Tài liệu Thử nghiệm sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic nhằm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi

  • Số trang: 96 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 85 |
  • Lượt tải: 1
nhattuvisu

Đã đăng 27125 tài liệu

Mô tả:

i CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho Thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm và TS. Nguyễn Văn Duy - Phó Giám đốc - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin cám ơn quý Thầy Cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin cám ơn các Thầy Cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. iii MỤC LỤC CAM ĐOAN ............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................ii DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... v DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ........................................................................... vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................viii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................. 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................ 4 1.1.1. Vi khuẩn lactic............................................................................................... 4 1.1.2. Bacteriocin .................................................................................................... 9 1.1.3. Cá giò .......................................................................................................... 13 1.1.4. Các biến đổi của cá sau khi chết .................................................................. 16 1.1.5. Các nguyên tắc bảo quản thực phẩm............................................................ 21 1.1.6. Một số phương pháp bảo quản nguyên liệu thủy sản.................................... 24 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ VI SINH VẬT ĐỂ BẢO QUẢN NGUYÊN LIỆU ..................................................... 30 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................... 30 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam................................................................ 33 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 36 2.1. VẬT LIỆU ..................................................................................................... 36 2.1.1. Mẫu cá giò................................................................................................... 36 2.1.2. Chủng vi khuẩn lactic T8............................................................................. 36 2.1.3. Chủng vi khuẩn chỉ thị................................................................................. 36 2.1.4. Thiết bị chuyên dụng .................................................................................. 37 2.1.5. Hóa chất, môi trường và thuốc thử............................................................... 37 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 39 2.2.1. Hoạt hóa và nuôi cấy các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ................. 39 2.2.2. Thu nhận dịch bacteriocin thô...................................................................... 40 2.2.3. Xác định hoạt độ bacteriocin ....................................................................... 40 iv 2.2.4. Xác định độ bền của bacteriocin .................................................................. 42 2.2.5. Đánh giá tác động của bacteriocin trên cá giò trong quá trình bảo quản ....... 44 2.2.6. Đánh giá sự biến đổi hoạt tính của dịch bacteriocin thô sau quá trình bảo quản cá giò ............................................................................................................ 49 2.2.7. Xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng bacteriocin............................................................................................................. 49 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 50 3.1. Thu nhận dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic T8 ....................................... 50 3.2. Xác định phổ ức chế vi sinh vật của dịch bacteriocin thô thu được ................. 51 3.3. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô từ chủng lactic T8........................... 53 3.3.1. Độ bền của bacteriocin với enzyme protease................................................ 53 3.3.2. Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô ........................................................ 55 3.3.3. Độ bền pH của dịch bacteriocin thô ............................................................ 56 3.4. Đánh giá tác động của dịch bacteriocin thô trên cá giò nguyên liệu tươi trong quá trình bảo quản................................................................................................. 57 3.4.1. Tác động của dịch bacteriocin thô lên chỉ tiêu cảm quan của cá giò tươi...... 57 3.4.2. Tác động của dịch bacteriocin thô lên chỉ tiêu hóa học ................................ 59 3.4.3. Tác động của dịch bacteriocin thô lên chỉ tiêu vi sinh vật của cá giò tươi .... 61 3.5. Đánh giá sự biến đổi của dịch bacteriocin thô sau quá trình bảo quản cá giò........ 64 3.6. Xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng dịch bacteriocin thô....................................................................................................... 74 3.6.1. Cơ sở xây dựng quy trình bảo quản cá giò tươi nguyên liệu......................... 74 3.6.2. Quy trình bảo quản cá giò tươi nguyên liệu ................................................. 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 77 1. KẾT LUẬN....................................................................................................... 77 2. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 79 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ............................ 88 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng phân loại bacteriocin .................................................................11 Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100 gram cá giò nguyên liệu..................16 Bảng 3.1. Đường kính vòng kháng của dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic T8 với các vi khuẩn đích........................................................................................... 51 Bảng 3.2. Đường kính vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý nhiệt và pH................................................................................55 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính của dịch bacteriocin thô sau thời gian bảo quản cá giò ..........................................................................................................64 Bảng 3.4. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò tươi nguyên con.................................67 Bảng 3.5. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con .........73 vi DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic..................................5 Hình 1.2. Cấu trúc của colicin – Một loại bacteriocin từ E. coli.............................9 Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin từ vi khuẩn lactic (LAB) .................11 Hình 1.4. Cá giò ..................................................................................................14 Hình 2.1. Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic T8 trên môi trường MRS....................... 36 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình hoạt hóa và nuôi cấy vi khuẩn.....................................39 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá chất lượng cá giò trước và sau khi bảo quản bằng dịch bacteriocin thô.....................................................................................46 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xây dựng quy trình bảo quản cá giò.................49 Hình 3.1. Mối quan hệ giữa khả năng sinh trưởng tính theo mật độ quang và khả năng sinh bacteriocin tính theo đường kính vòng kháng khuẩn của chủng T8 nuôi trên môi trường MRS .......................................................................................... 50 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic T8....................................................................................................52 Hình 3.3. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng vi khuẩn T8 với enzym proteinase K trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1. ....................53 Hình 3.4. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng vi khuẩn T8 với enzym αchymotrypsin trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1....................54 Hình 3.5. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý các nhiệt độ khác nhau. ...................................................................................55 Hình 3.6. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý ở pH 2-12 ........................................................................................................56 Hình 3.7. Biểu đồ so sánh điểm cảm quan của mẫu cá giò nhúng dịch bacteriocin........57 Hình 3.8. Biểu đồ so sánh độ cứng tương đối của mẫu cá giò nguyên con bảo quản bằng bacteriocin và mẫu đối chứng .....................................................................58 Hình 3.9. Biểu đồ so sánh độ cứng tương đối của mẫu da cá giò bảo quản bằng bacteriocin và mẫu đối chứng..............................................................................59 Hình 3.10. Đồ thị so sánh hàm lượng protein của mẫu cá giò nhúng dịch. ...........59 Hình 3.11. Đồ thị so sánh hàm lượng NH3 của mẫu cá giò nhúng dịch bacteriocin.....60 vii Hình 3.12. Khuẩn lạc Vibrio mọc trên môi trường TCBS từ các mẫu cá giò có nhúng dịch bacteriocin thô ............................................................................................... 61 Hình 3.13. Khuẩn lạc Vibrio mọc trên môi trường TCBS từ các mẫu cá giò đối chứng ..................................................................................................................62 Hình 3.14. Đồ thị so sánh sự gia tăng mật độ tế bào tương đối của mẫu cá giò nhúng dịch bacteriocin. ....................................................................................... 63 Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn hoạt độ dịch bacteriocin thô trong quá trình bảo quản cá giò nguyên liệu tươi ........................................................................................ 64 Hình 3.16. Khả năng kháng Bacillus của dịch bacteriocin theo thời gian bảo quản 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày......................................................................................... 65 Hình 3.17. Hình ảnh vòng kháng vi khuẩn Vibrio của dịch bacteriocin thô dùng bảo quản cá giò sau 3, 5, 7 ngày ..........................................................................66 Hình 3.18. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con ............67 Hình 3.19. Khuẩn lạc vi khuẩn lactic của mẫu đối chứng (A) và mẫu bảo quản bằng dịch bacteriocin thô (B) sau 3 ngày............................................................. 68 Hình 3.20. Khuẩn lạc vi khuẩn lactic của mẫu đối chứng (A) và mẫu bảo quản bằng dịch bacteriocin thô (B) sau 5 ngày............................................................. 69 Hình 3.21. Khuẩn lạc vi khuẩn lactic của mẫu đối chứng (A) và mẫu bảo quản bằng dịch bacteriocin thô (B) sau 7 ngày............................................................. 70 Hình 3.22. Tổng vi khuẩn hiếu khí của mẫu đối chứng (A) và mẫu nhúng dịch bacteriocin thô (B) tại thời điểm bắt đầu bảo quản (0 ngày).................................72 Hình 3.23. Tổng vi khuẩn hiếu khí của mẫu đối chứng (A) và mẫu nhúng dịch bacteriocin thô (B) sau 5 ngày bảo quản .............................................................. 72 Hình 3.24. Tổng vi khuẩn hiếu khí của mẫu đối chứng (A) và mẫu nhúng dịch bacteriocin thô (B) sau 5 ngày bảo quản .............................................................. 72 Hình 3.25. Tổng vi khuẩn hiếu khí của mẫu đối chứng (A) và mẫu nhúng dịch bacteriocin thô (B) sau 7 ngày bảo quản .............................................................. 73 Hình 3.26. Biểu đồ so sánh tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con..........................................................................................................73 Hình 3.27. Sơ đồ quy trình bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng dịch bacteriocin từ vi khuẩn lactic T8............................................................................................ 75 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Cfu Chữ viết đầy đủ Colony Forming Units (đơn vị hình thành khuẩn lạc) DNA Deoxyribonucleic acid (axit Deoxyribonucleic) EMP Embden – Mayerhorf – Parnas LAB Lactic Acid Bacteria (vi khuẩn lactic) MAP MRS PE RNA RV TCBS Modified Atmosphere Packaging (phương pháp bao gói có điều chỉnh khí quyển) De Man, Rogosa, Sharpe Poly Ethylen Ribonucleic acid (axit Ribonucleic) Rappaport Vassiliadis Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TSA Tryptone Soya Agar TSB Trypton Soy Broth XLD Xylose Lysine Desoxycholate Agar 1 MỞ ĐẦU Trong các năm qua, ngành thuỷ sản Việt Nam đã có những bước phát triển mạnh mẽ và trở thành một ngành có kim ngạch xuất khẩu xếp hàng thứ ba ở Việt Nam, chỉ sau Dầu khí và Dệt may. Kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam năm 2005 đạt mức 2,6 tỷ USD, năm 2007 là 3,752 tỷ USD, năm 2009 là 4,251 tỷ USD và năm 2010 là gần 5 tỷ USD. Tuy thế, nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch chủ yếu chỉ được bảo quản bằng các phương pháp truyền thống như ướp đá, ướp muối, đông lạnh …Đặc điểm mau ươn hỏng, nhanh giảm chất lượng của nguyên liệu thủy sản và mong muốn kéo dài thời gian bảo quản đã khiến cho nhiều ngư dân sử dụng các hóa chất như borat (hàn the), urea … để bảo quản nguyên liệu thủy sản gây mất an toàn thực phẩm và ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học là phải tìm ra một giải pháp bảo quản thích hợp, tiện lợi để hỗ trợ cho người dân thay thế cho các phương pháp bảo quản bằng các phụ gia độc hại hiện đang được người dân sử dụng một cách lén lút. Nhiều nghiên cứu hiện nay cho thấy có nhiều chất sinh học - có nguồn gốc từ tự nhiên có khả năng ức khuẩn nên có thể sử dụng trong bảo quản khá tốt, không độc hại với người tiêu dùng và được xem như là phương pháp tiềm năng, có nhiều lợi thế. Theo hướng sử dụng các hoạt chất sinh học, sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong bảo quản được xem là có nhiều ưu điểm nổi bật về tính an toàn và hiệu quả bảo quản thực phẩm, nhất là đối với các thực phẩm thủy sản tươi sống [21], [39], [40]. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic nhằm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi” với mong muốn thử nghiệm chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, không độc hại trong bảo quản nguyên liệu thủy sản. Trên cơ sở đó phát triển hướng ứng dụng này trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm thủy sản vì sự phát triển an toàn, bền vững của cộng đồng. Mục tiêu của đề tài: Thu nhận dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic, khảo sát các đặc tính của dịch bacteriocin làm cơ sở cho việc sử dụng trong bảo quản cá giò nguyên liệu tươi. 2 Nội dung của đề tài: đề tài có một số nội dung chủ yếu sau 1) Thu nhận dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic. 2) Xác định hoạt độ, phổ ức chế vi sinh vật của dịch bacteriocin thô. 3) Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô (pH, nhiệt độ, enzyme). 4) Đánh giá tác động bảo quản của dịch bacteriocin thô trên cá giò trong quá trình bảo quản (chất lượng cảm quan, thành phần hóa học, các chỉ tiêu vi sinh vật). 5) Đánh giá sự biến đổi của dịch bacteriocin thô sau khi bảo quản cá giò nguyên liệu tươi. 6) Xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng dịch bacteriocin thô. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Đề tài lần đầu thu nhận bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic nuôi tại phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang và thử nghiệm sử dụng bacteriocin trong bảo quản cá giò nguyên liệu. Vì vậy kết quả nghiên cứu của đề tài là nguồn dẫn liệu khoa học về việc sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong bảo quản cá giò nguyên liệu, làm cơ sở cho các nghiên cứu để xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò bằng bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic cũng như các nghiên cứu bảo quản nguyên liệu thủy sản khác. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở để các doanh nghiệp thủy sản sử dụng phương pháp mới trong bảo quản nguyên liệu thủy sản tươi bằng cách dùng bacteriocin - chất bảo quản sinh học an toàn với người sử dụng trong bảo quản nguồn nguyên liệu thủy sản tươi tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là cơ sở để các cơ quan quản lý thủy sản khuyến cáo người dân sử dụng các chất bảo quản mới, có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại thay thế cho các phụ gia bảo quản độc hại trong bảo quản nguyên 3 liệu thủy sản tươi nhằm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Kết quả nghiên cứu của đề tài nếu được áp dụng sẽ góp phần làm giảm thiểu việc ngộ độc thực phẩm thủy sản do sử dụng các chất độc hại trong bảo quản. Tính mới của đề tài Hiện nay, phần lớn các loại thực phẩm bảo quản bằng các chất bảo quản hóa học được cho là có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người sử dụng [13], [39]. Vấn đề sức khỏe rất được chú trọng trong xã hội hiện đại, vì vậy người tiêu dùng có xu hướng lựa chọn những thực phẩm an toàn, đảm bảo vệ sinh và có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng. Chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học đã được chứng minh có rất nhiều ưu điểm và đang nhận được sự quan tâm của toàn xã hội. Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng các hoạt chất sinh học có khả năng kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm, nâng cao chất lượng nguyên liệu như ứng dụng bacteriocin để bảo quản rau, cá hồi xông khói đông lạnh, thịt heo…[75, 77, 78, 79, 80, 81]. Tuy nhiên tại Việt Nam hầu như chưa có những nghiên cứu đầy đủ về việc sử dụng các chất bảo quản có nguồn gốc sinh học để bảo quản thực phẩm, đặc biệt là thủy sản – loại nguyên liệu rất dễ bị hư hỏng khi bảo quản không đúng cách. Trước tình hình đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic ứng dụng trong bảo quản cá giò nguyên liệu tươi. 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1. Vi khuẩn lactic a) Hệ thống phân loại Người ta thường dựa vào quá trình lên men chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lactic lên men đồng hình và dị hình. Một số ví dụ về vi khuẩn lactic lên men đồng hình bao gồm: Lactobacterium casei là những trực khuẩn rất ngắn, gây chua sữa tự nhiên. Yếm khí tùy tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8-1% axit lactic. Ở điều bình thường, chúng gây chua sữa trong vòng 10-12 giờ. Nguồn nitơ của vi khuẩn này là pepton. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 100C, tối ưu là 350C và tối đa là 450C. Chúng thủy phân casein và gelatin rất yếu. Streptococcus cremoris thường tạo thành chuỗi dài, thường phát triển ở nhiệt độ thấp hơn Lactobacterium casei, tối ưu từ 250C-300C, lên men đường glucose, galactose. Lactobacterium bulgaricus có dạng trực khuẩn rất dài, nhiệt độ phát triển tối ưu là 200C, có khả năng lên men glucose, lactose. Chúng có khả năng tạo độ axit cao (3,7% axit lactic). Lactobacterium delbruckii thường gặp trên hạt đại mạch, đây là trực khuẩn lớn. Trong quá trình phát triển chúng có khả năng tạo sợi. Nhiệt độ tối ưu để vi khuẩn này phát triển từ 450C-500C, khác với các loài khác, chúng không có khả năng lên men đường lactose, vì vậy Lactobacterium delbruckii không được dùng trong chế biến sữa. Lactobacterium cueumeris fermenti thường tìm thấy chúng trong sữa ủ chua. Chúng là trực khuẩn, không chuyển động, thường tạo thành tế bào đơn và có khi tạo thành chuỗi. Thường chúng tạo thành chuỗi trong quá trình lên men, khả năng tạo acid tối đa trong môi trường từ 0,9-1,2 %. [16] Một số ví dụ về vi khuẩn lactic lên men dị hình bao gồm: 5 Streptobacterium hassice fermentatae thường thấy chúng trong dịch lên men chua rau cải. Chúng tồn tại từng tế bào riêng biệt hoặc ghép thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn có khi ghép thành chuỗi dài hình sợi. Khi lên men rau cải chua tạo thành axit lactic, axit acetic, rượu etylic và CO2. Lên men đường saccarose tốt hơn lên men đường lactose. Lactobacterium lycopersici là trực khuẩn Gram dương, sinh hơi, tế bào tạo thành chuỗi hay đơn, có khi ghép thành đôi một. Khi lên men chúng tạo thành acid lactic, rượu etylic, acid acetic và CO2. Chúng có khả năng tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng thường chết ở nhiệt độ 800C. [3] Lactobacillus casei Streptococcus cremoris Lactobacillus bulgaricus Hình 1.1. Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic b) Đặc điểm cấu tạo của vi khuẩn lactic Axit lactic đầu tiên được phát hiện ra từ sữa bò lên men chua bởi nhà toán học Thụy Điển Carl Scheelle vào năm 1780 và được gọi là axit sữa. Năm 1857, Louis Pasteur lần đầu tiên đã chứng minh rằng việc làm ra sữa chua bò là do nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. Năm 1878, Josph Lister lần đầu tiên phân lập được một loại vi khuẩn lactic đặt tên là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Streptococcus lactic). Từ đó đến nay, nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập và nghiên cứu. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hầu hết không di động, có khả năng lên men đường để tạo axit lactic. Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydrocacbon và tiết ra axit lactic. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriace và được xếp vào bốn chi: Streptococcus, 6 Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc. Ngày nay người ta còn bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những chủng thuộc giống Bifidobacterium. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau như hình trực khuẩn ngắn, dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành dạng chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành dạng chuỗi. Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có dạng hình que. Khuẩn lạc tròn nhỏ, trong bong, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem hay khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid, khuẩn lạc dạng S. c) Đặc điểm sinh học Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng rất khác nhau, đặc biệt nhu cầu về vitamin và nitơ. Chúng có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon từ các loại hexose, các đường đôi cho đến các polysaccharide. Một vài loại vi khuẩn lên men dị hình, phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, trong quá trình trao đổi chất chúng tạo ra CO2, axit acetic và axit lactic. Các vi khuẩn lên men lactic trong thực phẩm chủ yếu là vi khuẩn lên men lactic dị hình. Phương trình tạo thành axit lactic: C6H12O6 —> CH3COOH + CO2 + C2H5COOH Đa số vi khuẩn lactic không thể tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình, chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ. Do đó, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ thịt, casein, pepton…để phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng. Vitamin là một yếu tố rất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Người ta thường phải bổ sung vào môi trường các vitamin tự nhiên có trong khoai tây, cà rốt, dịch tự phân nấm men và nhiều chất khác. Vitamin đóng vai trò là 7 coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào, chỉ có rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin. Để đảm bảo sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, natri, kali, lưu huỳnh, mangan. Đặc biệt là mangan vì mangan ngăn cản sự tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của của vi khuẩn sau này. Mặt khác, một vài enzym có sự tham gia của các ion kim loại như Fe2+, Mg2+, Mn2 trong cấu trúc của trung tâm hoạt động. Ngoài axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng như: axit hữu cơ (axit acetic…) có tác động đến sự sinh trưởng của tế bào, các bazơ nitơ như adenine, guanine, urasin, thimin…sẽ thúc đẩy sự phát triển nhất định của vi khuẩn. Axit amin như Lasparagin, L-glutamin. Nhiệt độ, pH là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sự sinh trưởng, vi khuẩn lactic được chia làm hai loại: loại ưa nhiệt và loại ưu ấm. Loại ưu nhiệt gồm có: Lactobaterium bulgaricus, L. thermophilus, L. delbruckii…phát triển tốt ở 45-620C. Loại ưa ấm gồm có: L.causasicus, L. lactic, L. helveticus, L. acidophilus, L. bifidus phát triển tốt ở 370C-450C, L. casein, L. plantarum, L. leichmanii, L. brevis, L. buchneri, L. pastorianus phát triển tốt ở 28320C, pH thích hợp từ 6,3-6,5. [3] d) Ứng dụng của vi khuẩn lactic trong ngành công nghệ thực phẩm Vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực, nhất là lĩnh vực thực phẩm từ rất lâu. Chúng được dùng để sản xuất axit lactic theo cách lên men đồng hình. Nguyên liệu dùng để sản xuất lactic là rỉ mật, đường, tinh bột đã được đường hóa. Nồng độ đường sử dụng cho quá trình lên men lactic từ 8-20%. Quá trình lên men lactic xảy ra rất tốt trong môi trường axit, tuy nhiên vi khuẩn lactic không có khả năng chịu được nồng độ axit quá cao. Khi nồng độ axit quá cao sẽ 8 ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic vì vậy cần phải điều chỉnh độ pH của môi trường từ 6,3-6,5. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men lactic là 500C. Trong quá trình lên men lactic có nhiều vi khuẩn tham gia vì vậy sản phẩm thu được ngoài axit lactic còn có CO2 và một số sản phẩm phụ khác. [16] Trong ngành công nghiệp nhẹ, axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm. Trong công nghiệp sản xuất rượu, axit lactic được dùng dưới dạng muối của canxi. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa, rất nhiều giống vi khuẩn lactic được sử dụng tùy theo mục đích sản xuất. Vi khuẩn lactic đồng hình giúp lên men nhanh, làm giảm pH; vi khuẩn lactic lên men dị hình lên men chậm và tạo mùi thơm đặc trưng là nguyên tắc làm sữa chua. Sữa từ dạng lỏng chuyển sang dạng keo sệt và có mùi vị thơm ngon. Ngoài ra để sản xuất phomat người ta dùng enzym đông kết casein trong sữa, sau đó tiếp tục cho lên men lactic với nồng độ muối loãng. Tùy loại phomat mà trong quá trình ủ chín người ta sử dụng các loài vi sinh vật khác nhau. Các loại vi sinh vật thường được sử dụng để làm chín phomat là vi khuẩn propionic, nấm mốc… Vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong việc muối chua rau quả. Muối chua rau quả nhằm hai mục đích cơ bản: bảo quản nguyên liệu và làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan của rau quả. Nguyên tắc để muối chua rau quả là tạo điều kiện để phát triển vi khuẩn lactic đồng thời hạn chế tác dụng của vi khuẩn gây thối rữa. Nông dân thường sử dụng quá trình lên men lactic để ủ chua thức ăn gia súc. Phương pháp ủ chua thức ăn gia súc đặc biệt cần thiết đối với các trại chăn nuôi gia súc. Với phương pháp này, giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu làm thức ăn chỉ giảm 10%, so với phương pháp phơi khô là 50 %, đồng thời phương pháp ủ chua sẽ tăng nhiều chỉ số dinh dưỡng khác của thức ăn. [16] 9 Hiện nay, vi khuẩn lactic còn được quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh bacteriocin, một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào vi khuẩn. Vì vậy, bacteriocin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm. sữa tươi, nước giải khát, xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi và đặc biệt là bảo quản thủy sản. 1.1.2. Bacteriocin a) Hệ thống phân loại bacteriocin Có nhiều loại bacteriocin đã được sản xuất từ vi khuẩn lactic và được phân loại theo những đặc tính hóa sinh và di truyền học. Các nhà khoa học chia chúng thành 4 nhóm, trong đó nhóm III, IV chưa được nghiên cứu nhiều, chủ yếu tập trung nghiên cứu các ứng dụng của nhóm I và II. Nhóm I lantibiotic nhỏ (<5 kDa) là những peptid ổn định nhiệt, tác động lên cấu trúc màng tế bào. Lantibiotic bacteriocin được phân vào hai lớp phụ dựa vào những điểm giống nhau trong cấu trúc. Lớp phụ Ia có cấu trúc dạng hình thon dài, hoạt động bằng cách tạo lỗ trên màng tế bào vi khuẩn đích. Nisin cũng thuộc vào nhóm này. Lớp phụ Ib là những peptid đặc trưng hình cầu, chúng thường tác động đến các phản ứng lên men quan trọng của vi khuẩn đích [40, 45]. Hình 1.2. Cấu trúc của colicin – Một loại bacteriocin từ E. coli 10 Nhóm II non – lantibiotic có trọng lượng phân tử nhỏ và biến thiên (<10 kDa), ổn định nhiệt, chứa những amino acid thông thường. Nhóm này được chia cắt vào trong ba nhóm nhỏ.  Nhóm IIa là những peptid thường kháng Listeria, đặc trưng là Leucocin A, PA-1 pediocin (Venema et al,1997) và sakacin.  Nhóm IIb hình thành bởi một phức chất của hai peptid riêng biệt. Những peptid này có khả năng hoạt động rất ít, thậm chí là ở trạng thái không hoạt động. Giữa các peptid bổ sung có nhiều sự khác biệt. Trong nhóm này điển hình là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK.  Nhóm IIc bao gồm các peptid nhỏ, bền nhiệt. Lớp phụ này bao gồm divergicin A và acidocin B. Nhóm III là các peptid lớn, với trọng lượng phân tử hơn 30 kDa. Đại diện cho lớp này là helveticin J (Joerger và Klaenhammer, 1986) và helveticin V (Vaugham et al…,1992), acidofilicin A và lactacin A,B. Ngoài ra, đối với bacteriocin của vi khuẩn lactic (LAB) có thể chia theo nhóm dựa vào cấu trúc, cũng có thể dựa vào kiểu hoạt động. Một vài bacteriocin của lớp I như nisin, nó có hai kiểu hoạt động. Chúng có thể kết hợp với lớp lipid I như kênh vận chuyển các tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến thành tế bào, vì thế ngăn cản sự tổng hợp thành tế bào dẫn đến tế bào chết. [52, 61, 66, 81] Chúng cũng có thể sử dụng lớp lipid II như các phân tử để bắt đầu quá trình gắn vào màng và hình thành kênh dẫn đến tế bào bị chết nhanh chóng. Lantibiotic, ví dụ như lacticin 3147, có thể gồm cả hai kiểu cơ chế có cả hai peptid tham gia. Nhưng ngược lại, mersacidin có duy nhất một kiểu cơ chế hoạt động và gắn vào lipid II nhưng không hình thành kênh. Thông thường những peptid lớp II có cấu trúc xoắn lưỡng cực được cài vào tế bào gốc của màng dẫn đến sự khử cực và chết. Bacteriocin của nhóm III như lysostaphin có thể tác động trực tiếp vào thành tế bào vi khuẩn Gram dương dẫn đến chết và làm tan tế bào gốc. [38, 41, 55, 83] 11 Bảng 1.1 Bảng phân loại bacteriocin Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IV - Chuỗi ngắn, - Chuỗi dài - Chuỗi dài (>15 - Dạng vòng kích thước nhỏ - Bền nhiệt kDa) - Kém bền nhiệt dưới 6 kDa, - Điện tích dương - Kém bền nhiệt - Có cấu trúc thường có các axit - Có cấu trúc domain amin lạ. domain - Bền nhiệt - Lưỡng cực - Điện tích dương Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin từ vi khuẩn lactic (LAB) 12 b) Đặc điểm sinh học của bacteriocin Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong bảo quản thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là sử dụng một số protein của vi khuẩn làm thuốc kháng sinh. Trong số đó, bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và đang được quan tâm nhiều hơn cả. Bacteriocin có bản chất là peptide kháng khuẩn, được sinh ra bởi vi khuẩn này để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra, chúng không gây ra phản ứng dị ứng cho con người và vấn đề về sức khỏe, do được phân hủy nhanh bởi enzyme trong hệ tiêu hóa như protease, lipase. Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn. Kết quả của công trình này đã thúc đẩy các nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn. Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là colicin vì nó có khả năng tiêu diệt E.coli. Hiện nay có nhiều tài liệu xem bacteriocin chính là chất kháng sinh (antibiotic), (James) hoặc gọi nó là peptid kháng sinh vì nó có bản chất là polypeptide và có khả năng kháng khuẩn. Cho đến nay, bacteriocin đã được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nhóm vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm. [1, 17, 19] c) Một số tính chất của bacteriocin * Độ bền nhiệt Các nghiên cứu chỉ ra rằng các loại bacteriocin của những loài khác nhau thì khả năng chịu nhiệt khác nhau. Bacteriocin có khả năng chịu nhiệt ở một khoảng nhất định, chủ yếu thuộc các nhóm I, II. Bacteriocin ST28MS và ST26MS được sản xuất bởi Lactobaccillus plantarum không giảm khả năng kháng khuẩn sau 90 phút tại 1000C hay 20 phút tại 1210C [60]. Đặc điểm bền nhiệt này có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin.
- Xem thêm -