Tài liệu Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN MÔN HỌC CHUYÊN NGÀNH TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ_FISH (FLORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION) TRÊN VI SINH VẬT GVHD : Th.s NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN SVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠT MSSV : 60604096 TPHCM, tháng 6/2010 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự thành kính, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Huyền – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án này. Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu có liên quan đến đề tài. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc. http://www.ebook.edu.vn ii TÓM TẮT NỘI DUNG Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ_ FISH (fluorescence in situ hydridization) ra đời từ năm 1989 và đến nay được xem là công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là sinh thái học, môi trường học, chẩn đoán và phát sinh loài. Bằng 5 bước xử lý cơ bản: chuẩn bị mẫu và đầu dò, cố định mẫu, lai, rửa mẫu, quan sát ta có thể thu được các thông tin chính xác về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay thành phần môi trường của đối tượng nghiên cứu. Trên thế giới đã ứng dụng FISH trong nhiều lĩnh vực, trong tương lai FISH sẽ sử dụng để tăng cường hiệu quả biểu hiện của nhiều công cụ nghiên cứu khác. Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển. http://www.ebook.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii TÓM TẮT NỘI DUNG........................................................................................ iii MỤC LỤC ....................................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH VẼ ..................................................................................... vi DANH SÁCH BẢNG BIỂU ................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................... vii CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH................................ 3 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH ............................................ 5 3.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH ........................................................... 5 3.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang .................................................. 6 3.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ .................................................................. 10 3.4. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu ............................................... 11 3.5. Quan sát và xử lý tín hiệu ....................................................................... 11 CHƯƠNG 4. NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH .................... 14 4.1. Kết quả không chính xác ........................................................................ 14 4.1.1. Các chất tự phát huỳnh quang......................................................... 14 4.1.2. Đầu dò thiếu tính đặc hiệu .............................................................. 15 4.2. Kết quả âm tính ....................................................................................... 16 4.2.1. Số lượng đầu dò quá ít .................................................................... 16 4.2.2. Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích ................... 17 4.2.3. Hàm lượng rRNA thấp ................................................................... 17 http://www.ebook.edu.vn iv 4.2.4. Ảnh chụp bị mất màu...................................................................... 18 4.3. Biện pháp khắc phục............................................................................... 18 CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT FISH ........................................ 19 5.1. Sự đa dạng của vi sinh vật ...................................................................... 19 5.2. Hệ vi sinh vật trong nước thải ................................................................ 22 5.3. Vi khuẩn cộng sinh ................................................................................. 23 5.4. FISH trong y học .................................................................................... 24 5.4.1. Các quần thể vi khuẩn phức tạp ...................................................... 24 5.4.2. Phát hiện mầm bệnh trong các mô cấy và dụng cụ vô trùng ........... 29 5.4.3. Nấm ................................................................................................ 30 5.4.4. Thuốc thú y ..................................................................................... 31 5.4.5. Các mầm bệnh ở thực vật ............................................................... 31 5.4.6. Phát hiện các mầm bệnh bằng phương pháp lai không sử dụng chất huỳnh quang ................................................................................................ 32 CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA FISH................................... 33 6.1. Trên thế giới............................................................................................ 33 6.2. Tại Việt Nam .......................................................................................... 36 CHƯƠNG 7. TỔNG KẾT................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 40 http://www.ebook.edu.vn v DANH SÁCH HÌNH VẼ Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH .....................................................4 Hình 2: Các cách đánh dấu đầu dò...........................................................................7 Hình 3: Kính hiển vi quét laze đồng tiêu .........................................................................11 Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida albicans ....................................................................................................................... 12 Hình 5: Kết quả hiển thị cho quá trình lai để phát hiện các vi khuẩn Bacillus ribotype DA001 với ba chất nhuộm khác nhau trên một mẫu đất ............................................19 Hình 6: Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng ......................... 22 Hình 7: FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I .......23 DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương pháp FISH ...........................................................................................................8 http://www.ebook.edu.vn vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ISH : In Situ Hybridization FISH : Florescence In Situ Hybridization rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid DNA : Deoxyribonucleic Acid PCR : Polymerase Chain Reaction CCD : Charged Coupled Device CLSM : Confocal Laser Scanning Microscope TSA : Tyramid Signal Amplification http://www.ebook.edu.vn vii CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU Việc nhận biết sự có mặt của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên chủ yếu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy cổ điển bằng phương pháp cấy chuyền kết hợp với lựa chọn môi trường đặc hiệu gặp khó khăn trong nghiên cứu các loài vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng chậm hoặc chưa phân lập. Một nhược điểm nữa là tốn nhiều thời gian và có tính chọn lọc cao. Hơn nữa, kỹ thuật này không phản ánh được sự mối tương quan giữa đối tượng nghiên cứu với môi trường xung quanh [9]. Từ thực tế trên, nhiều kỹ thuật hiện đại ra đời như PCR, lai liên tiếp, lai trình tự, tuy nhiên vẫn không khắc phục hoàn toàn những nhược điểm kể trên của kỹ thuật nuôi cấy cổ điển. Nguyên nhân chính là để thực hiện những kỹ thuật này đòi hỏi phải có một lượng mẫu lớn, điều này nghĩa là cũng phải đi qua giai đoạn cấy chuyền mất nhiều thời gian; và quan trọng hơn là các phương pháp hiện đại này chỉ chứng minh sự có mặt của đối tượng nghiên cứu mà không cung cấp chính xác thông tin về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường sống của vi sinh vật. Kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hydridization) ra đời từ năm 1961 do hai nhóm nghiên cứu độc lập Pardue, Gall và John đề xuất đã khắc phục được tất cả các vấn đề kể trên. Tuy nhiên do tính không an toàn đối với con người, môi trường và khá phức tạp trong thao tác mà kỹ thuật ISH đã được cải tiến thành FISH. Lai huỳnh quang tại chỗ FISH (fluorescence in situ hydridization) từ khi ra đời đã trở thành một công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là sinh thái học, môi trường học, chẩn đoán và phát sinh loài. FISH là một kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào vi khuẩn. FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết môi trường nuôi cấy đặc hiệu mà còn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ về điều kiện và môi trường nuôi cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệ thống phức tạp của các quần thể vi sinh vật. FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ http://www.ebook.edu.vn 1 CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh. Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở thành công cụ nghiên cứu hữu hiệu nhất. Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong môi trường tự nhiên, nổi bật là hệ vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden [88], tại vịnh hẹp ở Na-uy [115], sinh vật phù du ở sông hoặc biển [6,52,73,82], tuyết hồ trên núi cao [155], trong đất [37] và trên bề mặt rễ thực vật [92]. FISH đặc biệt phổ biến trong y học, ngoài mục đích xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnh lây qua đường máu, ung thư…) FISH còn được sử dụng để chẩn đoán thường qui sự bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của thai nhi. Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển. Nhận thức được vai trò, tầm quan trọng và triển vọng phát triển của FISH trong nghiên cứu về thế giới vi sinh vật, tôi tiến hành đi vào tìm hiểu kỹ thuật này trong khuôn khổ bài báo cáo đồ án môn học. http://www.ebook.edu.vn 2 CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH Năm 1969 : kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hydridization) ra đời bởi hai nhóm nhà khoa học độc lập Pardue, Gall và John. Trong phương pháp này, DNA hoặc 28S-RNA có đánh dấu phóng xạ được đem lai với DNA có trong noãn bào chủng vi khuẩn Xenopus, sau đó được dò tìm bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Kỹ thuật này cho phép các chuỗi acid nucleic xâm nhập vào trong tế bào mà không làm chết tế bào, làm thay đổi đến hình thái của tế bào hay tính toàn vẹn của các bộ phận bên trong tế bào. Khi phân tích ở cấp độ đơn bào bằng phương pháp lai tại chỗ có thể cung cấp một bức tranh chi tiết hơn về vi sinh vật so với lai dot blot. Nó không chỉ xác định được hình thái tế bào của một loài vi sinh vật chưa từng được nuôi cấy mà còn phân tích được sự phân bố không gian của chúng. Xác định số lượng các tín hiệu phát ra bằng các oligonucleotide rRNA đích cho phép ước tính được tỷ lệ tăng trưởng của các tế bào riêng lẻ. Từ khi ra đời, ISH không ngừng được cải tiến nhằm nghiên cứu sự tiến hóa của nhiễm sắc thể, phân tích các nhiễm sắc thể của các khối u, tế bào ung thư bạch cầu và nghiên cứu di truyền học tế bào ở các loài. Cuối cùng vào năm 1988, Giovanoni và cộng sự đã áp dụng thành công phương pháp này trên vi khuẩn, họ là những người đầu tiên sử dụng các đầu dò oligonucleotide rRNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ để phát hiện vi khuẩn thông qua kính hiển vi. Những năm sau đó, cùng với sự phát triển của các chất dán nhãn huỳnh quang [76,109,110], kỹ thuật đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ đã dần dần được thay thế bởi thuốc nhuộm huỳnh quang. Năm 1989, DeLong lần đầu tiên sử dụng oligonucleotide được đánh dấu chất huỳnh quang để dò tìm các vi sinh vật đơn bào. So với các đầu dò phóng xạ, đầu dò huỳnh quang sử dụng an toàn hơn, ít gây hại đối với môi trường và sức khỏe con người, kết quả thu được chính xác hơn và không cần phải thực hiện bước dò tìm (vì http://www.ebook.edu.vn 3 CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU nhìn thấy trực tiếp). Hơn thế nữa, các đầu dò huỳnh quang có thể được đánh dấu với nhiều chất nhuộm, phát xạ tại những bước sóng khác nhau, vì vậy có thể dò tìm một vài trình tự đích chỉ với một lần lai. Độ nhạy, sự chính xác và thời gian tiến hành ngắn là những ưu điểm nổi trội của FISH, giúp nó ngày càng phổ biến và được áp dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học nghiên cứu về vi sinh vật. http://www.ebook.edu.vn 4 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH 3.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào). Quy trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản sau: - Chuẩn bị mẫu và đầu dò. - Cố định mẫu. - Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào. - Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai. - Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp). - Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả. Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH http://www.ebook.edu.vn 5 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang Lựa chọn đầu dò: Như đã được đề cập từ trước, các trình tự đích được sử dụng phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều và cấu trúc được bán bảo tồn. Các đầu dò oligonucleotide ứng với mỗi cấp độ phân loại, giữa các loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, cho đến các chi và loài cụ thể đều có thể thiết kế được dựa theo kích thước của rRNA đích [10,53]. Với sự tăng lên nhanh chóng của các đoạn thông tin di truyền trong các cơ sở dữ liệu chung và thương mại [93,145], đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác. Điều này đặc biệt có ý nghĩa khi tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay các sinh vật chưa từng nuôi cấy đặc hiệu. Số lượng lớn các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần sao chép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào luôn cung cấp đủ số lượng các trình tự đích để hiển thị được các dòng tế bào cụ thể, ngay cả các oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH. Việc lựa chọn vị trí trình tự đích và quá trình thiết kế đầu dò phải được tiến hành với sự thận trọng cao nhất. Gần đây, các trình tự đích khác như rRNA 23S [10,82,94,104,143], rRNA 18S [83,86,87,133] và gần đây là mRNA cũng đã được xác định thành công bởi thí nghiệm FISH. Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng xâm nhập vào trong tế bào. Một đầu dò oligonucleotide điển hình thì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tự động. Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiếp cận được với trình tự đích, nhưng chúng lại mang được ít các trình tự đánh dấu. Trong FISH, các trình tự đích thông dụng nhất là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và số lượng các bản sao nhiều. Do đó, các đầu dò được lựa chọn thường là các oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai. Các đầu dò oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đã có một số sản phẩm được thương mại hóa. Chúng có thể lưu trữ được ở -200C trong tối khoảng vài tháng. http://www.ebook.edu.vn 6 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò là cách thông dụng nhất, nhanh nhất, rẻ nhất và dễ dàng thực hiện nhất bởi vì chúng không đòi hỏi phải tiến hành các bước dò tìm sau quá trình lai. Một hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với oligonucleotide trong suốt quá trình tổng hợp thông qua liên kết amino ở đầu 5’ của đầu dò (hình 2a), hoặc sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn các nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dò (hình 2b) [100]. Ngoài ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào oligonucleotide theo một dải đệm 18 carbon thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp [31]. Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn nhãn chất huỳnh quang trên cả hai đầu, một phân tử ở đầu 3’ và 4 phân tử ở đầu 5’ được sử dụng như những miếng đệm thích hợp để ngăn chặn sự che khuất lẫn nhau của các tín hiệu huỳnh quang [133]. Trong một số trường hợp, việc dò tìm theo cách gián tiếp thì có hiệu quả hơn. Người ta thấy rằng, có thể tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH lên bằng cách kết hợp các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG), sau đó chúng sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang (Hình 2c) [162]. Độ nhạy của FISH còn có thể được tăng lên đáng kể khi sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu. Phương pháp này được phát triển bởi Kagiyama và cộng sự (1993) khi nghiên cứu về di truyền học tế bào, sau đó được Yamaguchi và cộng sự thay đổi để áp dụng vào định danh vi khuẩn (1996). Ban đầu, mỗi oligonucleotide vẫn sẽ được đánh dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dò tìm bằng một thể kháng digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzyme phosphatase kiềm. Enzyme này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thể này tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khi kết hợp với Fast Red TR. Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách thực hiện này có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotide chỉ gắn nhãn huỳnh quang duy nhất. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng http://www.ebook.edu.vn 7 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín hiệu Tyramide” (TSA) (Hình 2d). Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên khoảng 10 – 20 lần. Tuy nhiên, số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dò thông thường được đánh dấu duy nhất một chất huỳnh quang. Điều này xảy ra là do quá trình xâm nhập của các chất cao phân tử vào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường. Mặc dù enzyme lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dò vào trong tế bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương, do đó phương pháp này chủ yếu được dùng để phân tích các quần thể vi khuẩn tạp. Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d) hay đầu dò polyribonucleotide (e) (Moter et al., 2000). Độ nhạy của FISH khi áp dụng trên các mẫu tự nhiên sẽ tăng lên đáng kể khi sử dụng đầu dò polyribonucleotide được đánh dấu bằng một số phân tử huỳnh quang [30]. Có lẽ phương pháp hiệu quả nhất là kết hợp việc sử dụng các đầu dò polyribonucleotide, được đánh dấu với digoxygenin, đồng thời sử dụng hệ thống http://www.ebook.edu.vn 8 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN khuyếch đại tín hiệu tyramide (TSA). Kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công khi dò tìm và phát hiện trực quan các độc tố trong Listeria (Hình 2e) [149]. Lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang đều có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau nên cho phép phát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật khi chỉ lai một lần duy nhất. Cùng với việc quan sát trực quan bằng kính hiển vi đa màu FISH, các bộ lọc màng nhiều dải cũng có thể được sử dụng. Các chất huỳnh quang tổng hợp có những điểm phát xạ sắc nét khác nhau nên sẽ loại bỏ được hiện tượng các phổ huỳnh quang chồng lên nhau giữa các đầu dò, đồng thời hạn chế các vấn đề về màu nền và sự dây, nhem màu. Chất màu huỳnh quang có màu sáng nhất và bền quang học nhất nên sử dụng để dò tìm các trình tự đích mà lượng mẫu rất ít. Các chất nhuộm thường sử dụng cho FISH trong vi sinh vật học là fluorescein-derivates (FluoresceinIsothiocyanate (FluoX)) (FITC), và 5(6)carboxyfluorescein-N-hydroxysuccimide-ester rhodamine-derivates (Tetramethyl-Rhodamine-Isothiocyanate (TRITC), Texas Red), ngoài ra còn có các loại thuốc nhuộm cyanine khác như là Cy3 và Cy5 (Bảng 1). Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương pháp FISH Tên thuốc nhuộm Bước sóng Màu Kích thích (nm) Phát xạ (nm) AMCA 351 450 Xanh dương FITC* 492 528 Xanh lá cây FluoXE** 488 520 Xanh lá cây TRITC*** 557 576 Đỏ Texas Red 578 600 Đỏ Cy3 550 570 Cam/Đỏ Cy5 651 674 Hồng ngoại Bước sóng có thể thay đổi ít nhiều tùy thuộc vào nhà sản xuất. Quang phổ phát xạ có thể thay đổi trong các dung môi khác nhau hoặc đặc tính của mẫu. *FITC : Fluorescein–isothiocyanate http://www.ebook.edu.vn 9 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN **FluoXE : 5-(-6-)carboxyfluorescein–N-hydroxysuccimideester ***TRITC : Tetramethyl–rhodamine–isothiocyanate 3.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ Trước khi tiến hành lai, mẫu chứa vi sinh vật và các đầu dò phải được ngâm trong các hợp chất tạo tủa như ethanol hoặc methanol, hợp chất tạo được liên kết ngang như aldehyde hoặc hỗn hợp các chất trên để các đầu dò huỳnh quang có thể thấm vào bên trong tế bào và bảo vệ các rRNA không bị biến tính bởi các RNAse nội bào. Các điều kiện và phương pháp cố định mẫu có thể khác nhau tùy thuộc vào vi sinh vật đích và loại mẫu. Quá trình cố định mẫu tối ưu sẽ đưa được số lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng. Cố định đầu dò vào mẫu hiệu quả sẽ ảnh hưởng rất tích cực đến kết quả của FISH, nhưng việc cố định rất khó để có thể tối ưu hóa. Thông thường một lượng dung dịch formaldehyde hoặc paraformaldehyde 3-4% (v/v) thì phù hợp cho hầu hết các loại vi khuẩn Gram âm. Đối với các vi khuẩn Gram dương, sử dụng ethanol (50%), hỗn hợp ethanol/formalin (tỉ lệ 9:1 v/v) hoặc xử lý nhiệt là những biện pháp thông dụng nhất; ngoài ra có thể bổ sung thêm bước xử lý sơ bộ để tăng tính thấm của đầu dò. Trong một số trường hợp, như trong các tế bào Gram dương, khi xử lý bằng enzym lysozyme, lysostaphin, hoặc hỗn hợp các enzyme có thể sẽ cần thiết để tách peptidoglycan. Đối với loài Actinomycetales có chứa acid mycolic như phức hệ Mycobacterium, Norcardia hoặc Microthrix parvicella, hiệu quả khi sử dụng các kỹ thuật thẩm thấu như thủy phân bằng acid yếu HCl 1M hoặc xử lý với Mutanolysin hay 1,4 dithio-L-threitol [35,91,127] đã được kiểm định. Đối với các mẫu có tỷ lệ G + C cao, quá trình cố định mẫu và thao tác xử lý sơ bộ phụ thuộc vào giống vi sinh vật, và kỹ thuật phân tích các mẫu nhiễm tạp tự nhiên có chứa các vi khuẩn này vẫn còn gặp khó khăn [91,116]. Khi áp dụng phương pháp FISH trên mẫu chứa nhiều đoạn mô khác nhau, các quá trình tiền xử lý bắt buộc phải được áp dụng để tăng khả năng tiếp cận của các đầu dò đối với các trình tự đích tương ứng, đồng thời hạn chế được các liên kết http://www.ebook.edu.vn 10 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN không đặc hiệu. Gần đây, FISH đã được áp dụng trên các mẫu mô tế bào được ngâm trong dung dịch keo lạnh [101]. Trong các chất dẻo này, sự hiển thị của vi khuẩn và sự bảo vệ cấu trúc của mô của các tế bào rất hoàn chỉnh mà không hề có bất cứ quá trình tiền xử lý nào. 3.4. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu Trước khi tiến hành lai, các tế bào sau giai đoạn xử lý kể trên được cố định vào một mặt kính. Để quá trình gắn mẫu vào mặt kính được tốt hơn, người ta khuyên nên xử lý bề mặt kính trước bằng cách phủ lên mặt kính một lớp chất tráng kính ngoài. Các hóa chất được sử dụng cho hiệu quả tốt là gelatin [8], poly-L-lysine [80] hay các hợp chất tạo muối [101]. Quá trình lai phải được thực hiện trong những điều kiện hết sức nghiêm ngặt nhằm kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung với chúng. Đối với thao tác quan trọng nhất trong thí nghiệm FISH, quá trình làm nóng sơ bộ các phân tử lai phải được thực hiện để các đầu dò huỳnh quang kết hợp bổ sung với các trình tự RNA đích tương ứng. Sự chính xác khi bắt cặp bổ sung có thể được điều khiển bằng cách thay đổi nồng độ formamide hay nhiệt độ của quá trình. Formamide sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy của phân tử bằng cách làm suy yếu liên kết hydro, từ đó cho phép tiến hành quá trình nhuộm ở nhiệt độ thấp những vẫn đảm bảo độ chính xác cao. Quá trình lai xảy ra trong môi trường tối ẩm, nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC. Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ. Sau đó, rửa mẫu bằng nước cất để loại bỏ các đầu dò không liên kết được với trình tự đích. Cuối cùng, rửa lại với nước một lần nữa, sấy và cố định các phân tử lai, có thể bổ sung thêm các chất chống phai màu. 3.5. Quan sát và xử lý tín hiệu Để có thể quan sát được các tín hiệu huỳnh quang đa sắc trong thí nghiệm FISH, kính hiển vi thông thường sẽ được trang bị thêm một bộ lọc dải hẹp nhiều http://www.ebook.edu.vn 11 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN tần. Ngoài ra, để thu nhận và phân tích được các hình ảnh đó cần phải sử dụng một máy ảnh CCD (charged coupled device) kết hợp với phần mềm phân tích xử lý ảnh kỹ thuật số. Đây là hệ thống cảm biến chính xác nhất hiện nay và nó rất hữu dụng khi quan sát những mẫu vi sinh vật quan trọng, những nơi có cường độ tín hiệu thấp. Hệ thống này cũng đã được sử dụng để kiểm tra số lượng các tế bào vi sinh vật [83] và xác định hoạt tính các dòng tế bào đơn trong màng sinh học thông qua việc xác định hàm lượng rRNA [111]. Gần đây, phương pháp phân tích sự phân bố không gian của vi khuẩn đã được cải tiến hơn nữa khi sử dụng kính hiển vi quan sát huỳnh quang dải rộng [96]. Một loại kính hiển vi khác được sử dụng cho thí nghiệm FISH là kính hiển vi quét laze đồng tiêu (CLSM). Thông qua việc hạn chế hệ thống tín hiệu trong những khoảng hẹp của đối tượng nghiên cứu, các tín hiệu huỳnh quang bị lệch tiêu sẽ bị loại bỏ, tạo ra những hình ảnh rõ nét. Điều này rất hữu dụng cho mẫu có độ phân bố dày đặc, như các lớp bùn, màng sinh học hay đoạn mô [50,79,95,101,147,148]. Hiện nay, một số gói phần mềm được lập trình sẵn cho phép tái tạo hình ảnh ba chiều. Tuy nhiên, do nhanh chóng tẩy trắng các tín hiệu lệch tiêu, nên khi sử dụng kính hiển vi quét laze đồng tiêu thường đòi hỏi chất lượng tín hiệu huỳnh quang cao hơn. Các tín hiệu huỳnh quang trong phương pháp FISH còn có thể thu được khi sử dụng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy, đây là một kỹ thuật cho đếm, kiểm tra, và phân loại các hạt nhỏ lơ lửng trong một dòng chất lỏng. Do đó, phương pháp này không đưa ra được bất cứ thông tin về hình thái hay sự phân bố không gian của vi sinh vật, nó chỉ thực sự phát huy hết khả năng khi phân tích định lượng tự động, phân tích vi khuẩn trong dịch huyền phù hay hỗn hợp vi sinh vật phù du và nó chỉ thực hiện được khi các đối tượng vi sinh vật có tần số cao [7,131,150,152]. http://www.ebook.edu.vn 12 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN Hình 4. Kính hiển vi quét laze đồng tiêu http://www.ebook.edu.vn 13