Tài liệu Thực trạng lây nhiễm lao ở bệnh viện lao và bệnh phổi thái bình, một số giải pháp can thiệp

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG - BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ THU DUNG THỰC TRẠNG LÂY NHIỄM LAO Ở BỆNH VIỆN LAO VÀ BỆNH PHỔI THÁI BÌNH, MỘT SỐ GIẢI PHÁP CAN THIỆP LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC - CHUYÊN NGÀNH: Y TẾ CÔNG CỘNG - MÃ SỐ: 62.72.03.01 - Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. VŨ TÂN TRÀO 2. TS. NGUYỄN VĂN HƯNG NĂM, 2012 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao là một bệnh nhiều người mắc, tỷ lệ tử vong cao và có tính chất dễ lây lan trong cộng đồng [02]. Tiếp xúc trực tiếp với người bệnh là nguy cơ lây nhiễm bệnh cao nhất [25], [38]. Bệnh Lao được xếp vào một trong các bệnh lây truyền theo đường thở cho nhân viên y tế [42], [129]. Nguy cơ bị nhiễm khuẩn liên quan đến nghề nghiệp là một phần không thể tránh khỏi trong công tác tiếp xúc và chăm sóc bệnh nhân hàng ngày. Trong giai đoạn 1985 đến 1991, một số nghiên cứu tại Đan mạch, Ý và Thụy sỹ đã chỉ ra các nguy cơ nhiễm lao của nhân viên y tế [37], [98], [57]. Ở Mỹ, tình hình nhiễm lao ở các nhân viên y tế đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu [44], [110],[128] . Kết quả điều tra trong một số bệnh viện cho thấy từ 18 đến 35% các nhân viên y tế có phản ứng Mantoux chuyển từ âm tính sang dương tính [103], [34], [63]. Cho tới năm 1995, ít nhất có 17 nhân viên y tế (trong đó có 8 người nhiễm HIV) mắc lao do các chủng lao đa kháng thuốc và 5 (4 nhiễm HIV) đã chết [126]. Tham khảo kết quả khám sức khỏe định kỳ của nhân viên y tế Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình năm 1998, có 58/65 người (89,2%) cho kết quả phản ứng Mantoux dương tính. Một số nhân viên y tế của bệnh viện có tiền sử điều trị bệnh lao. Cơ quan An toàn và Sức khỏe nghề nghiệp của Mỹ (OSHA Occupational Safety Health Administration) công nhận bệnh lao là một trong những bệnh liên quan đến nghề nghiệp [39]. Ở Việt Nam, bệnh lao được xếp vào nhóm các bệnh nhiễm khuẩn nghề nghiệp nằm trong danh mục 25 bệnh nghề nghiệp được bảo hiểm [9]. 2 Những năm gần đây, vấn đề kiểm soát lây nhiễm đã được Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) ưu tiên quan tâm như một cấu phần cơ bản trong kiểm soát bệnh lao nhất là lao đa kháng và siêu kháng thuốc, trong đó có vấn đề kiểm soát và phòng ngừa lây nhiễm lao cho nhân viên y tế [05]. Kiểm soát lây nhiễm trong bệnh viện là vấn đề ưu tiên hiện nay của Chương trình Chống lao Quốc gia. Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu cụ thể nào về vấn đề ô nhiễm vi khuẩn lao và nguy cơ lây nhiễm lao của nhân viên y tế làm việc trong môi trường Bệnh viện Lao và Bệnh phổi tại Việt Nam. Đề tài luận án “Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp ” có các mục tiêu sau: 1. Xác định thực trạng nhiễm lao của nhân viên y tế tại Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình và cộng đồng dân cư xung quanh bệnh viện trước can thiệp (năm 2002). 2. Mô tả kết quả xét nghiệm vi khuẩn lao tại một số vị trí trong Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình trước can thiệp (năm 2002). 3. Đánh giá hiệu quả của một số biện pháp can thiệp kiểm soát lây nhiễm lao trong môi trường Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình (năm 2006 và 2011). 3 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH BỆNH LAO HIỆN NAY 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới Bệnh lao là một trong những bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trên thế giới [131]. Theo số liệu ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), hiện nay trên thế giới có khoảng 1/3 dân số (2,2 tỷ người) đã nhiễm lao và con số đó sẽ tăng 1% hàng năm [07] . Theo báo cáo năm 2010 của TCYTTG [133], ước tính năm 2009 có thêm khoảng 9,4 triệu người mắc lao mới (137/100.000 dân). Trong đó có khoảng 3,3 triệu phụ nữ (chiếm 35%) và số người mắc lao/HIV là 1,1 triệu (chiếm 12%), số mắc lao/ HIV tập trung phần lớn ở Châu Phi (80%). Số liệu cụ thể tại các khu vực được tổng hợp như sau: Bảng 1.1: Ước tính số mới mắc và tử vong do lao trên thế giới năm 2009 [133]. Số mới mắc trong Số chết trong năm năm Khu vực Số lượng Tỷ lệ (1) Số lượng (2) Tỷ lệ (1) Đông Nam Á 3.300.000 185 480.000 27 Tây TBD 1.900.000 105 240.000 13 Châu Phi 2.800.000 339 430.000 52 Trung Cận Đông 660.000 110 99.000 17 Châu Mỹ 270.000 29 20.000 2 Châu Âu 420.000 47 62.000 7 9.400.000 137 1.300.000 19 Chung toàn cầu (1) Tỷ lệ trên 100.000 dân (2) Không bao gồm các trường hợp lao/HIV dương tính 4 Phần lớn bệnh nhân lao tập trung ở Châu Á (55%) và Châu Phi (30%), Khu vực Trung Cận Đông, Châu Âu và Châu Mỹ là những khu vực có tỷ lệ bệnh nhân lao thấp (7%, 4% và 3%) [133]. 81% số bệnh nhân lao nằm ở 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu. Năm nước có số lượng bệnh nhân lao cao nhất là Ấn Độ (2.000.000), Trung Quốc (1.300.000), Nam Phi (490.000), Nigeria (460.000) và Indonesia (430.000). 35% số bệnh nhân lao tập trung ở Ấn Độ và Trung Quốc. Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông-Nam Á [133]. Tổ chức Y tế Thế giới cũng ước tính năm trong 2008 có khoảng 440.000 bệnh nhân lao kháng thuốc, trong đó 86% thuộc 27 nước có gánh nặng bệnh nhân lao kháng thuốc cao (bao gồm 15 nước Châu Âu). Bốn nước ước tính có số lượng bệnh nhân lao kháng thuốc cao nhất là Trung Quốc, Ấn Độ, Liên bang Nga và Nam Phi [133]. Đến tháng 7.2010 đã có 58 nước và vùng lãnh thổ báo cáo phát hiện trường hợp lao kháng thuốc [133]. Năm 2009, TCYTTG ước tính có 1,7 triệu người tử vong do lao, trong đó có 400 nghìn bệnh nhân lao/HIV và 380 nghìn phụ nữ. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 86%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 63% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, cũng theo ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao [133]. 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao. Theo báo cáo của TCYTTG năm 2010, TCYTTG ước tính Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu [133]. 5 Một số số liệu chính về tình hình bệnh lao ở Việt Nam được thể hiện ở bảng sau: Bảng 1.2: Một vài số liệu về tình hình bệnh lao ở Việt Nam hiện nay Dân số (2009) Phân thứ tự gánh nặng bệnh lao toàn cầu Tỷ lệ tử vong do lao (loại trừ HIV)/100.000 dân 88.000 12 36 (21 – 56) Tỷ lệ lao hiện mắc các thể / 100.000 dân 333 (143 – 577) Tỷ lệ lao mới mắc các thể / 100.000 dân 200 (150 – 256) Tỷ lệ lao / HIV dương tính mới mắc 8,4 (5,3 – 12) Tỷ lệ phát hiện, các thể (%) 54 (42 – 72) Tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân mới (%) 2,7 (2 – 4) Tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong BN điều trị lại (%) 19 (15 – 25) % bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV 37% % HIV dương tính trong số bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV 17% Theo ước tính của TCYTTG, tỷ lệ tử vong do lao là 36/100.000 dân, tương đương với khoảng 32.000 người tử vong do lao. Tỷ lệ lao hiện mắc các thể là 333/100.000 dân, tương đương với khoảng 290.000 bệnh nhân. Tỷ lệ lao mới mắc các thể hàng năm là 200/100.000 dân, tương đương với khoảng 180.000 bệnh nhân. Tuy nhiên, ước tính tỷ lệ phát hiện bệnh lao các thể của Việt Nam mới chỉ đạt 54% (45-72). Năm 2009, có 34.907 bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV, chiếm tỷ lệ 37% tổng số bệnh nhân lao. Tỷ lệ HIV dương tính trong số bệnh nhân lao xét nghiệm là 17%, cao hơn so với tỷ lệ nhiễm HIV ước tính trong số bệnh nhân lao tại báo cáo năm 2009 của TCYTTG (8,1%). Đồng nhiễm lao/HIV không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao, mà còn làm giảm hiệu quả điều trị của CTCLQG và tăng tỷ lệ tử vong do lao.[133], [10]. 6 Tỷ lệ lao kháng đa thuốc là 2,7% trong số bệnh nhân lao mới và 19% trong số bệnh nhân điều trị lại. Theo ước tính của CTCLQG, năm 2009 có khoảng 3.952 (95% CI: 2.944 – 5226) bệnh nhân lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhân lao phổi được khám phát hiện. Trong đó, mới chỉ có 307 bệnh nhân lao kháng đa thuốc được điều trị. Theo kết quả điều tra tình hình nhiễm và mắc lao toàn quốc năm 2006-2007, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở Việt Nam là 1,67; tỷ lệ mắc lao phổi AFB dương tính các thể ở Việt Nam là 145/100.000 dân và tỷ lệ hiện mắc lao phổi AFB dương tính mới là 114/100.000 dân. Như vậy, còn một số lượng lớn bệnh nhân lao phổi AFB dương tính trong cộng đồng vẫn chưa được phát hiện và Chương trình chống lao cần có sự nỗ lực hơn nữa trong công tác phát hiện, quản lý để hạn chế nguồn lây và giảm dịch tễ bệnh lao trong cộng đồng. 1.1.3. Tình hình bệnh lao tại tỉnh Thái Bình. Bảng 1.3: Tình hình phát hiện bệnh nhân lao các thể tỉnh Thái Bình từ năm 2007 - 2011: Năm 2007 2008 2009 2010 9th 2011 AFB (+) Mới AFB (+) TP AFB (+) TB ĐT lại* AFB (-) Ng. Phổi AFB(-) &NgPh khác AFB (+) khác Tổng cộng 883 834 779 653 543 85 73 97 78 79 04 02 04 05 04 490 551 520 464 370 312 345 349 266 255 0 0 06 07 08 0 0 01 0 01 1774 1805 1756 1473 1260 Tỷ lệ phát hiện bệnh nhân lao các thể và lao phổi dương tính mới có xu hướng giảm, năm 2007, tỷ lệ bệnh nhân lao phổi AFB(+)/100.000 dân là 48,4; năm 2010 tỷ lệ này là 34,7. 7 Bệnh viện Lao và Bệnh phổi của tỉnh xây dựng từ năm 1975 tại xã Vũ Chính là 1 xã ngoại thị (cách trung tâm thành phố 3-4 km) gồm 120 giường có nhiệm vụ phát hiện và điều trị bệnh nhân lao chung của toàn tỉnh. Trung bình 1 năm bệnh viện khám 15.000 lượt người và tiếp nhận điều trị 800 bệnh nhân lao chủ yếu là bệnh nhân lao phổi dương tính mới và tái phát. Bảng 1.4: Số bệnh nhân lao phổi AFB dương tính và số tiêu bản đờm xét nghiệm tại bệnh viện từ năm 1998 – 2011 Năm 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 9th 2011 Tiêu bản XN dương tính 621 681 612 739 602 517 565 721 901 739 759 847 713 645 Tiêu bản XN âm tính 7607 7340 7533 17245 8443 8736 9019 10504 10406 12925 13008 12836 12393 9862 Số BN lao phổi dương tính 349 338 299 340 280 239 264 325 404 348 328 376 306 294 1.2. VI KHUẨN LAO VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN 1.2.1. Vi khuẩn lao [20], [23], [59], [70].[151], [07] Hình thể: Vi khuẩn lao hình que mảnh, không di động, có độ dài từ 3 đến 5 μm và đường kính từ 0,3 đến 0,5μm, hơi cong, hai đầu tròn. Trong bệnh phẩm đứng riêng biệt hoặc thành đám nhỏ đôi khi xoắn thừng hoặc thành dây [02]. Đặc tính sinh hóa: 8 Hoạt độ Catalaza ở 220C = (+++) Hoạt độ Catalaza khi đun nóng 700C trong 15 phút = 0 Hoạt độ Peroxydaza ở 220C = (+++) Hoạt độ Peroxydaza khi đun nóng 700C trong 15 phút = 0 Thạch cận Lebek: trực khuẩn hoàn toàn ưa khí, mọc trên bề mặt Test Niacin hoặc test Kono = (+++) Test khử Nitrat = (+++) Thành phần hóa học và cấu trúc cơ bản Thành phần hóa học: gồm nước chiếm 85,9% trọng lượng các chất đạm, đường, mỡ và chất khoáng. Chất đạm (protid) gồm các tuberculoprotein khác nhau (chiếm 56% trọng lượng khô của vi khuẩn). Các tuberculoprotein được cấu tạo từ các acid amin và là cơ sở của các kháng nguyên của vi khuẩn lao, khi đưa vào cơ thể động vật sẽ gây ra hiện tượng phản vệ. Chất đường (glucid) chiếm khoảng 15% trọng lượng khô của vi khuẩn. Phần lớn chúng ở dưới dạng Polysarcharid, hoặc liên kết với các protein hoặc phophat. Các Polysarcharid không độc, ít có tính kháng nguyên, không gây hiện tượng mẫn cảm, nhưng có hoạt tính trong các phản ứng huyết thanh như tăng cường phản ứng liên kết. Chất mỡ (lipid) chiếm 10 đến 40% trọng lượng khô của vi khuẩn, chúng tan trong cồn, ether và chloroform. Các chất lipid của vi khuẩn: mycozit C, cord-factor và các chất sáp được nghiên cứu nhiều. Theo nhiều tác giả, các lipid này của vi khuẩn có liên quan đến độc tính và khả năng gây bệnh của chúng. Cấu trúc hóa học cơ bản của vi khuẩn lao gồm: Vỏ của vi khuẩn lao dầy từ 10-20 nm, gồm có 4 lớp khác nhau: Lớp 1: Peptido-glycane 9 Lớp 2 và 3: Mycolate arabino galactane Lớp 4: glycolipide với 3 chất: sáp D, yếu tố thừng và micoside Vỏ của vi khuẩn lao chi phối 3 đặc tính của vi khuẩn lao: khả năng gây bệnh, tạo ra tính mẫn cảm, tạo ra tính kháng cồn, kháng toan. Cấu trúc vỏ tế bào của vi khuẩn lao tạo ra các tính chất nhuộm. Khi nhuộm Gram,vi khuẩn bắt mầu của vi khuẩn Gram dương. Cấu trúc mycolic acid tạo ra khả năng kháng lại các chất tẩy aniline là cồn acid. Tính chất nuôi cấy và khả năng đề kháng: Vi khuẩn lao hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích nghi 37oC, pH thích nghi 6,7 - 7.Vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường đặc Loeweinstein - Jensen, Ogawa Mark, môi trường lỏng Sauton. Ở môi trường Loeweinstein- Jensen khuẩn lạc xuất hiện khoảng sau một tháng, khô nhăn nheo giống như hoa súp lơ, màu trắng ngà. Ở môi trường lỏng Sauton vi khuẩn mọc nhiều ở bề mặt chất lỏng thành những mảng nhăn nheo, khô và dính vào thành ống. Vi khuẩn lao phát triển chậm, thời gian nhân đôi là 12-24 giờ trong khi của E.coli là 20 phút. Những chủng độc lực tạo thành những khuẩn lạc R. Những chủng độc lực kém tạo thành những khuẩn lạc ít nhăn nheo hơn và phát triển ít có trật tự hơn. Khả năng gây bệnh Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể. Sự bền vững của vi khuẩn lao với môi trường bên ngoài [02]. Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng. Trong phòng thí nghiệm người ta có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm. Dưới ánh nắng mặt trời, vi khuẩn bị chết sau 1,5 giờ. Khi chiếu tia cực tím chúng chỉ tồn tại được 2-3 phút. Ở 420C vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở 800C. 10 Đờm của bệnh nhân lao trong phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn tồn tại và giữ được độc lực; nhưng khi đun sôi đờm trong 5 phút chúng đã bị chết. Với cồn 900 vi khuẩn lao tồn tại được 3 phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chết ngay sau 1 phút. Đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao[25], [70]. Vi khuẩn lao trong quá trình sinh sản có thể xuất hiện những loại đột biến kháng thuốc. Những vi khuẩn lao kháng thuốc này là loại kháng thuốc trong nhiễm sắc thể. Cơ chế là do chọn lọc tự nhiên, có thể từ một quần thể vi khuẩn đa số chịu thuốc trở thành một quần thể vi khuẩn kháng thuốc hoàn toàn kháng một hoặc nhiều loại thuốc. Các chủng vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc với một loại thuốc chống lao nào được gọi là “Chủng hoang dại”. Một chủng kháng thuốc tự nhiên là một chủng hoang dại kháng với một thuốc mà vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc. Như vậy, cả vi khuẩn kháng thuốc tự nhiên và bệnh nhân có vi khuẩn này đều chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc chống lao. Kháng thuốc tự nhiên xảy ra ở những nơi thuốc chống lao chưa bao giờ được sử dụng. Nguyên nhân của kháng thuốc tự nhiên là do đột biến gien. Tần xuất những đột biến kháng thuốc tự nhiên phụ thuộc vào nguồn gốc của chủng, loại thuốc, nồng độ thuốc và tổng số vi khuẩn. Số lượng vi khuẩn giảm sẽ giảm đột biến kháng thuốc. 1.2.2. Một số phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao. 1.2.2.1. Các phương pháp cổ điển Soi trực tiếp Nhuộm Ziehl – Neelsen và soi kính cho đến nay vẫn là một phương pháp đơn giản, rẻ tiền và cho kết quả nhanh. Tuy nhiên, soi kính chỉ cho phép phát hiện được trực khuẩn lao ở nồng độ 105 trực khuẩn/ml trở lên, vì vậy độ nhậy của phương pháp thấp, từ 40% - 60% (bệnh phẩm của bệnh nhân lao 11 người lớn) và chỉ đạt từ 10% - 20% (bệnh phẩm của bệnh nhân lao ngoài phổi). [25], [69], [83]. Soi kính không cho phép định danh vi khuẩn lao ở mức độ loài, chỉ xác định được hình thể, không phân biệt được vi khuẩn sống hay chết và không có hiệu quả trong việc xác định vi khuẩn lao kháng thuốc. Hơn nữa, kết quả soi kính cần phải được khẳng định bằng nuôi cấy và các thử nghiệm chẩn đoán xác định khi có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn lao thuộc nhóm không điển hình hoặc khi cần xác định độ nhạy cảm đối với kháng sinh điều trị [83], [97]. Tuy nhiên soi kính là phương pháp duy nhất để xác định nguồn lây chính: những người có ho khạc ra nhiều vi khuẩn lao có kết quả soi AFB(+) Nuôi cấy. Là những phương pháp phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy in vitro. Hiện nay có rất nhiều loại môi trường để nuôi cấy vi khuẩn lao, được chia làm hai loại: môi trường đặc và môi trường lỏng. Cho đến nay, nuôi cấy trên môi trường đặc vẫn là một phương pháp kinh điển được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng [119]. Môi trường rắn có thể là môi trường trứng (Egg-Base Medium) LoeweinsteinJensen, American Trudeau Society (AST) hoặc môi trường agar (Agar-Base Medium) như Middlebrook 7H10 và Middlebrook 7H11. 1.2.2.2. Một số kỹ thuật hiện đại. Sử dụng Hệ Bactec Nguyên lý: Người ta gắn cacbon phóng xạ vào acid palmitric và acid formic trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn lao. Khi vi khuẩn chuyển hoá sẽ lấy các acid béo này và giải phóng ra CO2 (chứa cacbon phóng xạ) được đo bằng máy Bactec 460 [30], [02]. 12 Hệ thống đo phóng xạ BATEC ra đời cho phép phát hiện sớm quá trình mọc của vi khuẩn trên môi trường bằng việc tự động phát hiện lượng 14 CO2 do vi khuẩn giải phóng ra trong quá trình trao đổi chất và carboxi hoá cơ chất có đánh dấu phóng xạ 14C. Kỹ thuật này có ưu điểm là cho kết quả nhanh (5 - 7 ngày) và cũng phát hiện được chủng vi khuẩn kháng thuốc. [30], [02]. Phương pháp MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tubes) Người ta sử dụng biện pháp đặc biệt để kích thích vi khuẩn lao sinh sản nhanh, vi khuẩn lao khi phát triển sẽ sử dụng oxy (O2) và thải CO2. Bằng bộ phận nhận cảm có phát quang có thể nhận biết được CO2 (chuyển môi trường từ màu xanh lục sang màu vàng). Phương pháp này cũng cho kết quả nhanh trong vòng từ 3-10 ngày [02]. Nguyên lý: Một phức hợp huỳnh quang được gắn ở đáy týp nuôi cấy. Phức hợp này nhậy cảm với sự có mặt của O2 hoà tan trong môi trường. Đầu tiên, do lượng O2 hoà tan lớn nên kìm chế sự phát quang từ phức hợp, khi đó chỉ một lượng nhỏ ánh sáng huỳnh quang có thể được phát hiện. Sau đó, khi có mặt vi khuẩn trong môi trường, do hoạt động của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất, đã tiêu thụ bớt O2 dẫn đến việc phát sáng của chất huỳnh quang, phát hiện được ở bước sóng 365 nm. Sự phát triển của vi khuẩn cũng có thể được phát hiện bởi sự xuất hiện độ đục không đồng nhất hoặc những hạt nhỏ hay mảnh vụn trong môi trường nuôi cấy [25],[20]. Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) Một phát minh quan trọng của sinh học phân tử trong những năm gần đây là kỹ thuật khuyếch đại acid nucleic (ADN và ARN). Kỹ thuật hiện nay được sử dụng ở nhiều nước là phản ứng chuỗi polymeraza (PCR). Ra đời vào năm 1986, kỹ thuật PCR đã nhanh chóng cung cấp những ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực công nghệ sinh, y học [81]. Việc áp dụng PCR trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, đặc biệt là bệnh lao đã cung cấp một công cụ 13 đầy triển vọng, đáp ứng với nhu cầu cấp thiết, đã cho ra đời một phương pháp chẩn đoán nhanh, hiệu quả và an toàn khi mà đa số các phương pháp chẩn đoán bệnh lao cổ điển đều còn nhiều bất cập. Kỹ thuật PCR cho phép xác định vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên gienom của vi khuẩn [81], [84], [86]. Cũng giống như phương pháp soi kính, phương pháp PCR có thể cho kết quả nhanh trong vòng 1 ngày nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu lại cao hơn nhiều. Trong một số nghiên cứu khi nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng, độ nhạy của PCR đạt tới 71% đến 91%, độ đặc hiệu từ 95% - 100% [83]. Cho tới nay hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới khi sử dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán bệnh lao đều phát hiện các thường quy riêng. Đoạn khuôn mẫu được sử dụng nhiều nhất là đoạn trình tự acid nucleic nằm trên gien nhảy IS 6110. IS 6110 chỉ có mặt trong nhóm Mycobacterium tuberculosis và các Mycobacteria khác thuộc nhóm M.complex và thường có độ lặp lại cao trong hệ gien của vi khuẩn lao do vậy là một trình tự lý tưởng để đóng vai trò đoạn ADN đích. Sự phân biệt giữa M. tuberculosis và M. Bovis cũng có thể bằng đoạn IS 6110 vì M. Bovis chỉ có một đoạn IS 6110 [123]. Người ta cũng sử dụng nhiều trình tự khác nhau như IS 986, P36 (đây là các gien nhảy có đặc điểm tương tự như IS 6110), rARN 16S, các gien mã hoá cho protein 65 kD và 38 Kd [82]. Ngoài ra sự khác nhau về trình tự acid nucleic đích, phương pháp tách chiết ADN, số chu kỳ nhân gien và các phương pháp phát hiện sản phẩm sao chép của PCR cũng khác nhau ở mỗi phòng thí nghiệm. Kỹ thuật điện di trên gel agarose hoặc lai ghép với các đoạn mồi đặc hiệu có đánh dấu phóng xạ là các kỹ thuật phổ biến để phát hiện sản phẩm sao chép, tuy nhiên một số tác giả cũng đã sử dụng các đoạn mồi đánh dấu với chất không phóng xạ [82]. Bên cạnh những ưu điểm, kỹ thuật PCR cũng có những mặt hạn chế: 14 - Do phân tử ADN có thể được phát hiện ngay cả khi vi khuẩn đã bị chết nên kỹ thuật PCR không cho biết vi khuẩn lao còn sống hay đã chết mà điều này rất cần thiết cho việc theo dõi kết quả điều trị. - Có thể có dương tính giả, âm tính giả. Chống nhiễm: Do PCR có độ nhạy cao, khả năng dương tính giả có thể xảy ra nếu trong quá trình thực hiện, bệnh phẩm hoặc vật liệu sử dụng bị nhiễm một lượng nhỏ ADN vi khuẩn lao có trong môi trường, hoặc từ các bệnh phẩm có chứa vi khuẩn, hoặc bị nhiễm các đoạn ADN là sản phẩm sao chép của những lần chạy PCR trước. Sản phẩm sao chép của PCR có thể trở thành một mối đe doạ nếu không có biện pháp xử lý hiệu quả. Một ống phản ứng sau 40 chu kỳ nhân gien có thể chứa tới 1012 bản sao, và chỉ cần một bản sao lọt vào ống mới cũng đủ để phản ứng cho kết quả dương tính giả đối với ống đó [84]. Tuy nhiên ngày nay người ta đã có thể loại bỏ khả năng dương tính giả do nhiễm các đoạn ADN bản sao bằng việc sử dụng ezyme uracil DNA glycosylase (UNG) kết hợp với dUTP thay vì dTTP trong hỗn dịch phản ứng. UNG được hoạt hoá ở 400C trước khi phản ứng xảy ra phá huỷ toàn bộ các bản sao nếu do sơ xuất bị nhiễm vào hỗn dịch phản ứng. UNG phá huỷ các bản sao bằng cách cắt tại các vị trí Uraxin trên trình tự phân tử của nó vì vậy chỉ loại bỏ các bản sao do chúng có chứa Uraxin trong khi trình tự ADN đích tách chiết từ vi khuẩn thì vẫn được bảo vệ. UNG sẽ bị bất hoạt ở nhiệt độ cao hơn khi quá trình nhân gien xảy ra vì vậy không ảnh hưởng đến sản phẩm của phản ứng [87]. Ngoài ra để chống nhiễm chéo, các nguyên tắc ngặt nghèo về vô trùng phải được tuân thủ trong suốt quá trình thực hiện. Phòng thí nghiệm phải được sắp xếp sao cho các bước thực hiện kỹ thuật được tiến hành trong các khu vực riêng biệt, dụng cụ, hoá chất phải tuyệt đối vô khuẩn. 15 Chất ức chế PCR: Bên cạnh dương tính giả, PCR cũng có thể cho âm tính giả khi có sự can thiệp của các chất ức chế hoặc kìm hãm phản ứng. Các chất này thường là một trong những thành phần có trong bệnh phẩm có khả năng ức chế hoặc làm giảm hoạt tính enzyme ADN polymeraza, khiến cho phản ứng khuyếch đại gien xảy ra hoặc không xảy ra [82]. Tỷ lệ chất ức chế phản ứng PCR trong một số nghiên cứu dao động từ 3% đến 52% đối với bệnh phẩm đường hô hấp [86]. Người ta đã tìm cách phát hiện sự có mặt của chất ức chế bằng cách khuyếch đại ADN tách chiết từ mỗi bệnh phẩm trong 2 ống phản ứng trong đó một lượng nhỏ ADN của vi khuẩn lao được thêm vào một ống. Kết quả âm tính của ống này sẽ cho phép khẳng định sự có mặt của chất ức chế trong bệnh phẩm. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi số ống phản ứng tăng lên đáng kể khi làm với một số lượng mẫu lớn. Để khắc phục người ta sử dụng ADN của M. smegmatis thay thế cho ADN của M. tuberculosis. Do trình tự nhận biết trên IS 6110 của M. smegmatis nhưng bị sửa đổi bằng cách thêm vào 56 đôi bazơ. Sản phẩm PCR được nhân từ trình tự trên M. smegmatis sẽ được phân biệt với sản phẩm nhân từ trình tự trên vi khuẩn lao nhờ sự khác nhau về độ dài phân tử của chúng. M. smegmatis có thể được sử dụng như một nội chứng ngay trong bệnh phẩm. Một lượng xác định vi khuẩn M. smegmatis được cho vào trong bệnh phẩm trước khi tiến hành xử lý mẫu và tách chiết ADN sẽ kiểm tra được hiệu quả tách chiết ADN đồng thời đánh giá được sự có mặt của chất ức chế nếu có trong bệnh phẩm và định lượng một cách tương đối vi khuẩn vi khuẩn lao có trong bệnh phẩm [82]. Các kỹ thuật tách chiết ADN từ bệnh phẩm ít nhiều đều đã cố gắng để loại bỏ các chất ức chế. Tuy vậy khi so sánh phương pháp của Boom và cộng sự với 16 phương pháp truyền thống dùng phenol để xử lý các bệnh phẩm có chất ức chế PCR, kết quả nghiên cứu của A.Kolk cho thấy phương pháp của Boom sử dụng đơn giản và hiệu quả hơn do cùng một lúc vừa tách chiết, vừa tinh sạch được ADN lại không sử dụng phenol [82]. Phát hiện vi khuẩn lao sống bằng phương pháp RT – PCR, ELISA Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta đã chứng minh được rằng sự có mặt của ARN chính là một dấu hiệu để đánh giá mức độ sống của vi khuẩn. Chỉ những vi khuẩn còn sống mới được phát hiện bằng cách sử dụng mARN làm khuôn trong phản ứng RT – PCR (Reverse transcriptase PCR). Hầu hết các phân tử mARN đều rất dễ bị phân huỷ và có vòng đời ngắn. Do vậy sự có mặt của mARN thường biểu thị quá trình sao chép liên tục của gien. Patel và các cộng sự đã sử dụng phản ứng RT – PCR để xác định khả năng sống sót của M. leprae bị giết bằng nhiệt và ông đã phát hiện dnaK mARN chỉ tồn tại trong các tế bào sống. Gần đây, Hellyer và các cộng sự đã nhận thấy rằng lượng fobB ( 85B, entigien) mARN của vi khuẩn lao giảm từ <4 và 0,01% sau 24 giờ điều trị Isoniazid và Rifampixin. Một nghiên cứu mới đây cũng chỉ ra rằng mARN chỉ tồn tại trong vi khuẩn lao sống. Tương tự như vậy, ở các vi khuẩn khác, mARN không phát hiện thấy trong các tế bào bị giết bằng nhiệt hoặc bằng các điều trị hoá học. Do có vòng đời ngắn, nên mARN bị phân huỷ rất nhanh trong các tế bào chết, vì vậy, nó được coi là một dấu hiệu lý tưởng cho việc phát hiện vi khuẩn sống. 1.2.3. Phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường Sự lây truyền lao trong các khu vực đặc biệt như nhà dưỡng lão, nhà tù, trung tâm cai nghiện, bệnh viện được phát tán rất nhanh. Khả năng nhiễm lao sau khi hít phải những giọt khí dung chứa vi khuẩn lao có kích thước nhỏ hơn 5 µm do bệnh nhân lao giải phóng ra không khí trong phòng khi ho hoặc nói chuyện [35]. Vì vậy việc kiểm soát không khí trong các khu vực kín có bệnh 17 nhân lao là cần thiết và được thực hiện với các lý do chính sau: kiểm tra mức độ nhiễm vi khuẩn trong không khí để có biện pháp kiểm soát không khí đúng theo quy định về an toàn, để thu thập các số liệu dịch tễ liên quan đến giới hạn về mức độ phơi nhiễm của nhân viên y tế và cho các mục đích chung của khoa học và nghiên cứu. Việc kiểm soát không khí trong các vùng ô nhiễm lao có hiệu quả phụ thuộc vào kỹ thuật thu thập vi khuẩn từ không khí và môi trường và các kỹ thuật phát hiện vi khuẩn lao trong các mẫu đó. Một cách truyền thống là tập trung vào việc phân tích mẫu là đếm vi khuẩn có trong mẫu dựa trên nuôi cấy với một số hạn chế liên quan đến việc vi khuẩn lao có thời gian phát triển chậm và chỉ mọc trên các môi trường chọn lọc với các điều kiện thuận lợi [78], [41], [77]. Do vậy, những kỹ thuật nhanh và chính xác để phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường cần được áp dụng để khắc phục các nhược điểm trên [29]. Thu thập mẫu môi trường Một nghiên cứu năm 1962 do Ridley và cộng sự tiến hành đã cho hàng trăm chuột lang được thở không khí trực tiếp từ bệnh phòng có bệnh nhân lao. Số chuột lang bị nhiễm lao sẽ được thử nghiệm da, mổ tử thi và phát hiện các hạch lao trong phổi là kết quả của việc hít các hạt khí dung có chứa vi khuẩn lao trong không khí từ buồng bệnh nhân lao. Vi khuẩn lao sẽ được nuôi cấy từ phổi bị nhiễm, thời gian nhiễm và số lượng chuột bị nhiễm lao cũng được xác định [112]. Đây là một phương pháp rất tốn thời gian và phải có máy hút trực tiếp không khí từ phòng bệnh tới lồng kín nhốt hàng trăm chuột lang làm cho việc áp dụng trong những nghiên cứu khác bị hạn chế [112]. Một nghiên cứu khác sử dụng mô hình chuột lang cũng được tiến hành tại Châu Phi khi một bệnh viện lao được xây dựng để có thể nối trực tiếp với phòng kín nhốt chuột lang. Nhưng nhược điểm của nghiên cứu này là môi trường sống của chuột lang bị nhốt không tự nhiên gây căng thẳng cho chuột tham gia thí 18 nghiệm, hơn nữa hệ thống thải nước tiểu và phân chuột cũng cần được thiết kế để đảm bảo vệ sinh môi trường cho chuột [101]. Trong những năm gần đây, việc phát hiện vi khuẩn lao trong không khí dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử, xác định ADN của vi khuẩn lao với đầu dò đặc hiệu gắn với enzym tạo mầu khi phản ứng với cơ chất [114]. Máy hút được sử dụng để thu không khí nhiễm vi khuẩn lao, sử dụng các màng lọc (polytetrafluoroethylene) PTFE và polycarbonate (PC). Năm 1999, kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao trong hầm mỏ [88] và phòng áp lực âm sử dụng để thu thập vi khuẩn lao trong không khí [94]. Vào năm 2004, các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao trong không khí tại các bệnh viện lao được tiến hành, sử dụng máy hút không khí và phương pháp PCR [73], [65]. 1.3. NHIỄM LAO VÀ BỆNH LAO 1.3.1. Nguồn lây Tất cả các bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây, nhưng mức độ lây rất khác nhau [07]. Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, màng bụng, hạch, xương khớp…) là các thể lao ít có khả năng đào thải vi khuẩn lao ra bên ngoài môi trường. Lao phổi là thể bệnh dễ đưa vi khuẩn ra môi trường bên ngoài (lượng không khí lưu thông trong một chu kỳ hô hấp trung bình là 500ml), vì vậy bệnh nhân lao phổi là nguồn lây quan trọng nhất. Nhưng ngay đối với lao phổi thì mức độ lây cũng khác nhau. Những bệnh nhân lao phổi trong đờm có nhiều vi khuẩn lao có thể phát hiện bằng phương pháp nhuộm soi trực tiếp thì khả năng lây cho người khác gấp 2 đến 10 lần các bệnh nhân lao phổi phải nuôi cấy mới phát hiện được vi khuẩn [07]. Như vậy, bệnh nhân lao phổi có vi khuẩn trong đờm phát hiện được bằng phương pháp soi trực tiếp là nguồn lây nguy hiểm nhất (còn gọi là nguồn lây chính). Trẻ em bị bệnh lao không phải là nguồn lây quan trọng vì có tới 95% bệnh lao ở trẻ em không tìm thấy vi khuẩn trong các bệnh phẩm. 19 1.3.2. Đường xâm nhập của vi khuẩn vào cơ thể. Vi khuẩn lao vào cơ thể qua đường hô hấp là phổ biến nhất. Khi bệnh nhân lao phổi ho, khạc, hắt hơi hay nói chuyện tạo ra những hạt nước bọt rất nhỏ chứa đầy vi khuẩn lao lơ lửng trong không khí, người lành có thể hít phải những hạt này vào phổi và mắc bệnh [07]. Những người sống càng gần gũi bệnh nhân, số lượng vi khuẩn có thể hít vào càng lớn. Bệnh lao cũng có thể lây theo đường ăn uống khi uống sữa bò tươi của các con bò bị lao mà sữa chưa tiệt khuẩn, khi ăn các thức ăn bị lây nhiễm trực khuẩn lao (không phải trực khuẩn lao người, đây là lao bò M. bovis)..., có thể bị lao khi trực khuẩn lao qua các vùng cơ thể bị tổn thương (da, mắt v.v...) lọt vào cơ thể, nhưng các con đường này rất ít gặp. Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm qua thai nhi bằng đường máu qua tĩnh mạch rốn, nếu mẹ bị lao cấp tính (như lao kê), hoặc qua nước ối (khi chuyển dạ), nếu mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo. Trong thực tế con đường truyền bệnh này càng hiếm gặp. Như vậy con đường truyền bệnh quan trọng nhất với bệnh lao là đường hô hấp[02], [07]. 1.3.3. Nhiễm lao. Quá trình nhiễm bệnh lao Có 5 giai đoạn trong việc vi khuẩn lao thâm nhập và gây nhiễm trong cơ thể [124]: 1. Bệnh lao bắt đầu khi vi khuẩn lao có mặt trong các hạt khí dung thâm nhập các phế nang, ở nơi bắt đầu sự nhiễm lao. 2. Sự lan truyền bệnh bắt đầu từ 7 đến 21 ngày sau khi vi khuẩn lao xâm nhiễm đại thực bào và nhân lên trong đó. Mặc dù đại thực bào đã nuốt vi khuẩn lao nhưng không tiêu diệt được chúng vì đã bị bất hoạt. 3. Trong giai đoạn này các hạch lao được hình thành. Vi khuẩn lao bên trong các hạch này sẽ không nhân lên được do pH thấp và thiếu oxy nhưng có thể sống sót trong các hạch này dài ngày (lao tiềm ẩn).