Tài liệu Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của hạt cần tây (Apium graveolens L.)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ---------- NGUYỄN HÙNG MẠNH TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HẠT CẦN TÂY (Apium graveolens L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ---------- BỘ Y TẾ LỜI CẢM ƠN MẠNH NGUYỄN HÙNG Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè. TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo mà tôi vô cùng kính trọng TS.Nguyễn Thu Hằng (Bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược HÓA HỌC CỦA HẠT CẦN TÂY Hà Nội), người thầy đã luôn ở bên dìu dắt, động viên và khích lệ tôi trong (Apium graveolens L.) suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Cô đã chỉ dạy cho tôi nhiều điều, truyền cho tôi niềm đam mê với công việc và tình yêu với cây cỏ. Tôi cũng xinKHÓA gửi lời cảm ơn chân tới các DƯỢC thầy cô và LUẬN TỐTthành NGHIỆP SĨcác anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại bộ môn. Đồng thời, tôi muốn gửi lời cámNgười ơn tớihướng nhữngdẫn: người thân yêu trong gia TS. Nguyễn Thu Hằng đình, bạn bè. Những người đã luôn Nơi ở bên cạnh giúp đỡ, cổ vũ và động viên thực hiện: Bộ môn Dược liệu tôi. Trường Đại học Dược Hà Nội Trong phạm vi hạn chế của khóa luận, những kết quả thu được mới chỉ là bước đầu và trong quá trình làm việc khó tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô giáo và các bạn bè. HÀ NỘI - 2013 Hà Nội tháng 05 năm 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo mà tôi vô cùng kính trọng TS.Nguyễn Thu Hằng (Bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược Hà Nội), người thầy đã luôn ở bên dìu dắt, động viên và khích lệ tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Cô đã chỉ dạy cho tôi nhiều điều, truyền cho tôi niềm đam mê với công việc và tình yêu với cây cỏ. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại bộ môn. Đồng thời, tôi muốn gửi lời cám ơn tới những người thân yêu trong gia đình, bạn bè. Những người đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ, cổ vũ và động viên tôi. Trong phạm vi hạn chế của khóa luận, những kết quả thu được mới chỉ là bước đầu và trong quá trình làm việc khó tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô giáo và các bạn bè. Hà Nội tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Hùng Mạnh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU – CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1.Về thực vật ................................................................................................. 3 1.1.1. Tên gọi .............................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Apium graveolens L. .............. 3 1.2. Thành phần hóa học của hạt Cần tây .................................................... 4 1.2.1. Tinh dầu ........................................................................................... 4 1.2.2. Flavonoid.......................................................................................... 6 1.2.3. Coumarin.......................................................................................... 8 1.2.4. Một số chất khác ............................................................................ 12 1.3. Tác dụng sinh học của hạt Cần tây ...................................................... 13 1.3.1. Tác dụng hạ huyết áp .................................................................... 13 1.3.2. Tác dụng chống viêm ..................................................................... 13 1.3.3. Tác dụng hạ acid uric huyết thanh ............................................... 14 1.3.4. Tác dụng giải độc ........................................................................... 14 1.3.5. Tác dụng chống ung thư ............................................................... 15 1.3.6. Tác dụng kháng khuẩn.................................................................. 15 1.4. Công dụng ............................................................................................... 15 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ......................................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................... 16 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ ...................................................................... 16 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ........................................................................ 16 2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 18 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 20 3.1. Nghiên cứu thành phần tinh dầu hạt Cần tây ..................................... 20 3.1.1. Định lượng tinh dầu trong hạt Cần tây ........................................ 20 3.1.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu hạt Cần tây bằng phương pháp GC/MS ............................................................................... 20 3.2. Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ hạt Cần tây........................... 26 3.3. Phân lập chất từ phân đoạn dịch chiết n-hexan của hạt Cần tây...... 29 3.3.1. Sắc ký cột hấp phụ ......................................................................... 29 3.3.2. Sắc ký chế hóa phân đoạn 2 (PĐ 2) .............................................. 33 3.4. Bàn luận .................................................................................................. 37 KẾT LUẬN .................................................................................................... 39 ĐỀ XUẤT ....................................................................................................... 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU – CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3nB 3-n-butylphthalid SKLM Sắc ký lớp mỏng AST Ánh sáng thường UV Ultra violet Spectroscopy DANH MỤC CÁC BẢNG TÊN BẢNG TRANG Bảng 1.1: Thành phần hóa học của tinh dầu hạt Cần tây 4 Bảng 1.2: Các flavonoid có trong hạt Cần tây 6 Bảng 1.3: Các Coumarin trong hạt Cần tây 8 Bảng 1.4: Một số hợp chất khác trong hạt cây Cần tây 12 Bảng 3.1: Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu hạt Cần tây bằng GC/MS. 23 DANH MỤC CÁC HÌNH TÊN HÌNH TRANG Hình 2.1: Ảnh chụp cây Cần tây tại thực địa 17 Hình 2.2: Ảnh chụp hạt Cần tây 17 Hình 2.3: Sơ đồ bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến 18 Hình 3.1: Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ hạt Cần tây Hình 3.2: Ảnh chụp sắc ký đồ chất M1 ở 3 hệ dung môi Hình 3.3: Ảnh chụp tinh thể M1 dưới kính hiển vi 26 31 32 Hình 3.4: Ảnh chụp sắc ký đồ của M2 với 3 hệ dung môi 35 Hình 3.5: Ảnh chụp sắc ký đồ của M3 với hệ IV 35 Hình 3.6: Tóm tắt quy trình phân lập chất từ phân đoạn nhexan hạt Cần tây 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày càng phát triển, cuộc sống của con người ngày càng sung túc, đầy đủ. Đi kèm theo đó là sự phát triển ngày càng gia tăng của một số bệnh liên quan đến chuyển hóa như béo phì, gút, cao huyết áp, xơ vữa động mạch, rối loạn chuyển hóa lipid… Chế độ sinh hoạt không hợp lý cùng với việc sử dụng quá nhiều đồ ăn nhanh, giàu chất béo, lười vận động là nguyên nhân trực tiếp gây ra tình trạng trên. Từ xa xưa, con người đã biết khai thác và sử dụng nhiều loài thảo dược để chữa bệnh. Cây Cần tây thuộc họ Cần (Apiaceae), có nguồn gốc từ châu Âu, được du nhập vào Việt Nam và được trồng rộng rãi ở nhiều nơi. Tại Việt Nam, Cần tây từ lâu đã được sử dụng làm rau ăn, gia vị và làm thuốc. Cần tây có mặt trong nhiều bài thuốc dân gian (chữa thống phong, cao huyết áp, phong thấp…). Một số kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng cây Cần tây có tác dụng tốt trong điều trị các bệnh liên quan đến chuyển hoá như các bệnh về khớp (viêm khớp, gút), cao huyết áp [29], rối loạn chuyển hóa lipid, xơ vữa động mạch [38]…Bên cạnh đó, dịch chiết từ hạt Cần tây còn có tác dụng bảo vệ tế bào gan trước các tác nhân gây hại như Acrylamid, giúp chống lại sự hình thành các khối u ở chuột thí nghiệm [17]. Nhận thức rõ vai trò và ứng dụng của Cần tây trong y học, một số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của hạt Cần tây đã được thực hiện nhưng chưa đầy đủ. Vì vậy, việc tiếp tục nghiên cứu để xác định những thành phần hóa học mới có hoạt tính sinh học từ cây Cần tây là cần thiết. Với mục tiêu nghiên cứu về thành phần hóa học của hạt Cần tây, chúng tôi tiến hành đề tài “Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của hạt Cần tây (Apium graveolens L.)” với những nội dung sau: 1. Nghiên cứu thành phần tinh dầu hạt Cần tây. 2. Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ hạt Cần tây. 2 3. Phân lập chất từ phân đoạn dịch chiết n-hexan hạt Cần tây và sơ bộ nhận dạng các chất phân lập được. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1.Về thực vật 1.1.1. Tên gọi - Tên khoa học của cây Cần tây: Apium graveolens L., họ Cần (Apiaceae) - Tên đồng nghĩa: Apium dulce Mill, Apium graveolens subsp. dulce (Mill.) Schübl. & G. Martens. - Tên tiếng Anh: Celery. 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Apium graveolens L. Cây thảo, cao từ 15-150cm, có mùi thơm mạnh. Lá ở gốc có hình thuôn hay hình trứng ngược, kích thước lá 7-18cm x 3.5-8cm, lá xẻ ba hay chia ba thùy, thùy cuối cùng có dạng hình thoi, kích thước 1.2-2.5cm x 0.82.5cm, có khía tai bèo hay có răng cưa. Các lá phía trên có cuống ngắn, phiến lá hình tam giác thường xẻ 3, thùy cuối cùng có hình trứng ngược. Cụm hoa tán thường mọc đối diện với lá, kích thước 1.5-4cm theo chiều ngang, cuống hoa thường mập và ngắn, dài 4-15mm ít khi bị teo đi. Các cánh hoa bao bọc phía ngoài của cụm hoa có 3-8(-16) cánh hoa mảnh, kích thước 0.5-2.5cm. Các tán hoa có 7-25 hoa, hoa có kích thước 6-9mm theo chiều ngang. Cuống quả dài 1-1.5mm, quả có kích thước 1.3-1.5 x 1-2mm. Ra hoa và ra quả từ tháng 4 đến tháng 7 [19]. Loài Apium graveolens L. có nguồn gốc từ châu Á và châu Âu, được du nhập và trồng rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới. Từ thời cổ đại, cây đã được trồng và sử dụng như một loại rau ăn và là một vị thuốc phổ biến trong nhiều nền y học cổ truyền. [19] Ở Việt Nam, loài A.graveolens L. thường gọi là cây Cần tây. Cây mới di nhập vào nước ta và được trồng rộng rãi ở nhiều nơi để làm rau ăn, làm thuốc chữa cao huyết áp [8]. 4 1.2. Thành phần hóa học của hạt Cần tây 1.2.1. Tinh dầu Hạt Cần tây chứa 2-3% tinh dầu [13], trong đó có d-limonen (60%); selinen (10%); các phthalid; santalol; α và β-eudesmol; hydrocarvon. Các phthalid gồm 3-n-butyl phthalid; sedanenolid; sedanolid; anhydrid sedanonic [13]. Thành phần hóa học của tinh dầu hạt Cần tây được tổng kết ở bảng 1.1. Bảng 1.1: Thành phần hóa học của tinh dầu hạt Cần tây Ký hiệu chất Tên chất Hàm lượng (%) (nếu có) Tác dụng sinh học (nếu có) Tài liệu trích dẫn Chống ung thư Giảm chứng trào ngược dạ dày thực quản Tan sỏi mật có chứa cholesterol [13] [50] (1) Limonen 60 (2) D-carvon 1.86 [33] (3) L-carvon 0.33 [6] (4) Hydrocarvon (5) α -Selinen 1.63 [33] (6) β -Selinen 19.53 [33] (7) γ -Selinen 0.17 [6] (8) n-amylbenzen 1.63 [33] (9) Nerolidol 2.29 [33] (10) Senkiunolid-J [13] Chống viêm [26] 5 (11) Senkiunolid-N Chống viêm [26] (11) β-elemen 0.26 [6] (12) β-Pinen 1.22 [33] (13) β-myrcen 1.3 [33] Hạ huyết áp. Chống viêm. Làm giảm khả năng gây ung thư của Benzo α- (15) 3-n-Butyl phthalid 6.92 pyren ở chuột thí nghiệm. [17] [28] [33] [40] Làm giảm độc tính của Acrylamid. (16) Cis-limonen oxid 1.12 [33] (17) Santalol [13] (18) eudesmol [13] (19) β-humulen [9] (20) Linalol 0.15 [6] (21) Sedanenolid [13] Chống viêm Làm giảm khả năng gây (22) Sedanolid ung thư của Benzo αpyren ở chuột thí [26] [40] nghiệm. (23) Anhydrid sedanonic [13] 6 Nhận xét: Cho đến nay đã phát hiện 23 chất có trong thành phần tinh dầu hạt Cần tây. Trong số đó, thành phần chính là d-limonen (60%), selinen (10%). 1.2.2. Flavonoid Các flavonoid trong hạt Cần tây được tổng kết ở bảng 1.2. Bảng 1.2: Các flavonoid có trong hạt Cần tây Ký hiệu chất Tên chất Công thức cấu tạo Tác dụng sinh học (nếu có) Tài liệu trích dẫn Hạ huyết áp. Chống (24) Apigenin kết tập [18] [21] [39] tiểu cầu invitro. (25) Apiin (Apigenin 7-O-apiosyl glucosid) (26) Luteolin Chống viêm. [24] [25] [39] 7 (27) Luteolin-7O-glucosid [24] (28) Luteolin-7O-apiosyl glucosid [24] (29) Luteolin-3methylether7-apiosyl glycosid [13] (30) Chrysoerinol -7-Oglucosid [24] 8 (31) Chrysoerinol -7-O-apiosyl glucosid [24] Nhận xét: Từ bảng 1.2 cho thấy có 8 flavonoid được công bố có trong hạt Cần tây, chủ yếu là dẫn chất của Apigenin và Luteolin. 1.2.3. Coumarin Các Coumarin trong hạt Cần tây được tổng kết ở bảng 1.3. Bảng 1.3: Các Coumarin trong hạt Cần tây Ký hiệu chất Tên chất Công thức cấu tạo Tài liệu trích dẫn (32) Apiumetin [47] (33) Apiumosid [13] 9 (34) Celereoin [13] (35) Celereosid [13] (36) Isoimperatorin [16] Umbelliferon (37) (7-hydroxy coumarin) [46] (38) Nodakenin [13] (39) Psoralen [13] 10 Xanthotoxin (40) (8-methoxy psoralen) [13] Bergapten (41) (5-methoxy psoralen) [7] 8-hydroxy(42) 5-methoxy psoralen [46] Isopimpinellin (43) (5,8-dimethoxy psoralen) [13] 4,5,8-trimethyl psoralen [13] (44) 11 (45) Rutaretin [47] (46) Seselin [48] (47) Osthenol [48] (48) Apigravin [48] Nhận xét: Có 17 coumarin được công bố có trong hạt Cần tây, chủ yếu là các furanocoumarin. 12 1.2.4. Một số chất khác Bảng 1.4: Một số hợp chất khác trong hạt cây Cần tây Nhóm chất Glycosid Triglycerid Benzodioxole Phytosterol Amid Ký hiệu chất Tên chất Tài liệu trích dẫn (49) Citrosid A Citrosid B (50) Leonurisid A (51) Syringin (52) [1,3-di(cis)-9-octadecenoyl]-2[(cis,cis)-9,12-octadecadienoyl] glycerol [27] (53) Acid myristicic (3-methoxy-4,5methylenedioxybenzoic acid ). [46] (54) Taraxasterol [5] (55) Squalene (56) Campesterol (57) Spinosterol (58) Stigmasterol (59) β-Sitosterol (60) β-Amyrin (61) N-[2-(4-hydroxyphenyl) etyl] tetracosanamit [49] [44] [5] Nhận xét chung: Cho đến nay đã phát hiện khoảng 61 chất có trong hạt Cần tây, chủ yếu thuộc các nhóm tinh dầu, flavonoid, coumarin. Trong đó có 13 hai nhóm chất rất được quan tâm nghiên cứu và được coi là hoạt chất chính của hạt Cần tây là tinh dầu và flavonoid. 1.3. Tác dụng sinh học của hạt Cần tây 1.3.1. Tác dụng hạ huyết áp Tác dụng hạ huyết áp của hạt Cần tây (A. graveolens L.) là do 3-nbutylphthalid (3nB) - một thành phần có trong tinh dầu hạt Cần tây gây nên. Cơ chế tác dụng của (3nB) tương tự như một thuốc lợi tiểu và giãn mạch, nó tác động lên sự tổng hợp Prostagladin làm giảm thể tích tuần hoàn và gây giãn mạch dẫn đến hạ huyết áp. Ngoài ra nó còn tác động như một thuốc chẹn kênh Ca++ làm cho các tế bào cơ được nghỉ ngơi và làm giảm nguy cơ co thắt động mạch. Bên cạnh đó, 3nB còn có tác dụng hạ cholesterol máu, làm giảm nguy cơ hình thành các mảng vữa xơ động mạch, làm tăng tính đàn hồi của các mạch máu, giảm sức cản ngoại vi và giảm huyết áp [29]. Tiêm phúc mạc 13 ngày 3nB với liều 2.0 và 4.0mg/ngày cho thấy hiệu quả hạ huyết áp đáng kể trong khi liều 0.5mg/ngày cho hiệu quả giảm huyết áp đáng kể chỉ vào ngày thứ 12 [37]. 1.3.2. Tác dụng chống viêm Dịch chiết ether dầu hỏa, dịch chiết methanol từ hạt Cần tây có tác dụng chống viêm. Nghiên cứu được thực hiện trên 4 lô chuột, mỗi lô gồm 6 chuột cống trắng trọng lượng 150 + 6,049 g. 3 lô được tiêm màng bụng kali oxonat liều 250 mg/kg. Một giờ sau, trong 3 lô đã tiêm kali oxanat, 1 lô được uống dịch chiết ete dầu hỏa từ hạt Cần tây liều 500 mg/kg, 1 lô được uống dịch chiết methanol từ hạt Cần tây liều 500 mg/kg. Sau 3h và 6h, lấy máu từ tĩnh mạch mắt chuột để xác định tốc độ lắng hồng cầu (ESR), nồng độ nitric oxid (chất trung gian gây viêm) [44]. Kết quả: Lô uống dịch chiết ete dầu hỏa, nồng độ nitric oxid giảm 19% sau 3h, giảm 29% sau 6h so với lô chứng, chỉ số ESR giảm 40% sau 3h, giảm