp xử lý kết quả điện di SDS-PAGE bằng phần mềm Quantity One.........................................................................................................................40 CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................42 3.1. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men lớn.........................42 3.1.1. Nuôi cấy chủng E. coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men 5 lít ................42 3.1.2. Khảo sát thành phần dinh dưỡng .................................................................44 3.1.3. Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng E. coli BL21 IL-2 .....................46 3.1.4. Lên men chủng E. coli BL21 IL-2 đợt 2 .....................................................47 3.2. Siêu âm phá tế bào và xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp 48 3.3. Tinh chế mẫu protein Interleukin-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC ......................54 3.4. Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One. ..............57 3.5. Nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm Interleukin-2 ...........58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................63 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicillin APS AU DNA Ammonium persulfate Absorbance unit Deoxyribonucleotide acid dOT E. coli Dissolved oxygene tension Escherichia coli EDTA Ethylenediamin tetra-acetic acid FDA Food and Drug Administration GnHCl HIV HPLC Guanidine hydrochloride Human Immunodeficiency Virus High Performance Liquid Chromatography HSA IARC IL-2 Human serum albumin The International Agenecy for Research on Cancer Interleukin-2 IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside LAK LB LBA NK OD PBS PEG PMSF Lymphokine-Activated Killer cell Môi trường Luria-Bertani Môi trường LB có bổ sung Amp Natural Killer Optical density Phosphate buffer saline Polyethylene glycol Phenylmethylsulfonyl fluoride PVDF rhIL-2 SDS SDS-PAGE TEMED TBS TFA TMB Polyvinylidene fluoride Recombinant human Interleukin-2 Sodium dodecyl sulfate SDS-polyacylamide gel electrophoresis N,N,N’,N’-Tetramethyl-Ethylenediamin Tris buffer saline Trifluoroacetic acid Tetramethylbenzidine TTBS WHO Dung dịch TBS bổ sung Tween-20 World Health Organization iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Tiêu bản nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường và tế bào ung thư ác tính ở tủy xương Hình 2. Minh họa cấu trúc không gian 3 chiều của Interleukin-2 Hình 3. Đích tác động của Interleukin-2 Hình 4. Tác động của Interleukin-2 đến tế bào T Hình 5. Hệ thống lên men bioreactor quy mô nhỏ Hình 6. Hệ thống tinh sạch protein HPLC Hình 7. Bản đồ vector biểu hiện pET22b(+) (Novagen) Hình 8. Điện di protein tái tổ hợp IL-2 sau khi lên men bằng hệ thống lên men 5 lít Hình 9. Điện di sản phẩm protein tổng số trong điều kiện thay đổi thành phần chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy Hình 10. Khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp so với chủng đối chứng (E. coli BL21 không mang gene mã hóa IL-2) Hình 11. Lên men chủng tái tổ hợp E. coli BL21 IL-2 đợt 2 Hình 12. Điện di mẫu siêu âm phá tế bào theo thời gian Hình 13. Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, xử lý ly tâm thu tủa không tan Hình 14. Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, giảm nồng độ GuHCl để thu hồi protein ở dạng tủa Hình 15. Sơ đồ tóm tắt quá trình xử lý thô để thu hồi protein IL-2 Hình 16. Điện di kiểm tra các phân đoạn trong quá trình phá tế bào và xử lý thu protein thô Hình 17. Sắc ký đồ tinh chế protein IL-2 tái tổ hợp nhờ hệ thống HPLC Hình 18. Điện di kiểm tra các phân đoạn trong quá trình tinh chế HPLC Hình 19. Xác định thành phần độ tinh khiết của protein bằng phần mềm Quantity One Hỉnh 20. Sản phẩm hoàn nguyên sau đông khô các hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm Hình 21. Điện di kiểm tra các mẫu hoàn nguyên sau khi đông khô v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học Bảng 2. Một số oncogene và tumor suppressor gene liên quan đến ung thư ở người Bảng 3. Công thức cho 2 bản gel SDS-PAGE (gồm 2 lớp gel tách và gel cô) Bảng 4. Bảng công thức pha chế bán thành phẩm Bảng 5. Bảng tiêu chuẩn đánh giá độ đục của sinh phẩm Bảng 6. Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 bằng phần mềm Quantity One Bảng 7. Độ đục của các hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm vi MỞ ĐẦU Ngày nay, thế giới đang ngày càng nhận thức rõ mức độ nghiêm trọng của các bệnh không lây nhiễm nói chung và bệnh ung thư nói riêng đối với sức khỏe con người. Ước tính riêng ở Hoa Kỳ năm 2014, có 1 665 000 ca nhiễm ung thư mới được phát hiện và gần 586 000 người tử vong do ung thư, trung bình 1600 ca mỗi ngày [22]. Theo ghi nhận của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), số trường hợp mắc ung thư mới đã tăng từ 12,7 triệu trường hợp năm 2008 lên 14,1 triệu trường hợp năm 2012, và vẫn có xu hướng tăng lên. Các quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề nhất là các nước có thu nhập thấp và trung bình, vì các nước này thiếu các trang thiết bị cần thiết để đối phó với sự gia tăng của các trường hợp ung thư [23]. Hiện nay có 5 phương pháp điều trị ung thư chính đó là phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, liệu pháp gene và liệu pháp miễn dịch, trong đó liệu pháp miễn dịch ngày càng được nghiên cứu sâu rộng và ứng dụng rộng rãi nhờ có nhiều ưu điểm là an toàn, hiệu quả và không có tác dụng phụ. Liệu pháp miễn dịch là sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ hệ miễn dịch của cơ thể để tiêu diệt tế bào ung thư đồng thời hỗ trợ sức sống cho các tế bào bình thường khác trong cơ thể. Một trong các loại sản phẩm đó là cytokine, với nhiều loại khác nhau do nhiều loại tế bào tiết ra. Các cytokine đã được nghiên cứu từ lâu với mục đích điều trị và hỗ trợ điều trị cả bệnh truyền nhiễm và bệnh không truyền nhiễm của người, trong đó Interleukin-2 là một trong những loại cytokine được nghiên cứu sớm nhất. Interleukin-2 (IL-2) từ lâu đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị hai loại ung thư thận và ung thư hắc tố. Trước đây, IL-2 dùng cho điều trị được tách chiết tự nhiên từ tế bào T hoặc là từ các tế bào động vật nuôi cấy, phương pháp này có nhược điểm là hàm lượng IL-2 tách chiết được cũng như hoạt tính riêng khá thấp không đáp ứng được yêu cầu điều trị. Để khắc phục những hạn chế trên, IL-2 chủ yếu được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp. Hiện nay sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp dạng thương phẩm (Proleukin®) đã được bán rộng rãi ở trên thế giới. Sự thử nghiệm chế phẩm Proleukin®IL-2 trên đối tượng động vật và trên 1 các bệnh nhân ung thư cho thấy chúng có hoạt tính sinh học với khả năng làm giảm các tỷ lệ di căn của các khối u, không bị kết tủa và sử dụng dễ dàng nên được sử dụng nhiều trong phương pháp miễn dịch trị liệu để điều trị ung thư [39, 45], tuy nhiên giá thành của sản phẩm hiện tại khá cao (2532 USD/ ống 1,3mg) [19] đặc biệt là so với thu nhập bình quân đầu người của các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Vì vậy hiện nay Nhà nước và Bộ Y Tế đang rất khuyến khích việc nghiên cứu và sản xuất sản phẩm Interleukin-2 tái tổ hợp của Việt Nam để hỗ trợ điều trị ung thư. Đề tài nghiên cứu KC.04.21/06-10 đã cho những kết quả nghiên cứu biểu hiện Interleukin-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli khá khả quan ở cả quy mô phòng thí nghiệm và ở hệ thống lên men 5 lít. Tuy nhiên để đảm bảo sản phẩm Interleukin-2 có cấu trúc hoàn toàn giống với sản phẩm thương mại Proleukin, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xin cấp phép sử dụng sản phẩm sau này, protein IL-2 cần được cải biến để loại bỏ amino acid alanine ở đầu N. Dự án “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli” giai đoạn 2012-2015 được thực hiện nhằm hoàn thiện công nghệ sản xuất Interleukin-2 dạng cải biến. Giai đoạn đầu của dự án đã cho kết quả biểu hiện thành công IL-2 dạng cải biến ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên để hướng tới sản xuất quy mô lớn và có khả năng ứng dụng thực tiễn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu biểu hiện Interleukin-2 ở quy mô lớn hơn trong hệ thống lên men. Sau khi protein đã được biểu hiện thành công, cần có phương pháp thích hợp để tinh sạch sản phẩm Interleukin-2 và thiết lập công thức bổ sung các tá chất cần thiết trước khi tiến hành đông khô sản phẩm để bảo quản. Trên cơ sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tinh chế Interleukin-2 người tái tổ hợp cải biến trong Escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công thức bán thành phẩm”. Mục tiêu của đề tài là nâng cao năng suất tổng hợp cũng như tinh sạch IL-2 dạng cải biến với chi phí thấp để có thể sản xuất sản phẩm IL-2 2 người tái tổ hợp tiêu thụ trên thị trường. Nghiên cứu này được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Dự án: “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli” Mã số KC.04.DA02/11-15, và ứng dụng kết quả thu được từ nghiên cứu và triển khai của các đề tài: (1) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.33) do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 2005-2007. (2) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.21/06-10) do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 20092010. Đề tài được thực hiện tại phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Công ty Vacxin và Sinh phẩm số 1 (Vabiotech), Bộ Y tế. 3 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh ung thư 1.1.1. Khái niệm về bệnh ung thư Ở hầu hết các mô và cơ quan của cơ thể trưởng thành, quá trình sản sinh ra các tế bào mới và quá trình tiêu diệt các tế bào già được giữ ở trạng thái cân bằng. Mỗi loại tế bào khác nhau trong cơ thể có một thời gian tồn tại nhất định, sẽ được thay thế bằng bằng các tế bào mới có cùng chức năng khi tế bào đó chết đi. Dưới các điều kiện bình thường, sự sản sinh của các tế bào mới được kiểm soát để số lượng một loại tế bào bất kỳ nào trong cơ thể là tương đối ổn định [5]. Ung thư là sự phát triển không bình thường của tế bào do sai sót của quá trình điều khiển ở mức độ phân tử xảy ra trong quá trình sống của tế bào. Tất cả các loại tế bào trong cơ thể về nguyên tắc đều có thể biến thành tế bào khối u (tumor). Các khối u này có thể là lành tính (benign) hoặc có thể biến thành ác tính (malignant). Đặc điểm của tế bào ung thư là có thể nhân lên mà không cần các chất điều hoà sinh trưởng của tế bào bình thường cần phải có và chúng không đáp ứng với các tín hiệu chết theo chương trình của tế bào bình thường (apoptosis). Đặc tính chung của các bệnh ung thư là sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào và khả năng di căn hay lan rộng đến các vùng khác nhau trên cơ thể người bệnh [4]. Hình 1. Tiêu bản nhuộm Wright-Giemsa tế bào thường và tế bào ung thư ác tính ở tủy xương [26]. 4 Sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào bình thường dần tạo nên các khối u gồm nhiều lớp tế bào chồng chất lên nhau. Nếu các tế bào khối u khu trú ở một vùng duy nhất của cơ thể, không có biểu hiện xâm lấn các mô xung quanh thì được gọi là khối u lành tính. Ngược lại nếu các tế bào khối u tách khỏi vị trí ban đầu và xâm lấn ra các mô khác của cơ thể thì được gọi là khối u ác tính. Các khối u lành tính thường khá an toàn trừ khi kích thước của chúng quá lớn dẫn đến chèn ép các cơ quan hoặc các cấu trúc sống khác. Các khối u ác tính thì ngược lại, thường gây hậu quả nghiêm trọng vì xâm lấn đến các cơ quan khác, lan ra những mô ở xa hơn và hình thành những khối u thứ cấp (di căn) gây ảnh hưởng đến chức năng bình thường của các cơ quan đó. Bảng 1. Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học U lành tính U ác tính Tế bào biệt hóa cao Tế bào ít biệt hóa Phân bào ít và chậm Phân chia nguyên phân liên tục Không xâm lấn xung quanh Xâm lấn lan rộng Không có hoại tử Thường có hoại tử trung tâm Có vỏ bọc Không có vỏ bọc Rất ít tái phát Luôn tái phát Không di căn Di căn Ít ảnh hưởng đến cơ thể Ảnh hưởng lớn đến chức năng bình thường đến cơ thể Trước kia các nhà nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện các nguyên nhân gây bệnh, vì vậy ung thư được xếp vào 3 nhóm dựa vào nguyên nhân gây bệnh như sau: (1) các virus gây ung thư, (2) các tác nhân lí hóa gây ung thư, (3) một số trường hợp ung thư mang tính di truyền như bệnh ung thư ruột do di truyền có tên là Familial Polyposis, bướu Wilms. Vào các năm 1980 – 1990, khi các kỹ thuật di truyền được sử dụng lần đầu tiên để nghiên cứu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, dù ung 5 thư có biểu hiện rất đa dạng, nguyên nhân gây bệnh cũng rất khác nhau nhưng căn nguyên của bệnh thực chất là do các sai hỏng của gene, hay nói cách khác là sự rối loạn của bộ máy di truyền [29]. Tuy vậy, thông thường phải có vài sai hỏng xảy ra đồng thời mới chuyển một tế bào bình thường sang trạng thái ung thư. Các nhà nghiên cứu đã phân loại hai nhóm gene chính khi bị đột biến trực tiếp có liên quan đến sự phát sinh các tế bào ung thư. Nhóm thứ nhất bao gồm các gene thúc đẩy quá trình phân chia tế bào một cách không kiểm soát, được gọi là các gene gây khối u (hay gene ung thư, oncogene). Các gene gây khối u điển hình nhất được tìm thấy đầu tiên ở các retrovirut. Liên quan đến những gene này là các tiền gene gây khối u (proto-oncogene) được tìm thấy ở các tế bào chủ. Các tiền gene gây khối u có thể đột biến thành các gene gây khối u. Nhóm thứ hai bao gồm các gene khi ở dạng bình thường có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào, được gọi là các gene ức chế khối u (tumor suppressor gene, còn gọi là gene kiềm chế gene ung thư). Một nhóm các gene này trực tiếp tham gia vào các cơ chế sửa chữa DNA, nên khi bị đột biến chúng lại làm tăng tần số đột biến của những gene khác, vì vậy dạng đột biến của chúng được gọi là các gene gây đột biến (mutator gene) [4]. Bảng 2. Một số gene ung thư và gene ức chế khối u liên quan đến ung thư ở người [27] Gene ung thư Bcl-2 Mã hóa cho protein bất hoạt quá trình tự chết của tế bào, liên quan đến ung thư bạch cầu. c-myc Liên quan đến ung thư vú, máu, dạ dày và phổi. L-myc Liên quan đến ung thư phổi. PDGF Mã hóa cho nhân tố sinh trưởng của tiểu cầu não, liên quan đến ung thư não. RET Liên quan đến ung thư tuyến giáp. Ki-ras Liên quan đến ung thư phổi, buồng trứng, ruột, tuyến tụy. 6 Liên quan đến ung thư máu. N-ras Gene ức chế khối u APC Liên quan đến ung thư ruột và ung thư dạ dày. DPC4 Mã hóa cho phân tử tín hiệu kích hoạt quá trình ức chế phân chia tế bào, liên quan đến ung thư tuyến tụy. Mã hóa cho protein p53, là gene điều khiển quá trình dừng phân chia và p53 kích thích tế bào bất thường tự chết. Liên quan đến rất nhiều loại ung thư. BRCA1 Liên quan đến ung thư vú và ung thư tử cung. BRCA2 Liên quan đến ung thư vú. VHL Liên quan đến ung thư thận. WT1 Liên quan đến khối u Wilm của thận. Tế bào bình thường cần có tín hiệu sinh trưởng của tế bào để vượt qua các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, một tế bào bình thường không thể tiến hành quá trình phân chia nếu không có đủ các điều kiện như đạt đến kích thước và sinh khối nhất định, tích lũy đủ chất dinh dưỡng, các quá trình nhân đôi DNA xảy ra chính xác; nếu như những sai hỏng trong quá trình sinh trưởng của tế bào quá nghiêm trọng và không thể sửa chữa được, các gene ức chế khối u sẽ khởi động quá trình cho tế bào chết theo chương trình (apoptosis) để bảo vệ tình toàn vẹn của hệ gene và duy trì số lượng tế bào ở một mức độ nhất định [36]. Ở các tế bào khối u, một mặt các gene gây khối u hoạt động quá mức bình thường, dẫn đến việc tế bào luôn luôn nhận được các tín hiệu cho phép vượt qua các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, mặt khác các gene ức chế khối u bị sai hỏng, dẫn đến quá trình apoptosis không xảy ra, các tế bào mang hệ gene sai hỏng vẫn tiếp tục tồn tại và phân chia. 7 Douglas và Robert Weinberg đã đưa ra 6 cột mốc trong quá trình phát sinh ung thư ác tính [42] là: - Các tế bào nhận được tín hiệu thúc đẩy tăng sinh tế bào (xuất hiện các gene gây ung thư). - Các tế bào ung thư trở nên không nhạy cảm với các tín hiệu ức chế. - Đột biến xảy ra ở gene ức chế khối u, dẫn đến không còn hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis), các tế bào ung thư không còn bị kiểm soát. - Các tế bào ung thư phân chia không giới hạn. - Các tế bào ung thư phát triển hệ thống mạch máu dẫn đến khối u để tăng cường chất dinh dưỡng nuôi khối u. - Các tế bào ung thư có khả năng xâm nhập vùng mô khác và hình thành ổ ung thư mới (di căn). 1.1.2. Tình hình ung thư trên thế giới và ở Việt Nam Hiện nay, bệnh ung thư được xem là một trong những bệnh nan y, đòi hỏi các nhà nghiên cứu cần nhiều nỗ lực cố gắng để tìm ra các phương pháp phòng ngừa và chữa trị hiệu quả. Đến nay trên thế giới đã nghiên cứu thành công một số loại thuốc và phương pháp chữa trị hiệu quả trong điều trị ung thư vú, ung thư máu… Tuy nhiên, với mức độ đa dạng của ung thư như hiện nay thì các nghiên cứu về ung thư cần được quan tâm hơn nữa để có thể tìm ra cách điều trị hiệu quả và phù hợp. Sự biến đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u có thể là do sự thừa hưởng về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, sự biến đổi ác tính đó là do sự đột biến từ tế bào soma. Có vô số các khả năng có thể gây ra ung thư có liên quan đến sự đột biến bao gồm như sự hoạt hóa các gene tiền ung thư (proto-oncogene), sự bất hoạt gene ức chế khối u, hay sự đột biến ở gene sửa sai DNA trở thành gene gây đột biến. Các đột biến đó có thể xảy ra trong quá trình phân chia tế bào bình thường, sự tăng bất thường của các tín hiệu kích thích phân 8 bào để biệt hóa, hoặc do các tác nhân gây ung thư ngoài môi trường. Quá trình phát triển thành khối u là sự phát triển quá mức của các tế bào ung thư và không chịu sự kiểm soát thông thường của cơ chế điều khiển quá trình biệt hoá tế bào trong cơ thể. Các tế bào ung thư mới nhân lên cũng giống với tế bào ung thư ban đầu và không thực hiện chức năng thông thường của tế bào bình thường. Theo ghi nhận của Cơ quan nghiên cứu thế giới về ung thư IARC (The International Agenecy for Research on Cancer), trong năm 2008, có hơn 12,4 triệu trường hợp mới mắc bệnh ung thư mới (trong đó 6 672 000 nam giới, 5 779 000 nữ giới), 7,6 triệu trường hợp tử vong do ung thư (4 293 000 nam giới, 3 300 000 nữ giới) và 28 triệu người bị mắc bệnh ung thư được phát hiện trong vòng 5 năm. Theo ước tính đến năm 2030, khả năng mắc ung thư mới mỗi năm khoảng 27 triệu người, 17 triệu người khác bị chết vì ung thư và 75 triệu bệnh nhân bị ung thư được phát hiện trong vòng 5 năm [7]. Số lượng bệnh nhân bị ung thư đang tăng dần tại các nước đang phát triển do tỷ lệ tử vong ở trẻ em và số người chết do các bệnh nhiễm trùng có xu hướng giảm và nhiều người có khả năng sống lâu hơn. Hơn nữa, người dân ở những nước này đang ngày càng thích ứng với lối sống của các nước phát triển như hút thuốc, uống rượu, ăn nhiều thực phẩm giàu calo và chất béo. Cũng theo cơ quan này, trong số các trường hợp mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới, các nước có thu nhập thấp và trung bình là những nơi chiếm tỷ lệ ung thư cao (chiếm 2/3 trường hợp ung thư trên toàn thế giới). Tỷ lệ dạng ung thư khác nhau cũng tùy thuộc vào mức độ thu nhập của các quốc gia, tập quán của người dân. Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh ung thư chủ yếu tập trung vào các dạng ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư ruột già, ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận, ung thư da, ung thư giáp trạng, ung thư buồng trứng… Trước đây, ở Việt Nam, mô hình bệnh tật điển hình là của một nước thu nhập thấp, kém phát triển, có đời sống chưa cao, ý thức vệ sinh thấp, vùng khí hậu nhiết đới nóng bức ẩm ướt, nên các loại bệnh chủ yếu là những bệnh truyền nhiễm và các bệnh suy dinh dưỡng. Hiện nay, cùng với sự thay đổi mạnh mẽ về kinh tế, mô hình 9 bệnh tật của Việt Nam đã có xu hướng của nước phát triển với các bệnh ung thư, tim mạch… Hơn nữa, cùng với quá trình phát triển của nền kinh tế cũng kéo theo một loạt các vấn đề nhức nhối khác, đặc biệt là vấn đề ô nhiễm môi trường, nguồn thức ăn... Việc sống trong điều kiện môi trường ô nhiễm có thể là lý do chính để lý giải tại sao tỷ lệ mắc bệnh ung thư đang có chiều hướng gia tăng nhanh chóng. Những nguyên nhân gây ung thư chính có thể kể đến là việc hút thuốc lá, sử dụng đồ uống có cồn, chế độ ăn không lành mạnh và thiếu những hoạt động thể chất [17]. Những loại ung thư phổ biến nhất người bệnh thường gặp là phổi, dạ dày, gan, đại trực tràng, vòm họng, thận, da, vú, cổ tử cung… 1.1.3. Các phương pháp điều trị ung thư Như đã đề cập ở trên, ung thư vẫn là một trong những căn bệnh nan y và gây tử vong lớn. Vì vậy, việc phát hiện và điều trị ung thư là vấn đề hết sức quan trọng và cấp thiết, đòi hỏi các nhà khoa học có rất nhiều đóng góp. Nếu không được chữa trị sớm, hầu hết các loại ung thư có thể gây tử vong, đây là một trong những nguyên nhân gây tử vong chính trong những nước phát triển. Hầu hết các bệnh ung thư có thể chữa trị và nhiều bệnh có thể chữa lành, nếu được phát hiện và điều trị sớm. Các phương pháp dùng trong điều trị ung thư có thể được chia thành 5 phương pháp như sau: phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, miễn dịch trị liệu hay còn gọi là liệu pháp miễn dịch và liệu pháp gene. Liệu pháp gene có tiềm năng cao trong việc chữa trị tận gốc nhưng hiện nay vẫn chưa được áp dụng phổ biến do tính phức tạp và đặc thù với từng loại ung thư và cần được nghiên cứu thêm. Cả ba phương pháp phẫu thuật, xạ trị và hóa trị đều nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thư, phá hủy chúng bằng thuốc hoặc các tác nhân khác. Tuy nhiên, việc điều trị ung thư bằng các phương pháp này thường gặp phải các tác dụng phụ không mong muốn và hiệu quả điều trị còn phụ thuộc vào vị trí và mức độ của khối u, giai đoạn của bệnh, cũng như tổng trạng của bệnh nhân. So với những phương pháp truyền thống như phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, thì trị liệu miễn dịch tế bào tự thân có thể được coi là một hình thức trị liệu đầy triển vọng 10 vì hiệu quả điều trị rất rõ rệt, không có tác dụng phụ, an toàn và dung nạp tốt. Liệu pháp này đã mang lại cho bệnh nhân ung thư giai đoạn trung gian và giai đoạn cuối thêm một hình thức điều trị hoàn toàn mới. Đối với những trường hợp bệnh nhân không thể phẫu thuật hay xạ trị thì liệu pháp này lại có thể liên tục tiêu diệt tế bào ung thư, tăng cường sức miễn dịch cho bệnh nhân, nâng cao hiệu quả lâm sàng, kéo dài tuổi thọ, nâng cao chất lượng sống, giảm bớt những đau đớn do căn bệnh này mang lại cho bệnh nhân. 1.2. Tổng quan về Interleukin-2 1.2.1. Cấu trúc của Interleukin-2 Interleukin-2 là một cytokine được tiết bởi tế bào lympho T của hệ thống miễn dịch. Tên thương mại của sản phẩm Interleukin-2 là Proleukin hoặc Aldesleukin. IL-2 được Morgan và các cộng sự phát hiện năm 1975 khi sử dụng lectin để kích thích tế bào T hỗ trợ nhưng đến năm 1979, IL-2 mới được xác định như là một nhân tố có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của tế bào T [47]. Interleukin-2 cũng là một trong những cytokine đầu tiên được xác định ở mức độ phân tử. Gene il-2 được deVos và các cộng sự nhân dòng năm 1983 [35], sau đó cấu trúc tinh thể của nó được làm sáng tỏ năm 1992 bởi Taniguchi và các cộng sự [54]. Về bản chất, IL-2 là một glycoprotein có cấu trúc dạng monome với khối lượng phân tử xấp xỉ 15 kDa. IL-2 tồn tại với cấu trúc không gian có 4 xoắn α tạo thành dạng khá điển hình của cytokine loại 1. Hình 2. Minh họa cấu trúc không gian 3 chiều của Interleukin-2 11 Interleukin-2 (IL-2), cũng được gọi là yếu tố tăng trưởng tế bào T, lần đầu tiên được mô tả như là một lymphokine có khả năng hoạt hóa in vitro các tế bào T [12]. IL-2 cũng đã được quan sát thấy nhiều khả năng điều chỉnh miễn dịch khác như tính chất gây độc của tế bào T, các tế bào giết tự nhiên (NK), kích hoạt tế bào B, và hoạt hóa các tế bào giết (LAK). Trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã, protein hIL-2 bị cắt đoạn trình tự tín hiệu tiết dài 20 amino acid và tạo thành hIL-2 hoàn chỉnh chứa 133 amino acid [53]. Các kết quả nghiên cứu cho thấy có 3 vùng trên phân tử hIL-2 có vai trò quyết định hoạt tính sinh học của cytokine này đó là: i) Vùng tận cùng đầu N (các gốc amino acid 1-20); ii) Vùng tận cùng đầu C (các gốc amino acid 121-133) và iii) Cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105. Nghiên cứu của Grace (1987) cho thấy các đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C có thể làm mất 99% hoạt tính của IL-2 và khả năng liên kết của chúng với các thụ thể IL-2 [43]. Phân tích trình tự amino acid cho thấy IL-2 tự nhiên của người có chứa 3 gốc Cys tại các vị trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo cầu disulfide. Việc hình thành chính xác cầu disulfide này sẽ quyết định đến hoạt tính sinh học của IL-2. Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy đột biến ở gốc Cys105 làm phá hủy cầu disulfide có thể làm giảm 8-10 lần hoạt tính của IL-2, trong khi đó sự thay thế hoặc đột biến Cys58 làm hoạt tính của IL-2 giảm tới 250 lần. Tuy nhiên sự đột biến mất gốc Cys tại vị trí 125 chỉ ảnh hưởng rất ít đến hoạt tính IL-2 và sự thay đổi gốc Cys tại vị trí đó thành Ser không ảnh hưởng tới hoạt tính của IL-2. Do vậy, đột biến thay đổi Cys ở vị trí 125 thành Ser có thể ngăn cản sự tạo thành cầu disulfide không mong muốn giữa gốc này với hai gốc Cys ở vị trí 58 và 105 [2, 3]. Ngoài ra, tại đầu N của protein IL-2 có điểm glycosyl hóa được nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên. IL-2 trong tự nhiên tồn tại dạng glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào do vậy liều lượng lớn IL-2 sẽ gây nên độc tính của protein này trong cơ thể. Vì vậy, IL-2 dạng thương phẩm dùng làm thuốc tiêm sẽ bị loại bỏ các gốc amino acid ở đầu N. 12 1.2.2. Vai trò và chức năng sinh học của Interleukin-2 Các nghiên cứu trước đây cho thấy, với việc sử dụng IL-2 trong hỗ trợ điều trị ung thư thận và ung thư hắc tố có thể làm tăng khả năng sống sót cho các bệnh nhân. Theo nghiên cứu của Rosenberg (1980) tại Viện Ung thư quốc gia (National Cancer Institute-NCI) Tây Ban Nha cho thấy, khi sử dụng IL-2 trong phác đồ điều trị cho các bệnh nhân ung thư thận ác tính với các liều lượng khác nhau có thể làm giảm tỷ lệ di căn của các khối u từ 15-20%. Ngoài ra, IL-2 còn có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư ác tính khác như ung thư bạch cầu, ung thư phổi [20],… Từ năm 1990, các nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu làm tăng hoạt động của IL-2 và sử dụng kết hợp nhiều phương pháp trị liệu khác như hóa trị liệu và xạ trị liệu, kết quả là khoảng 5-10% bệnh nhân được điều trị có thể sống sót sau 10 năm. Lúc đầu người ta phát hiện ra IL-2 như là một yếu tố phát triển tế bào T, nhưng thật ra IL-2 có nhiều chức năng trong đáp ứng miễn dịch thu được [49]. Thứ nhất, sự sản sinh IL-2 chỉ là nhất thời, vì vậy khi không có sự kích thích của kháng nguyên thì các tế bào T được hoạt hóa sẽ chết do mất đi các cytokine trong môi trường. IL-2 do tế bào T tiết ra khi nhận diện kháng nguyên chịu trách nhiệm về việc tăng sinh tế bào đặc hiệu kháng nguyên. Thứ hai, IL-2 khởi đầu một con đường chết theo chương trình đã được định sẵn cho tế bào [48]. Thứ ba, IL-2 tăng cường sự tăng sinh và hoạt hóa nhiều tiểu nhóm tế bào miễn dịch, gồm cả các tế bào T, tế bào diệt tự nhiên, tế bào B, tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính. IL-2 đơn thuần hoạt động trong một phần nhỏ của các bệnh nhân có u ác tính các tế bào da (melanocyte) di căn và đã được dùng để hỗ trợ điều trị in vitro ở bệnh nhân ung thư và nhiễm HIV. IL-2 vẫn dùng để điều trị cho bệnh nhân ung thư tế bào biểu mô thận di căn. 13