I. ĐẶT VẤN ĐỀ 4 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1. Giới thiệu về cây Ba Kích 5 2. Giới thiệu về vi nhân giống 6 a. khái niệm 6 b. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp vi nhân giống 7 III. NỘI DUNG 7 1. Nguyên liệu 7 2. Phương pháp nghiên cứu 9 a. Tạo nguyên liệu khởi đầu 9 b. Nhân nhanh chồi invitro 10 c. Tạo rễ invitro 10 d. Đưa cây invitro ra đất 10 e. Xử lí thống kê 10 IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10 1. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi invitro 10 2. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo rễ invitro 11 a. Ảnh hưởng của NAA, IBA 11 b. Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA 12 3. Khả năng sống sót và sinh trưởng của cây invitro khi đưa ra đất 12 V. KẾT LUẬN 14 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 14
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP
TP.HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC-THỰC PHẨM
TIỂU LUẬN MÔN : CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG
CHỌN TẠO VÀ NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG
ĐỀ TÀI :
GVHD : NGUYỄN TRUNG HẬU
LHP : 1105132
LỚP : CDSH12
TP.Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2012
1
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................................... 3
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................................................... 4
I.
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................................ 4
II.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................................. 5
1.
Giới thiệu về cây Ba Kích ........................................................................................... 5
2.
Giới thiệu về vi nhân giống ......................................................................................... 6
a.
khái niệm ................................................................................................................ 6
b.
Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp vi nhân giống ...................................... 7
NỘI DUNG ................................................................................................................................ 7
III.
1.
Nguyên liệu ................................................................................................................ 7
2.
Phương pháp nghiên cứu........................................................................................... 9
a.
Tạo nguyên liệu khởi đầu........................................................................................ 9
b.
Nhân nhanh chồi invitro ........................................................................................ 10
c.
Tạo rễ invitro ......................................................................................................... 10
d.
Đưa cây invitro ra đất............................................................................................ 10
e.
Xử lí thống kê ....................................................................................................... 10
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................................ 10
IV.
1.
Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi invitro............. 10
2.
Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo rễ invitro ................... 11
a.
b.
3.
V.
VI.
Ảnh hưởng của NAA, IBA ..................................................................................... 11
Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA ...................................................................... 12
Khả năng sống sót và sinh trưởng của cây invitro khi đưa ra đất ............................. 12
KẾT LUẬN .................................................................................................................................. 14
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 14
2
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên chúng em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công
Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để sinh viên chúng em có một mội trường
học tập thật thoải mái về cơ sở hạ tầng cũng như về cơ sở vật chất. Đồng thời, chúng em cũng
xin chân thành cảm ơn Viện Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm và thư viện Trường Đại Học
Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.
Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn thầy NGUYỄN TRUNG HẬU đã tạo điều kiện
cho chúng em tìm hiểu thêm về bộ môn này, thông qua bài tiểu luận của nhóm.
3
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
LỜI MỞ ĐẦU
Chúng ta biết Việt Nam lả nước có khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho nhiều loài cây phát
triển, chúng là những cây dại mọc khắp nơi.Người dân đã biết tận dụng những loài cây này
để làm dược liệu chữa bệnh, họ đã nghiên cứu về công dung của chúng trong đó có một loài
cây gọi là Cây ba kích ( Morinda officinalis How) được sử dụng như một dược liệu quý với
nhiều tác dụng khác nhau, như: bổ thận âm, bổ thận dương, tang cường gân cốt,..Dịch chiết
cồn từ củ cây ba kích có tác dụng làm giảm huyết áp, tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng,
bổ trí não và đặc biệt là tang cường sinh lý nam. Với những chất ưu việt như vậy nên nhu cầu
khai thác từ tự nhiên và sử dụng các loại cây này làm dược liệu ngày càng gia tang, dẫn đến
tình trạng suy giảm nhanh chóng số lượng và khu vực phân bố. Vì vậy cây ba kích đã đưa
vào sách đỏ Việt Nam. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đặt ra, nhóm nghiên cứu – giảng dạy:
Môi Trường Và Tài Nguyên Sinh Học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã tiến
hành nghiên cứu nhâ giống bằng kĩ thuật in vitro. Sau một thời gian thử nghiệm, nhóm nghiên
cứu đã thử nghiệm thành công “Quy trình nhân giống in vitro ở cây ba kích” thuộc huyện
Tây Giang Quảng Nam với chất lượng cây giống tốt, sạch bệnh.
Cây ba kích được trồng thử nghiệm, đánh giá khả năng thích nghi trên điều kiện sinh
thái khác nhau. Kết quả cho thấy giống cây ba kích in vitro có khả năng sinh trưởng phát
triển nhanh, có độ dinh dưỡng thấp với hiệu quả kinh tế cao. Với những lợi ích của cây ba
kích dem lại đã cải thiện được tình hình kinh tế của người dân nghèo.
Sau đây, nhóm em sẽ trình bày rõ cho thầy và các bạn về quy trình “Nhân giống in vitro
cây ba kích”.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu ngày càng tăng. Nguồn dược liệu
con người đang sử dụng có thể đươc tổng hợp từ nhiều con đường khác nhau như tổng hợp
hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song nguồn dược liệu từ thực vật đã được con ngưởi sử dụng
từ lâu và nhu cầu ngày càng lớn. Tuy nhiên loài cây dược
liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng
bởi sự khai thác quá mức, các điều kiện ngày càng bất lợi
của môi trường tự nhiên…dẫn đến nhiều loài cây dược liệu
quý hiếm bị tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn dược liệu
bền vững cho con người.
Rễ cây ba kích đượng sử dụng làm
thuốc
4
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
Cây ba kích (Morinda officinalis How) được sử dụng rộng rãi như một loài dược liệu
quý có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương,tăng cường gân cốt, khử phong thấp. Dịch chiết
cồn từ củ cây ba kích có tác dụng làm giảm huyết áp, có tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ
năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon. Ngày nay, nhu cầu sử dụng cây này làm dược liệu
ngày càng gia tang nên nó bị khai thác kiệt quệ. Mặt khác, vùng phân bố của cây ba kích bị
tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này lâm vào tình trạng gần như bị tuyệt chủng và đưa
vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ. Nguồn cung cấp cây giống ba kích hiện nay chủ yếu
bằng phương pháp giâm cành nhưng hệ số nhân rất thấp (đạt 0,61/năm), chất lượng giống lại
không cao. Trong bài báo này, trình bày kết quả nhân nhanh giống cây Ba Kích bằng kĩ thuạt
nhân giống invitro, nhằm dáp ứng nhanh và bền vững nguồn cây giống có chất lượng tốt.
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu về cây Ba Kích
- Tên khoa học: Morinda Officinalis How
- Họ: Cà Phê – Rubiaceae
- Tên khác: cây ruột già, ba kích thiên, liên
châu ba kích, chổng phóng xì, sáy cáy (Thái), thau
tày cáy (Tày), chồi hoàng kim, chày kiang đòi
(Dao).
- Cây Ba Kích thuộc loài dây leo, than non
màu tím, có long, cành non có cạnh. Lá mọc đối,
cứng nhọn hình ngọn giáo thuôn dài 6 – 14 cm,
rộng 2,6 – 6 cm, có long dài ở mặt dưới, sau đó có
ít lông và màu trắng mốc. Hoa nhỏ, màu trắng sau
hơi vàng, 2 – 10 cánh hoa, 4 nhị mọc thành cụm ở
Hình: Cây Ba Kích
kẽ lá. Quả tròn, khi chin màu đỏ.
- Mùa hoa : tháng 5 - 6, mùa quả 7 – 10.
- Phân bố: Cây ba kích mọc ở vùng rừng thứ sinh, trung du và miền núi các tỉnh phía
bắc. Độ cao phân bố khoảng 100m so với mặt biển. Càng lên cao cây càng thưa dần, đến độ
cao khoảng 100m thì hầu như hiếm gặp. Có nhiều nhất ở các tỉnh Quảng Ninh, Phú Thọ, Hòa
Bình, Hà Giang, Lạng Sơn.
- Trồng trọt: Ba Kích ưa sáng, ưa ẩm và chịu bóng, mọc trên đất feralit đỏ vàng, có
lượng mùn ở mức trung bình, tơi xốp và hơi chua, nhiệt độ không khí trung bình năm khoảng
21-230C.
5
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
- Trồng bằng rễ, cành bánh tẻ hay gieo ươm bằng hạt.
- Vào khoảng tháng 3 – 4, khi thời tiết ấm dần, chọn những cành bánh tẻ ở cây Ba Kích
sống khỏe, chặt thành từng đoạn 20 – 30cm, mỗi đoạn có 2 – 4 mắt. Có thể đem trồng ngay
hoặc đem ra vườn ươm cho đến khi nảy mầm ra rễ mới đem trồng.
- Ba Kích trồng được ba năm thì thu hoạch, thời gian thu hoạch từ tháng 10 – 11.
- Thành phần hóa học của rễ cây ba kích chứa chất đường, nhựa, acid hữu cơ, vitamin
C, tinh dầu, anthraglycosid, phytoterol. Nhưng trong ba kích khô không chứa vitamin C.
2. Giới thiệu về vi nhân giống
a. khái niệm
Vi nhân giống cây trồng hay còn gọi là nhân giống vô tính invitro là quá trình sản xuất
một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, đoạn thân, lá….của
cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy invitro.
a) Các bước trong nhân giống invitro
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Tiến hành nhân giống invitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ. Các cây này cần sạch
bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Với việc trồng cây mẹ trong
điều kiện môi trường thích hợp và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm
giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tang khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy invitro.
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy invitro. Giai đoạn này cần đảm bảo: tỷ lệ
nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là
đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Ta khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hóa chất khử trùng để loại bỏ các vi
sinh vật bám trên bề mặt mẫu. Thường dùng các chất khủ trùng: HgCl2 0,1 xử lí trong 510 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7 xử lí trong 15-20 phút…..Và một số chất hữu cơ,
vitamin, muối khoáng…
Bước 3: Nhân nhanh
Trong giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tang nhanh số lượng chồi.
Vật liệu khởi đầu invitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất
điều tiết sinh trưởng nhómcytokinin để tái sinh từ một chồi thành nhiều chồi. Ta phải xác
định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp. Chế độ nuôi cấy thường 25-27C
6
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần
quan trọng để kích thích phân hóa chồi.
Bước 4: Tạo cây invitro hoàn chỉnh
Giai đoạn này ta kích thích hình thành rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh
sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyền vào môi trường nuôi cấy có bổ sung
chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay khi chuyển
từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không ch ứa chất điều hòa sinh
trưởng.
Bước 5: Thích ứng cây invitro ngoài điều kiện tự nhiên
Đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm
bảo các yêu cầu:
Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều
cao cây…).
Cần có thời gian huấn luyện cây con từ 1-2 tuần để thích nghi với những thay đổi về
nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh,…bằng cách đặt bình cây vào điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi.
Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như chế độ
dinh dưỡng thích hợp.
b. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp vi nhân giống
Ưu điểm:
- Hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể tương đối về mặt di truyền
- Có thể nhân giống cây trồng trên quy mô công nghiệp
- Dễ dàng tạo được cây sạch virus
- Các cây sau nhân giống invitro có xu hướng được trẻ hóa, nâng cao hiệu quả nhân
bằng các biện pháp thông thường
Hạn chế:
- Chi phí cao so với phương pháp nhân giống vô tính khác nên giá thành không cạnh
tranh
- Không phải bất cứ loài nào có thể vi nhân giống
- Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân giống invitro
III. NỘI DUNG
1. Nguyên liệu
Ta sử dụng đoạn thân 1,0 – 1,5cm có mắt lá của cây ba kích (Morinda officinalic How)
1 năm tuổi lấy từ huyện Tuyên Quang (Quảng Nam) là nguyên liệu thực nghiệm.
7
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
Thành phần môi trường dinh dưỡng
- Nước cất
- Chất hữu cơ, đường, acid amin, vitamin (B1, B6, H, PP…).
- Chất vô cơ, đa lượng như: N, P, K, Ca, Mg, S
- Vi lượng: Fe, Zn, B, N, Mn, Cu…
Thành phần muối khoáng cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog).
3 Saccharose
KI : 0,83 mg/L
0,8 Agar
CuSO4.5H2O : 0,05 mg/L
NH4NO3 : 1650 mg/L
Na2MoO4 : 0,5 mg/L
KNO3 :1900 MG/L
FeSO4.7H2O : 27,8 mg/L
KH2PO4 : 170 mg/L
Na2EDTA :37,3 mg/L
MgSO4.7H2O : 370 mg/L
MnSO4.4H2O : 22,3 mg/L
CaCl2.2H2O : 440 mg/L
ZnSO4.7H2O : 8,6 mg/L
H3PO3 : 6,2 mg/L
- Chất điều hòa sinh trưởng ta sử dụng: Auxin (IBA), NAA, cytokinin tổng hợp (KIN,
BA), HgCl2,..
Vai trò sinh lí của chất điều hòa sinh trưởng
Auxin có tác dụng điều chỉnh rất nhiều quá trình sinh trưởng của tế bào, cơ quan và
toàn cây.
Auxin kích thích mạnh lên sự dãn nở của tế bào, làm cho tế bào phình to chủ yếu theo
hướng ngang của tế bào.
Auxin điều chỉnh tính hướng quang, hướng địa,…Do sự phân bố không đồng đều của
auxin ở hai phía thân, phần khuất sáng mang điện tích dương, còn phần chiếu sáng tích điện
âm. Về nguyên tắc, auxin phân bổ về phía mang điện dương nhiều hơn và kích thíchsự sinh
trưởng ở phía khuất sáng mạnh hơn phía chiếu sáng. Kết quả làm cây uốn cong về phía chiếu
sáng…
Điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn. Ưu thế ngọn là đặc tính quan trọng của thực vật,
đó là sự sinh trưởng của chồi ngọn hoặc rễ chính sẽ ức chế sự sinh trưởng của chồi bên và rễ
phụ.
Chồi ngọn là cơ quan tổng hợp auxin với hàm lượng cao nhất. Khi vận chuyển xuống
dưới, các chồi bên bị auxin ức chế trực tiếp. Cắt chồi ngọn hàm lượng auxin giảm xuống và
các chồi bên được kích thích sinh trưởng.
8
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
Điều chỉnh sự hình thành rễ. Trong sự hình thành rễ đặc biệt là rễ bất định phát sinh từ
cơ quan dinh dưỡng thì hiệu quả của auxin rất đặc trưng. Có thể em auxin là hoocmon hình
thành rễ. vai trò của auxin trong sự hình thành rễ được chứng minh rõ rang trong nuôi cấy
mô. Nếu trong môi trường chỉ cho chất điều hòa sinh trưởng là auxin thì mô nuôi cấy chỉ xuất
hiện rễ mà thôi.
Điều chỉnh sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt
Điều chỉnh sự rụng của lá, hoa,…
Điều chỉnh sự chin của quả
Vai trò sinh lí của cytokinin tổng hợp (Benzyl adenine, kinetin)
Hiệu quả đặc trưng nhất của cytokinin là hoạt hóa sự phân chia tế bào. Hiệu quả này có
được là do nó kích thích sự tổng hợp acid nucleic, protein, và có mặt trong RNA vận chuyển.
Cytokinin là hoocmon hình thành chồi vì nó kich21 thích mạnh mẽ sự phân hóa chồi.
Chính vì vậy mà cùng với auxin, nó điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn giải phóng các chồi
bên khỏi sự ức chế tương quan của chồi ngọn. Hiệu quả này của cytokinin là đối kháng với
auxin (sự cân bằng auxin/cytokinin, nếu cytokinin/auxin >1 sẽ tạo rễ, nếu cytokinin/auxin<1
sẽ tạo chồi).
Nếu trong môi trường nuôi cấy mô, nếu chỉ co1cytokinin mà không có auxin thì chỉ
hình thành chồi.
Cytokinin là hoocmon hóa trẻ. Nó có tác dụng kìm hãm sự hóa già và kéo dài tuổi thọ.
Để tăng hệ số nhân giống người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai
đoạn tạo chồi invitro.
Cytokinin có vai trò trong việc phân hóa giới tính cái
Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ
2. Phương pháp nghiên cứu
a. Tạo nguyên liệu khởi đầu
- Xử lí vô trùng mẫu
- Đoạn thân có mắt lá được rửa dưới vòi nước chảy.
- Ngâm mẫu trong dung dịch thuốc diệt nấm 0,3 trong vòng 15 phút, sau đó khử trùng
bằng cồn 70 trong 60s, HgCl2 0,1 trong 7 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng khỏng 3 lần.
- Mẫu vô trùng dược sử dụng làm mẫu vật để tái sinh chồi invitro trên môi trường cơ
bản MS có 3 saccharose, 0,8 agar bổ sung chất kích thích sinh trưởng kinetin (0,25 mg/L)
tạo vật liệu khởi đầu
9
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
b. Nhân nhanh chồi invitro
Đoạn thân có một mắt lá dài 1cm được tách ra từ chồi của cây invitro trên môi trường
tái sinh được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có 3 saccharose, 0,8 agar có bổ sung
thêm benzyl adenine (BA) từ 2,0 – 4,0 mg/L và 0,2 mg/L indolbutyric acid (IBA) để khảo
sát nhân nhanh chồi in vitro
c. Tạo rễ invitro
Chồi invitro khoảng 2cm được tách ra từ cụm chồi trên môi trường nhân nhanh được
cấy trên môi trường cơ bản MS có 3 saccharose, 0,8 agar có bổ sung napthalenacitic acid
(NAA), IBA từ 0,1 – 0,5 mg/L hoặc tổ hợp NAA 0,25 mg/L và IBA từ 0,1 – 0,5 mg/L để
khảo sát khả năng hình thành rễ invitro.
d. Đưa cây invitro ra đất
Cây invitro sinh trưởng trên môi trường tối ưu 30 – 45 ngày tuổi được chuyển ra nhà
lưới trồng trên các loại cơ chất: đất cát pha : trấu (1:1) và trấu hun. Phun nước giữ ẩm 2
lần/ngày. Sau 30 ngày và 45 ngày, đánh khả năng sống sót và sinh trưởng.
Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi khử trùng trong nồi
hấp vô trùng ở 121C, 15 phút. Điều kiện nuôi cấy invitro, nhiệt độ 25±2C, cường độ chiếu
sáng 2000 lux thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày.
e. Xử lí thống kê
Mỗi thí nghiệm bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được xử lí thống kê theo Ducan
test (p<0,05) bằng chương trình SAS.
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi
invitro
Kết quả ở bảng 1 cho ta thấy, trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2 mg/L IBA và
BA từ 2,0 – 4,0 mg/L đều kích thích phát sinh chồi invitro. Nồng độ IBA là 0,2 mg/L và BA
tăng dần từ 2,0 – 3,5 mg/L thì số chồi invitro cũng tăng theo. Số chồi đạt cao nhất là 15,00
chồi/mẫu trên môi trường có 3,5 mg/L BA và 0,2 mg/L IBA sau 60 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên
khi tăng nồng độ BA lên 4,0 mg/L thì ức chế sự phát sinh chồi invitro chỉ đạt 10,15 chồi/mẫu.
Nghiên cứu của Ning – Zhen Huang và cs (2007) cho thấy nuôi cấy chồi đỉnh ở cây Ba Kích
invitro thì hệ số nhân chồi cao nhất chỉ đạt là 6,0 khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung
0,2 mg/L IBA và 1,0 mg/L BA sau 60 ngày. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, môi
trường MS có bổ sung 0,2 mg/L IBA và 3,5 mg/L BA rất thích hợp cho việc hình thành chồi
invitro ở cây ba kích.
10
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
Bảng 1. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi invitro
chất KTST (mg/L)
Số
chồi/mẫu
Chiều cao chồi
(cm)
BA
IBA
2,0
0,2
5,00c
1,95b
2,5
0,2
12,67b
2,19a
3,0
0,2
11,33b
1,95b
3,5
0,2
15,00a
1,97b
4,0
0,2
10,15b
1,83c
Chú thích: các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05
2. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo rễ
invitro
a. Ảnh hưởng của NAA, IBA
Kết quả ở bảng 2 cho thấy, nhìn chung IBA kích thích sự hình thành rễ invitro mạnh
hơn NAA ở các nồng độ từ 0,1 – 0,5 mg/L thể hiện qua thời gian cảm ứng hình thành rễ và
tỉ lệ mẫu hình thành rễ. Môi trường MS có bổ sung NAA từ 0,1 – 0,5 mg/L đều không kích
thích khả năng tạo rễ invitro sau 30 ngày cấy, sau 45 ngày nuôi cấy mới hình thành rễ và đạt
cao nhất là 46,67. Trong khi đó trên môi trường MS có bổ sung IBA từ 0,1 – 0,5 mg/L thì
sự hình thành rễ chỉ sau 30 ngày đạt 100 tỉ lệ mẫu ra rễ ở nồng độ IBA là 0,2 – 0,25 mg/L.
Tuy nhiên, khi tăng nồng độ cả NAA và IBA lên đến 0,5 mg/L thì ức chế hình thành rễ
invitro.
Bảng 2. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng tạo rễ nvitro
Chất KTST (mg/L)
Số chồi ra rễ (%)
Sau 30
Sau 45
NAA
IBA
0,10
-
0,00c
33,33e
0,20
-
0,00c
40,00bc
0,25
-
0,00c
46,67bc
0,50
-
0,00c
13,33de
-
0,10
0,00c
60,00b
-
0,20
100,00a
100,00a
-
0,25
100,00a
100,00a
ngày
11
ngày
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
-
13,33b
0,50
53,33d
Chú thích : Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05
b. Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3 cho thấy, bổ sung NAA 0,25 mg/L và IBA 0,1 – 0,5 mg/L
đều kích thích ra rễ invitro. Sau 30 ngày nuôi cấy, tỉ lệ mẫu ra rễ cao nhất đạt 80 trên môi
trường MS có bổ sung 0,25 mg/L NAA và 0,1 mg/L IBA và thấp nhất là 26,67 trên môi
trường MS có bổ sung tổ hợp 0,25 mg/L NAA và 0,5 mg/L IBA. Sau 45 ngày cấy, tỉ lệ mẫu
ra rễ đều tăng ở các tổ hợp môi trường và đạt cao nhất là 100 trên môi trường MS có bổ
sung 0,25 mg/L NAA và 0,1 mg/L IBA và thấp nhất là 33,33 trên môi trường MS có bổ
sung tổ hợp 0,25 mg/L NAA và 0,5 mg/L IBA . Khi nồng độ IBA lớn hơn 0,1 mg/L thì khả
năng hình thành rễ invitro giảm dần. Nhìn chung môi trường nuôi cấy có bổ sung tổ hợp
NAA và IBA thì hiệu quả ra rễ kém hơn nhiều so với môi trường chỉ có IBA.
Bảng 3. Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và IBA đến khả năng tạo rễ invitro
Chất KTST (mg/L)
Số chồi ra rễ (%)
Sau 30
IBA
NAA
0,10
0,25
80,00a
100,00a
0,20
0,25
53,33b
60,00b
0,25
0,25
33.33c
46,67c
0,50
0,25
26,67cd
33,33cd
ngày
Sau 45 ngày
Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê p<0,05
3. Khả năng sống sót và sinh trưởng của cây invitro khi đưa ra đất
Kết quả ở bảng 4 cho thấy, nhìn chung tỉ lệ sống sót ngoài tự nhiên của cây invitro 30
ngày tuổi thấp hơn cây invitro 45 ngày tuồi. Đối với cây invitro (cả 30 và 45 ngày tuổi), cơ
chất dất cát pha là thích hợp nhất cho sự sống sót của chúng ( tỉ lệ sống sót cao nhất đạt từ
97,9 – 98,90). Trong khi đó, các loại cơ chất như đất : trấu và tro trấu thì không thích hợp
cho sinh trưởng cây invitro. Khả năng cây invitro sống trên hai loại cơ chất này thấp hơn
nhiều so với cơ chất là đất cát pha (khả năng sống sót đạt từ 72,70 – 90,01).
Bảng 4. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sống sót của cây invitro ngoài tự nhiên
Tỉ lệ sống sót (%)
12
Đề tài: Vi nhân giống
Cây invitro
30 ngày
tuổi
45 ngày
tuổi
Nhóm : 1
Đất cát
Đất - Trấu
pha
(1:1)
Trấu hun
97,90±3,18
81,80±4,10
72,70±2,11
98,90±2,18
90,01±3,15
80,90±1.32
Cây invitro 30 ngày tuổi được đem ra trồng trọt tự nhiên trên 3 loại cơ chất đất cát pha,
trấu-đất (1:1), tro trấu. Đánh giá sự sinh trưởng chiều cao của cây sau 30 và 45 ngày trồng.
Kết quả trình bày ở bảng 5 cho thấy, cây sinh trưởng tốt trên 2 loại cơ chất là đất cát pha và
trấu-đất (1:1), sinh trưởng tốt nhất trên cơ chất đất cát pha ( đạt 9,9cm sau 30 ngày và 15,4cm
sau 45 ngày trồng ). Cây invitro sinh trưởng chậm trên cơ chất trấu hun chiều cao của cây chỉ
đạt 6,88cm sau 30 ngày và 7,98cm sau 45 ngày trồng.
Bảng 5. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sinh trưởng của cây invitro (30 ngày tuổi)
ngoài tự nhiên
Tỉ lệ sống sót (%)
Thời gian trồng
(ngày)
0
30
45
Đất cát
Đất - Trấu
(1:1)
pha
6,04±0,40
9,90±1,08
15,14±1,10
13
Trấu hun
6,25±0,42
6,18±0,44
9,80±1,40
6,88±0,32
11,50±0,61
7,98±0,34
Đề tài: Vi nhân giống
Nhóm : 1
V. KẾT LUẬN
- Môi trường cơ bản MS có 3 saccharose, 0,8 agar bổ sung 3,5 mg/L BA và 0,2
mg/L IBA thích hợp cho nhân nhanh chồi invitro cây Ba Kích đạt 15,00 chồi/mẫu sau 60
ngày nuôi cấy.
- Môi trường cơ bản MS có 3 saccharose, 0,8 agar bổ sung IBA từ 0,2 – 0,25 mg/L
thích hợp cho tạo rễ invitro cây Ba Kích, 100 số chồi tạo rễ sau 30 ngày nuôi cấy.
- Cây invitro 30 ngày tuổi có khả năng sống sót cao đạt 97,9 và sinh trưởng tốt ( chiều
cao đạt 15,14 cm ) sau 45 ngày trồng trên cơ chất đất cát pha.
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG – SỐ 5(40)2010
SÁCH SINH LÍ HỌC THỰC VẬT – VŨ VĂN VỤ, VŨ THANH TÂM
CÁC TÀI LIỆU KHÁC TRÊN INTERNET.
14
- Xem thêm -