Tài liệu Tiểu luận môn sinh học phân tử chọn lọc và phân tích gen tái tổ hợp

ĐỀ TÀI: CHỌN LỌC VÀ PHÂN TÍCH GEN TÁI TỔ HỢP GVHD: Ths. Trần Huỳnh Bảo Quyên TS. Trần Hoàng Dũng TÓM TẮT CHƯƠNG - Định nghĩa thuật ngữ “selection” và “screening” trong phân tích tạo dòng gen. - Các kỹ thuật chọn lọc các sản phẩm tạo dòng mang DNA mong muốn. - Sử dụng cơ chất có khả năng tạo màu trong các kỹ thuật sàng lọc. - Chọn lọc dựa vào lai acid nucleic. - Sử dụng PCR trong các phương pháp chọn lọc. TÓM TẮT CHƯƠNG • Sàng lọc theo cơ chế kháng thể - kháng nguyên (protein). • Phân tích các đoạn DNA được tạo dòng dựa vào các phương pháp lai với mRNA. • Kỹ thuật thẩm thấu - Southern, Northern, and Western blots. • Giải trình tự DNA. Giới thiệu • Sự thành công trong bất kì thí nghiệm tạo dòng nào đều phụ thuộc vào việc nhận dạng được trình tự gen mong muốn trong số nhiều sản phẩm tái tổ hợp khác. • Chương này giới thiệu một số phương pháp và kỹ thuật được sử dụng để phát hiện các đoạn gen được tạo dòng. Giới thiệu • Vd: sử dụng một vài loại cơ chế chọn lọc (khả năng kháng kháng sinh hay khả năng tạo β-galactosidase) hay sàng lọc trong một nhóm quần thể đã được tạo dòng bằng các mẫu dò đặc hiệu. Giới thiệu • “Selection” (chọn lọc) là gì? - Là tạo loại áp lực nào đó ( vd: sự có mặt của kháng sinh) lên quá trình phát triển của tế bào chủ mang DNA tái tổ hợp. - Tế bào sẽ tồn tại nhờ vào các đặc tính mong muốn khi tạo dòng. Giới thiệu • “Screening” (sàng lọc)? - Là một qui trình mà trong đó một quần thể tế bào độc lập được phân tích để nhận biết được trình tự mong muốn. - Bởi vì chỉ một phần nhỏ trong quần thể tế bào được phân tích mang trình tự DNA mong muốn nên đòi hỏi các phương pháp này phải thật chính xác và đặc hiệu. 8.1. Chọn lọc gen và các phương pháp sàng lọc. 8.1.1. Sử dụng cơ chất có khả năng tạo màu. Nguyên tắc: • Cơ chất: hợp chất X-gal (5-bromo-4-chloro-3indolyl-D-galactopyranoside). Đặc tính: không màu và là cơ chất của β-galactosidase • Chất cảm ứng: IPTG (iso-propylthiogalactoside) là một chất tương tự lactose. 8.1.1. Sử dụng cơ chất có khả năng tạo màu. • Ưu điểm của IPTG: đóng vai trò là chất cảm ứng chứ không phải là cơ chất của βgalactosidase. • Khi X-gal bị phân cắt sẽ tạo ra một sản phẩm có màu xanh từ đó sẽ dễ dàng biết được sự biểu hiện của gen lacZ (β-galactosidase). 8.1.1 Sử dụng hợp chất X-gal • Hình 8.1 8.1.1 Sử dụng hợp chất X-gal • Kết quả 8.1.2 Trình tự DNA gắn vào làm bất hoạt gen. • Một trình tự DNA khi gắn xen vào vị trí một gen thì gen sẽ bị bất hoạt. • Phương pháp này gồm: - Khả năng kháng kháng sinh: khi mà các đoạn DNA được đưa vào một vùng giới hạn nằm trong một gen kháng kháng sinh. Vd: đưa DNA vào vùng PstI của pBR322 (nằm trong gen Ap) làm gián đoạn trình tự mã hóa của gen và làm nó không biểu hiện. 8.1.2 Trình tự DNA gắn vào làm bất hoạt gen. Do đó, trên môi trường chứa ampicillin, tế bào chủ mang sản phẩm tái tổ hợp sẽ không phát triển. - Hệ thống X-gal: chèn đoạn DNA vào gen chức năng β-galactosidase. Do đó, các tế bào mang gen tái tố hợp sẽ không biểu hiện tính trạng tạo β-galactosidase. Như vậy các khuẩn lạc sẽ không màu. 8.1.2 Trình tự DNA gắn vào làm bất hoạt gen. - Hình thái của các plague (một dạng khuẩn lạc của virus): phương pháp sàng lọc này dùng để nhận dạng các vector λ như λgt10, mang gen cI . Gen này mã hóa cho chất kìm hãm cI, thành phần chính của lysogen. Các plague mang gen cI sẽ có vẫn đục nhẹ vì một số tế bào sống sót có thể hình thành được lysogen. 8.1.2 Trình tự DNA gắn vào làm bất hoạt gen. • Nếu gen cI bị bất hoạt thì các plague sẽ không có vẫn đục và sẽ khó có thể phân biệt với các mẫu đối chứng. 8.1.3. • Yêu cầu của phương pháp: - Các đột biến trong quá trình chọn lọc phải xuất hiện. - Môi trường chọn lọc thích hợp. • Quá trình chọn lọc sử dụng với tế bào thực vật bậc cao và động vật. 8.1.4. Các phương pháp chọn lọc khác. • Các phương pháp này dựa trên sự kết hợp giữa tế bào chủ và vector đặc hiệu để co thể khai thác được các đặc tính của gen. Vd: phương pháp chọn lọc Spi, vector EMBL4. 8.2. Sàng lọc sử dụng lai acid nucleic 8.2.1 Mẫu dò DNA: • Nguồn DNA tái tổ hợp thường được tạo thành từ việc gắn giữa những đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau vào trong vector tách dòng. • Nguồn DNA tái tổ hợp phụ thụộc vào mức độ tương đồng giữa các trình tự lai. • Mục đích sử dụng cho việc tạo ra mẫu dò từ nguồn DNA. 8.2.1 Mẫu dò AND • Có 3 loại mẫu dò DNA chính là: cDNA , DNA, Oligonucleotic và ARN.