Tài liệu Thử nghiệm khả năng ứng dụng protease từ nội tạng tôm trong sản xuất chitin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEASE TỪ NỘI TẠNG TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NGỌC HÀ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VĂN BẰNG KỸ SƢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEASE TỪ NỘI TẠNG TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS - TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TRẦN THỊ NGỌC HÀ ThS. NGUYỄN LỆ HÀ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ba mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã giúp con có sự thành đạt nhƣ hôm nay. Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM, ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. PGS – TS. Nguyễn Tiến Thắng, ThS. Nguyễn Lệ Hà, CN. Đỗ Thị Tuyến đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Các anh chị tại phòng Các chất có hoạt tính sinh học đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Bạn Lê Minh Thông, Trƣơng Minh Dũng, Ngô Thị Thu Ngân và Cao Thị Thanh Loan. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hổ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm trong sản xuất Chitin” đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Viện Sinh học nhiệt đới, thời gian từ tháng 4 đến tháng 7/2007 với mục đích xem xét Enzyme từ nội tạng tôm có thể dùng để thủy phân, loại protein thay thế cho việc dùng NaOH hay không. Thử nghiệm sản xuất Chitin đƣợc bố trí trên cả 2 loại nguyên liệu là vỏ tôm khô và tƣơi, dƣới cả 2 hình thức khử: khử khoáng trƣớc và khử protein trƣớc. Công đoạn khử khoáng thực hiện bằng cách: xử lý với HCl 10%; trong 5 giờ; ở nhiệt độ phòng; tỷ lệ giữa nguyên liệu vỏ tôm tƣơi và dung dịch HCl là 1:5 (W/V), đối với vỏ tôm khô là 1:10 (W/V). Đối với công đoạn tẩy màu: với KMnO4 1%, H2SO4 10%; trong 1,5 giờ và với Na2S2O3 2%; trong 15 phút. Kết quả đã xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein vỏ tôm bằng chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm nhƣ sau:  Đối với quá trình sản xuất Chitin thực hiện thủy phân protein trƣớc: - Nồng độ Enzyme thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 6%. - Nhiệt độ thủy phân tốt nhất: ở vỏ khô là 550C, ở vỏ tƣơi là 600C. - pH thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7 - Thời gian thủy phân tốt nhất ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ.  Đối với quá trình sản xuất Chitin thực hiện khử khoáng trƣớc: - Nhiệt độ thủy phân tốt nhất: ở vỏ khô là 600C, ở vỏ tƣơi là 550C. - pH thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7. - Thời gian thủy phân tốt nhất ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm tắt .......................................................................................................................... iv Mục lục ........................................................................................................................... v Danh sách các hình...................................................................................................... viii Danh sách các bảng ....................................................................................................... ix Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Những khái niệm chung về Enzyme ....................................................................... 3 2.1.1. Đại cƣơng về Enzyme ........................................................................................ 3 2.1.1.1. Lịch sử phát triển ........................................................................................ 3 2.1.1.2. Định nghĩa .................................................................................................... 4 2.1.1.3. Bản chất của Enzyme ................................................................................... 4 2.1.1.4. Phân loại ....................................................................................................... 5 2.1.1.5. Hoạt tính Enzyme ......................................................................................... 6 2.1.2. Đại cƣơng về Enzyme protease .......................................................................... 6 2.1.2.1. Định nghĩa .................................................................................................... 6 2.1.2.2. Nguồn thu nhận ............................................................................................ 7 2.1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng Enzyme ........ 8 2.1.2.4. Ứng dụng .................................................................................................... 10 2.2. Đại cƣơng về tôm và Enzyme protease từ tôm .................................................... 11 2.2.1. Đại cƣơng về tôm ............................................................................................. 11 2.2.2. Thành phần hoá học trong các phần của tôm ................................................... 14 2.2.3. Enzyme protease từ tôm ................................................................................... 15 2.2.3.1. Tính chất..................................................................................................... 15 2.2.3.2. Phân loại ..................................................................................................... 17 2.3. Chitin ..................................................................................................................... 17 vi 2.3.1. Đại cƣơng về Chitin ......................................................................................... 17 2.3.2. Đặc tính lý hoá học .......................................................................................... 19 2.3.3. Sự tổng hợp Chitin ở loài giáp xác................................................................... 20 2.3.4. Ứng dụng của Chitin ....................................................................................... 21 2.3.5. Tình hình nghiên cứu Chitin trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 23 2.3.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ Chitin trên thế giới ................ 23 2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu Chitin ở Việt Nam .................................................. 24 2.3.6. Các phƣơng pháp chiết tách Chitin .................................................................. 26 2.3.6.1. Phƣơng pháp hóa học ................................................................................. 26 2.3.6.2. Phƣơng pháp sinh học ................................................................................ 30 Chƣơng 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm thí nghiệm .............................................................................................. 32 3.2. Nguyên liệu ........................................................................................................... 32 3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng ....................................... 33 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................... 34 3.4.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 34 3.4.1.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford .......................... 34 3.4.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phƣơng pháp Amano)36 3.4.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận Enzyme protease .................................... 38 3.4.3. Phƣơng pháp sản xuất Chitin bằng Enzyme protease từ nội tạng tôm ............ 40 3.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân vỏ tôm thích hợp bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm ................................................................................... 42 3.4.4.1. Xác định nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp ........................................ 42 3.4.4.2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp ...................................................... 43 3.4.4.3. Xác định pH thủy phân thích hợp ............................................................. 43 3.4.4.4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp ..................................................... 44 3.5. Các phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 44 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc thủy phân protein trƣớc ................................................................................ 45 4.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme thủy phân .................................................... 45 4.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân ................................................................. 47 vii 4.1.3. Ảnh hƣởng của pH thủy phân .......................................................................... 49 4.1.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ................................................................. 51 4.2. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc khử khoáng trƣớc ......................................................................................... 52 4.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân ................................................................. 52 4.2.2. Ảnh hƣởng của pH thủy phân ......................................................................... 54 4.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ................................................................ 55 4.3. Kết quả so sánh hiệu suất và đánh giá cảm quan giữa các mẫu sản phẩm Chitin thu đƣợc ........................................................................................................................ 56 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ................................................................................................................. 58 5.2. Đề xuất ý kiến ....................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 60 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 61 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Tôm .............................................................................................................. 12 Hình 3.1: Nội tạng tôm................................................................................................. 33 Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh ........................................................................................... 33 Hình 3.3: Bể ổn nhiệt ................................................................................................... 33 Hình 3.4: Máy đo quang phổ UV- Vis ......................................................................... 34 Hình 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô ......................................................................................................................... 46 Hình 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................................................................................ 46 Hình 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ........................................................ 48 Hình 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................ 48 Hình 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ..................................................................... 50 Hình 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi .................................................................... 50 Hình 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ...................................... 51 Hình 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ..................................... 51 Hình 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .............................. 52 Hình 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ............................. 53 ix Hình 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .......................................... 54 Hình 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......................................... 54 Hình 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ........... 55 Hình 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......... 56 Hình 4.8: Nguyên liệu và sản phẩm ............................................................................. 57 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn protein.................................................................................... 61 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn protease.................................................................................. 61 x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô ......................................................................................................................... 62 Bảng 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................................................................................ 62 Bảng 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ........................................................ 63 Bảng 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................ 63 Bảng 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ..................................................................... 64 Bảng 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi .................................................................... 64 Bảng 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ...................................... 65 Bảng 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ..................................... 65 Bảng 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .............................. 66 Bảng 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ............................. 66 Bảng 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ......................................... 67 Bảng 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......................................... 67 Bảng 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ........... 68 xi Bảng 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ........... 68 xii 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Chitin là polysaccharide đứng thứ hai về lƣợng trong tự nhiên, chỉ sau cellulose. Chitin/Chitosan và các sản phẩm từ chúng hiện nay đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đời sống nhƣ y - dƣợc học, nông nghiệp, bảo vệ môi trƣờng… Chitin đã đƣợc chiết tách từ hơn một thế kỉ nay, nhƣng cho đến nay việc tách chiết này vẫn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp hóa học là chính. Phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là tốn nhiều hóa chất, chất lƣợng của sản phẩm lại không cao, độc hại cho ngƣời lao động và gây ô nhiễm môi trƣờng. Điều này các nhà môi trƣờng học đã lên tiếng cảnh báo. Trong thời gian gần đây, phƣơng pháp chế biến sinh học, bằng phƣơng pháp công nghệ Enzyme đã đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu áp dụng để thay thế phƣơng pháp hóa học trong sản xuất Chitin nhằm hạn chế những khiếm khuyết do phƣơng pháp hóa học gây ra. Với mức đóng góp 70-80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam, nên hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh. Tôm là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao (chứa 21,04% protein theo nghiên cứu của TS. Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất đƣơc ƣa chuộng trên thị trƣờng thế giới. Theo báo cáo của Bộ Thủy Sản, sản lƣợng tôm năm 2003 là 193.973 tấn. Tùy thuộc vào phƣơng pháp chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể chiếm từ 40-70% khối lƣợng tôm nguyên liệu. Tƣơng ứng với sản lƣợng tôm nƣớc ta, hằng năm sẽ có một khối lƣợng tôm khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm đƣợc tạo ra. Đặc biệt trong đầu tôm có nội tạng chứa Enzyme protease, Enzyme có hoạt tính rất cao, có khả năng thủy phân protein rất tốt. Ở nƣớc ta hiện nay, nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chƣa đƣợc tận dụng triệt để hoặc chƣa tận dụng những phế liệu này trên quy mô lớn hay không có hƣớng tận dụng trực tiếp nguồn phế liệu này, đầu tôm đƣợc bán với giá rất rẻ hoặc cho, bán không hết phải bỏ đi. 2 Tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học, công nghệ ngành thủy sản là: sử dụng hợp lý và hiệu quả lƣợng phế liệu tôm rất lớn do các nhà máy chế biến thủy sản tạo ra hằng ngày để sản xuất ra những sản phẩm mới, có giá trị cao. Một trong những hƣớng giải quyết yêu cầu trên là chiết rút chế phẩm protease có hoạt tính cao từ đầu và nội tạng tôm rồi sử dụng chế phẩm này để tạo ra những sản phẩm mới cho xã hội, vừa giảm thiểu chất thải, vừa thoả mãn nhu cầu mở rộng mặt hàng thủy sản, nâng cao hiệu quả kinh tế ngành chế biến thủy sản. Với mong muốn góp phần giải quyết những yêu cầu trên và tận dụng nguồn Chitin dồi dào trong phế liệu tôm, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease nội tạng tôm trong sản xuất Chitin” 1.2. Mục đích nghiên cứu Mục đích chung của đề tài là: Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm thô protease nội tạng tôm để thủy phân vỏ tôm sản xuất Chitin. Để đạt đƣợc các mục đích này, các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Xác định nồng độ chế phẩm Enzyme cần thiết cho quá trình thủy phân protein. - Xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein nhƣ: Nhiệt độ quá trình Điều kiện pH Thời gian xử lý vỏ tôm (khô hoặc tƣơi) bằng Enzyme. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Những khái niệm chung về Enzyme 2.1.1. Đại cƣơng về Enzyme ([1], [3], [4]) 2.1.1.1. Lịch sử phát triển Enzyme đã đƣợc sử dụng từ rất lâu. Nƣớng bánh mì, nấu rƣợu vang, sản xuất dấm, tƣơng, chao,… ở các mức độ khác nhau là những quá trình sinh học xƣa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại. Cho đến nay, ở đa số các nƣớc đang phát triển, các hình thức sản xuất trên vẫn còn tiếp tục phổ biến ở dạng cải biến nhờ sự hổ trợ của công nghệ Enzyme hiện đại. Chế phẩm Enzyme trong dịch chiết xuất từ động vật, thực vật đã đƣợc sử dụng rất lâu trƣớc khi ngƣời ta biết đƣợc bản chất của Enzyme. Ngay từ đầu thế kỷ 19 đã có những nghiên cứu ghi nhận sự hiện diện của chất xúc tác sinh học – Enzyme trong quá trình tiêu hóa ở nƣớc bọt, dạ dày và ruột. Năm 1850, Pasteur vĩ đại đƣa ra nhận định là quá trình lên men đƣờng thành rƣợu bởi nấm men đƣợc tác nhân xúc tác sinh học gọi là ferment (fermentation – sự lên men) xúc tác. Sau này tác nhân trên đƣợc gọi thống nhất là Enzyme. Đặc biệt Buchner vào 1897 đã chứng minh chính dịch chiết nấm men (chứ không phải toàn bộ tế bào nấm men) có khả năng lên men đƣờng thành rƣợu. Đó là bằng chứng xác thực về sự tham gia của chính bản thân Enzyme trong quá trình lên men. Năm 1926, lần đầu tiên Sammer nhận đƣợc tinh thể Enzyme urease. Năm 1930, Northrop nhận đƣợc tinh thể pepsin và trypsin và đã chứng minh bản chất của Enzyme là protein và đặt nền móng cho những nghiên cứu cơ bản về Enzyme. Cũng vào thời kỳ này Haldane viết quyển “Enzyme”, mặc dù lúc đó bản chất phân tử của Enzyme còn là bí mật, nhƣng tác giả đã đƣa ra dự đoán tuyệt vời về vai trò của các tƣơng tác và liên kết yếu giữa Enzyme và cơ chất trong cơ chế hoạt động của Enzyme. Điều này vẫn giữ nguyên tính thời sự trong thời đại của chúng ta. Tuy nhiên, việc sử dụng Enzyme cho mục đích sản xuất công nghiệp lại đƣợc bắt đầu trên cơ sở Enzyme vi sinh vật đƣợc ngƣời Mỹ gốc Nhật tên là Okishi 4 Takamine khởi xƣớng đầu tiên dựa trên nguồn Enzyme từ nấm mốc. Năm 1894 ông đƣợc nhận bằng sáng chế về sản xuất Enzyme diastase từ nấm sợi và ông đặt tên cho sản phẩm là Takadiastase, là hỗn hợp chứa Enzyme carbohydrase và protease đƣợc sản xuất bằng kỹ thuật lên men bán rắn bề mặt hay còn gọi là kỹ thuật koji trên cám lúa mì ẩm có bổ sung muối và vi lƣợng. Trong giai đoạn cuối thế kỷ 20, các nghiên cứu trong lĩnh vực này tập trung vào nghiên cứu vai trò xúc tác của Enzyme trong các quá trình trao đổi chất của tế bào. Đã tinh sạch đƣợc hàng ngàn Enzyme và nhờ vậy đã làm sáng tỏ cấu trúc không gian và chức năng xúc tác của hàng trăm Enzyme khác nhau. 2.1.1.2. Định nghĩa Enzyme là protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Theo tiếng Hi Lạp: -en có nghĩa là trong, còn -zyme có nghĩa là bột chua). Sự hiểu biết về Enzyme có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Rất nhiều dạng bệnh lý liên quan trực tiếp đến sự vắng mặt hoặc xáo trộn mật độ của Enzyme. Ngoài ra, càng ngày Enzyme càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, trong công nghiệp hóa học, trong công nghiệp vi sinh vật, trong chế biến thực phẩm và sản xuất nông nghiệp. 2.1.1.3. Bản chất của Enzyme Ngoài nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, tuyệt đại đa số Enzyme có bản chất là protein và sự thể hiện hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, 3 và 4 của phân tử và trạng thái tự nhiên của nó. Enzyme có MW thay đổi rất rộng từ 12.000 Da đến hàng vài trăm nghìn Da. Enzyme là protein có hoạt tính sinh học nên có đủ tính chất của protein. Giống với các protein hình hạt khác, Enzyme có thể hòa tan trong nƣớc, dung dịch đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý… Dung dịch Enzyme có tính chất của dung dịch keo ƣa nƣớc. Enzyme trong dung dịch dễ dàng bị kết tủa dƣới tác dụng của muối trung hòa nhƣ Sulphatamon hoặc các dung môi hữu cơ nhƣ ethanol, acetone,… ở nhiệt độ thấp nhƣng không bị mất hoạt tính xúc tác. Do đó, có thể dùng các tác nhân này để thu chế phẩm Enzyme. 5 Ngƣợc lại, dƣới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) Enzyme thƣờng bị mất khả năng xúc tác. Và mức giảm hoạt độ tƣơng ứng với mức độ biến tính của phân tử protein – Enzyme. 2.1.1.4. Phân loại Rất nhiều Enzyme đƣợc đặt tên bằng cách thêm đuôi –ase vào tên gọi cơ chất hoặc tên gọi mô tả quá trình xúc tác của nó, ví dụ urease là Enzyme thủy giải ure. Một số Enzyme khác nhƣ pepsin, trypsin,… lại không gọi theo tên cơ chất mà vẫn gọi theo tên truyền thống. Để thống nhất tên gọi Enzyme, theo quy ƣớc quốc tế, tên Enzyme thƣờng có 2 phần: phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ tên kiểu phản ứng mà chúng xúc tác. Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế đã thống nhất xây dựng hệ thống phân loại Enzyme quốc tế. Trong hệ thống phân loại này, tất cả các Enzyme đƣợc phân thành 6 lớp:  Oxydoreductase: Enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử.  Transpherase: Enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.  Hydrolase: Enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân.  Liase: Enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 (Pyruvate decarboxylase) hay phản ứng tách thuận nghịch phân tử nƣớc (Fumarate hydrolase).  Isomerase: Enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tƣơng hổ phức tạp giữa galactose và glucose.  Ligase: Enzyme xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic acid, tạo thành oxaloacetid acid. 2.1.1.5. Hoạt tính Enzyme Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có vai trò và chức năng sinh học quan trọng bậc nhất đi với tế bào và cơ thể sống – là chất xúc tác sinh học có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu tuyệt vời. Chúng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học ở điều kiện sống bình thƣờng mà các chất xúc tác hóa học khác không thể thực hiện nổi. Enzyme tham gia xúc tác tất cả các phản ứng biến đổi trong tế bào và cơ thể sống, trong đó khá nhiều Enzyme đóng vai trò điều hòa làm nhạc trƣởng điều khiển sự phối hợp nhịp nhàng các phản ứng trong quá trình trao đổi chất. 6 2.1.2. Đại cƣơng về Enzyme protease 2.1.2.1. Định nghĩa Protease là Enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton. Phản ứng thủy phân bởi Enzyme có thể biểu diễn theo sơ đồ: Enzyme A–B + H2O AH + BOH Protease (Cơ chất + H2O Sản phẩm) Nhƣ vậy, phản ứng thủy phân bởi Enzyme là phản ứng lƣỡng phân. Nhƣng do trong phản ứng thủy phân lƣợng nƣớc rất lớn và coi nhƣ không đổi trong suốt quá trình, nên tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất, nghĩa là phản ứng thủy phân bởi Enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1. Trong quá trình phản ứng, các phân tử cơ chất ban đầu sẽ phản ứng một cách độc lập, không phụ thuộc vào sự có mặt của các phân tử khác. Cần lƣu ý: Trong quá trình thủy phân, phản ứng thủy phân cơ chất là phản ứng chính nhƣng không phải duy nhất mà còn có một số phản ứng phụ. Nhƣ: trong phản ứng thủy phân protein thành axit amin, các phản ứng phụ có thể là phản ứng phân huỷ axit amin thành các sản phẩm thứ cấp, phản ứng Melanoidin tạo thành các hợp chất màu… 2.1.2.2. Nguồn thu nhận Từ động vật Protease động vật thƣờng có ở tuỵ tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày,… Gồm: - Pancreatin gồm: trypsin, chymotrypsin và một số Enzyme khác có ở tuỵ tạng, chúng đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tuỵ. - Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị. - Renin chỉ có ở ngăn thứ tƣ trong dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi, là Enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage. 7 Từ thực vật Enzyme protease từ thực vật có ở các phần khác nhau của cây nhƣ: thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả. Enzyme này chủ yếu có ở một số cây vùng nhiệt đới nhƣ: đu đủ, dứa, cây sung, articho và đậu tƣơng. Ví dụ: - Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh. - Bromelin có trong thân cây thơm và quả thơm xanh. - Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả. Từ vi sinh vật Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các Enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc đƣợc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dƣợc. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,…Harley (1960) đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản nhƣ sau: - Protease serine - Protease kim loại - Protease acid - Protease tiol. 2.1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng Enzyme [3] -Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ Enzyme. Nhƣng nếu tăng nồng độ Enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm. 8 - Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Nhƣng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng. Với từng Enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng nhƣ với từng cơ chất, nồng độ tới hạn của Enzyme phụ thuộc vào điều kiện của qúa trình phản ứng. Vì vậy, với từng Enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của Enzyme. - Ảnh hƣởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa Hoạt độ của Enzyme có thể bị thay đổi dƣới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm giảm (chất kìm hãm) hoạt độ Enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tùy từng chất, tùy từng Enzyme. Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng Enzyme sẽ làm cho Enzyme bị giảm hoạt tính nhƣng không bị chuyển hóa bởi Enzyme. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các protein. Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của Enzyme hoặc làm cho Enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động. Các chất này thƣờng có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim lọai hoặc các chất hữu cơ. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của Enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. - Ảnh hƣởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng Enzyme và tốc độ phản ứng Enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nếu đƣa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính Enzyme sẽ bị giảm, khi đó Enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngƣợc lại, ở nhiệt độ 00C, Enzyme bị han chế rất mạnh, nhƣng khi đƣa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính Enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp. Ở nhiệt độ thấp (0-410C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lƣợng cho phản ứng.