Tài liệu Thử nghiệm điều trị bệnh do Edwardsiella ictaluri trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus) trong phòng thí nghiệm bằng sản phẩm Eryton Powder

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ HOA THỬ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM BẰNG SẢN PHẨM ERYTON POWDER LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Năm 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ HOA THỬ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM BẰNG SẢN PHẨM ERYTON POWDER LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Năm 2012 LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến: Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình giúp đỡ, quan tâm, chia sẻ và cho nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình làm và hoàn thành luận văn. Thầy cô Khoa Thủy sản đã luôn tạo điều kiện và truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm quý báu trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. Chị Trần Việt Tiên đã nhiệt tình giúp đỡ cho tôi hoàn thành tốt luận văn. Chị Nguyễn Hoàng Nhật Uyên đã luôn động viên, chia sẻ, cho tôi nhiều kinh nghiệm, và giúp đỡ tôi rất nhiều. Tập thể Bệnh học thủy sản K34 đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm xác định tác dụng của thuốc Eryton Powder lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Kết quả kháng sinh đồ sử dụng đĩa kháng sinh thương mại cho thấy có 2/5 chủng kháng với kháng sinh Erythromycine Thiocynate chiếm 40% và 2/5 chủng cho kết quả trung bình nhạy chiếm 40%, có 1 chủng cho kết quả nhạy với đĩa kháng sinh này chiếm 20%. Tiếp theo với đĩa kháng sinh tự tẩm Ery25 và E50 cho kết quả là có 5/5 chủng cho kết quả trung bình nhạy chiếm 100%. Đối với đĩa kháng sinh tự tẩm Ery75 còn lại cho thấy tất cả các chủng đều có kết quả nhạy. Kết quả MIC của thuốc kháng sinh lên 5 chủng vi khuẩn E. ictaluri cho thấy có 4 chủng bị ức chế ở nồng độ 256ppm là B1C1, B1C2, C258, 3V1, và chủng còn lại B1C4 bị ức chế ở nồng độ 128ppm. Thí nghiệm điều trị được bố trí với các nghiệm thức được bố trí lặp lại 3 lần và được theo dõi trong 14 ngày liên tục và ở nghiệm thức B1, B3, B5 được cho ăn thức ăn có trộn thuốc Eryton powder trong 5 ngày đầu. Đối với các nghiệm thức còn lại thì cho ăn thức ăn không trộn kháng sinh trong suốt quá trình bố trí thí nghiệm. Trong quá trình bố trí thí nghiệm tỷ lệ cá chết, dấu hiệu bệnh lý, nhiệt độ và pH trong bể được ghi nhận để xác định được tác dụng điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra. Tất cả cá chết và lờ đờ được thu và lấy thận trước để xác định cá nhiễm E. ictaluri bằng phương pháp PCR. Kết quả cho thấy thuốc có khả năng điều trị bệnh cho cá tra. Ở các nghiệm thức cho ăn thức ăn có trộn thuốc tỷ lệ cá chết là 40% và ở các nghiệm thức không cho ăn thức ăn trộn kháng sinh là 62.2%. Giá trị RPS là 34%. Kết quả PCR khẳng định cá bệnh nhiễm vi khuẩn E. ictaluri khi tất cả đều hiện vạch sáng ở 407bp. ii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ.......................................................................................................i TÓM TẮT .......................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH SÁCH BẢNG..........................................................................................v DANH SÁCH HÌNH....................................................................................................vi Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................1 1.1 Giới thiệu ..................................................................................................1 1.2 Mục tiêu của đề tài....................................................................................2 1.3 Nội dung của đề tài ...................................................................................2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3 2.1 Tổng quan tình hình bệnh trên cá tra ..........................................................3 2.2 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri .....................................................4 2.2.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri.............................................4 2.2.2 Thời gian bệnh xuất hiện .....................................................................5 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý..................................................................................5 2.2.4 Phương thức lan truyền........................................................................5 2.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong thủy sản....................................5 2.4 Thuốc kháng sinh Erythromycine Thyocinate ............................................6 2.4.1 Định nghĩa kháng sinh .........................................................................6 2.4.2 Cơ chế tác động của kháng sinh...........................................................6 2.4.3 Các yếu tố thuận lợi cho sự phân tán các chủng đề kháng....................7 2.4.4 Kháng sinh Erythromycine Thiocynate................................................7 2.5 Một số nghiên cứu về sự kháng thuốc của E. ictaluri vơí các loại kháng sinh ..................................................................................................................7 2.6 Các nghiên cứu về phương pháp PCR ......................................................10 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................12 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...........................................................12 3.2 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu ............................................................12 iii 3.3 Phương pháp nghiên cứu.........................................................................13 3.3.1 Phương pháp kháng sinh đồ...............................................................13 3.3.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn ........................................................................................14 3.3.3 Phương pháp PCR: ............................................................................16 3.4 Điều trị cá bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm ...................................19 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................21 4.1 Kết quả kháng sinh đồ..............................................................................21 4.2 Kết quả làm MIC .....................................................................................22 4.3 Kết quả thí nghiệm điều trị.......................................................................25 4.4 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR................................28 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT..................................................................31 5.1 Kết luận ...................................................................................................31 5.2 Đề xuất ....................................................................................................31 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................32 PHỤ LỤC..........................................................................................................34 iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri....................... 8 Bảng 2.2 So sánh độ nhạy của vi khuẩn E. ictaluri với các loại kháng sinh .................................................................................................... 9 Bảng 3.1 Thao tác pha loãng kháng sinh (thể tích dùng cho 10 chủng vi khuẩn) ....................................................................................... 14 Bảng 3.2 Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho một chủng)........................................................................... 15 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR................................ 18 Bảng 4.1 Đường kính vòng tròn vô trùng của Erythromycine với 5 chủng vi khuẩn E. ictaluri thí nghiệm .................................................................... 21 Bảng 4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh Erythromycine lên vi khuẩn E. ictaluri......................................................... 23 Bảng 4.3 Số lượng cá chết trong thời gian bố trí thí nghiệm ......................... 25 Bảng 4.4 Số lượng cá chết giữa nghiệm thức cho ăn thức ăn trộn kháng sinh và không trộn kháng sinh ..................................................................... 27 Bảng 4.5 Hàm lượng ADN chiết tách được từ thận cá thí nghiệm (ng/l)..... 29 v DANH SÁCH HÌNH Hình 4. 1 Kết quả kháng sinh đồ với chủng B1C2 ...................................................22 Hình 4. 2 Kết quả MIC với chủng 3V1 ....................................................................23 Hình 4. 3 Kết quả MIC với chủng C258 ..................................................................24 Hình 4. 4 Cá thu được sau khi bố trí TN (14/02)......................................................26 Hình 4. 5 Cá bệnh sau bố trí TN (12/02)..................................................................27 Hình 4. 6 Sản phẩm PCR điện di mẫu ngày 11,12/02...............................................28 Hình 4. 7 Sản phẩm PCR điện di mẫu ngày 22/02 ...................................................29 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL E. ictaluri Đồng Bằng Sông Cửu Long Edwardsiella ictaluri NT NCCLS Nghiệm thức National Committee for Clinical Laboratory Standards. MIC Minimum Inhibitory Concentration. RPS Relative Percent Survival vii Phần 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) không chỉ nổi tiếng là vựa lúa mà còn là vựa cá tôm trù phú nhất của Việt Nam. Với diện tích trải rộng trên địa bàn 12 tỉnh và 1 thành phố. ĐBSCL từ xưa đã nổi tiếng là vùng đất lắm tôm nhiều cá nhờ vào hệ thống sông ngòi, kênh rạch dày đặc cùng với những ngư trường khai thác rộng lớn trên biển. Chính vì vậy, từ lâu nghề nuôi trồng thủy sản đã trở thành nghề truyền thống của nhiều địa phương vùng ĐBSCL tạo động lực phát triển kinh tế-xã hội cho toàn vùng. Các đối tượng nuôi chủ yếu bao gồm cá tra, cá trê, cá lóc, cá rô…Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tượng cá nuôi nước ngọt chủ lực, cung cấp thực phẩm trong nước và là mặt hàng xuất khẩu thủy sản quan trọng của Việt Nam (http://nongnghiep.vinhlong.gov.vn) Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), trong 10 tháng đầu năm 2011 các doanh nghiệp chế biến cá tra xuất khẩu đạt kim ngạch trên 1,48 tỷ USD, tăng 29,2% so với cùng kỳ năm ngoái. Xuất khẩu cá tra năm 2011 có thể đạt khoảng 1,6 tỷ USD (http://www.mard.gov.vn). Tuy nhiên, do sự chuyển đổi nhanh chóng từ nuôi quảng canh sang thâm canh, diện tích nuôi ngày một mở rộng nên vấn đề ô nhiễm môi trường và dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều. Các bệnh phổ biến thường gặp là xuất huyết, phù đầu, gan thận mủ, vàng da…. Trong đó, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra xuất hiện với tần suất rất cao, gây ảnh hưởng đến năng suất cá nuôi và việc diễn biến phức tạp của bệnh đã khiến người nuôi sử dụng rất nhiều loại kháng sinh, hóa chất với nồng độ không ngừng gia tăng, thêm vào đó với thói quen sử dụng thuốc kháng sinh để phòng bệnh đã tạo nên những dòng vi khuẩn kháng thuốc làm cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn và trở ngại. Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã được thực hiện để đánh giá khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. ictluri. Waltman và Shotts, 1986 đã kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá nheo bệnh ở Mỹ với 37 loại kháng sinh. Kết quả cho thấy phần lớn vi khuẩn này nhạy với các thuốc thí nghiệm nhưng hơn 90% lại kháng với colistin và sulfamids. Reger và ctv. (1993) đã xác định các chủng E. ictaluri phân lập trên cá nheo còn nhạy với enrofloxacin, gentamycin và doxycycline. Từ những nghiên cứu trên cho thấy vi khuẩn E. ictaluri đã kháng rất nhiều loại kháng sinh và tình trạng sử dụng kháng sinh không hợp lý còn để lại tồn lưu 1 trong thịt cá ảnh hưởng đến chất lượng thịt cá là một trong những vấn đề đau đầu cho người nuôi và cả nhà quản lý sức khỏe cộng đồng vì nó có thể ảnh hướng tới sức khỏe con người. Chính vì những lý do này nên đề tài “Thử nghiệm điều trị bệnh do Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) trong phòng thí nghiệm bằng sản phẩm Eryton Powder” được thực hiện nhằm mục đích tìm hiểu khả năng điều trị bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri gây ra. 1.2 Mục tiêu của đề tài Xác định ảnh hưởng của sản phẩm Eryton Powder lên vi khuẩn E. ictaluri trong phòng thí nghiệm. 1.3 Nội dung của đề tài 1. Lập kháng sinh đồ xem xét tính nhạy và kháng thuốc của vi khuẩn 2. Kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration – MIC) của thuốc kháng sinh Erythromycin Thiocyanate lên vi khuẩn. 3. Thí nghiệm gây cảm nhiễm và điều trị cá bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm. 2 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình bệnh trên cá tra Cá Tra có tên khoa học là Pangasius hypophthalmus trước đây còn có tên là P. micronemus, là một loài cá nuôi truyền thống trong ao của nông dân các tỉnh ĐBSCL. Ngoài tự nhiên cá sống ở lưu vực sông Cửu long (Thái Lan, Lào, Campu-chia và Việt Nam). Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, oxygen hòa tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao (Dương Nhựt Long, 2003). Trong 10 tháng năm 2011, ĐBSCL đã đưa khoảng 5.140 ha mặt nước vào nuôi cá tra, sản lượng đạt trên 1,1 triệu tấn, nhiều nhất tại An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long. Theo ngành thương mại các tỉnh ĐBSCL, các tỉnh trong vùng vừa xuất 49.000 tấn cá tra, nâng tổng lượng cá tra xuất khẩu từ đầu năm đến nay lên 487.700 tấn, tăng 28% so cùng kỳ năm 2010; tổng giá trị đạt 1,47 tỷ USD, chiếm trên 30% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản cả nước (http://bannhanong.vn). Từ những lợi ích không thể phủ nhận từ con cá tra nên người nuôi chuyển sang hình thức nuôi công nghiệp như thâm canh, siêu thâm canh. Theo Đỗ Thị Hòa và ctv. (2004), sự đầu tư lớn về giống, thức ăn và năng suất cao luôn là điều kiện tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh. Do vậy, khi nuôi trồng thủy sản càng phát triển thì vấn đề dịch bệnh càng trở nên thường xuyên, đe dọa ngành nuôi trồng thủy sản, gây những thiệt hại lớn và đôi khi bệnh đã trở thành nhân tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất (trích dẫn Phạm Thị Ngọc Xuân, 2009). Bệnh xảy ra trên cá tra có nhiều nguyên nhân. Tác nhân thường gây bệnh cho cá tra là ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm, dinh dưỡng, stress…Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, làm tỉ lệ hao hụt cao và khó điều trị ở cá tra. Các loại bệnh do tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ mỏ, đỏ kỳ, xuất huyết đường ruột, trắng da, đốm trắng trên gan…Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas và bệnh trắng gan (mủ gan) do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là bệnh phổ biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra nuôi ao, bè, đăng quần. Chúng đã gây nhiều thiệt hại cho người nuôi trong những năm gần đây. Theo Trần Anh Dũng, (2005) tỷ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khoảng (61%) không cao hơn nhiều so với các bệnh khác như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (68,3%), bệnh phù đầu (51,2%). Nhưng theo thống kê Lê Xuân Sinh, (2006) cho thấy bệnh mủ gan trên cá tra xuất hiện nhiều nhất (82,1%), bệnh xuất huyết 3 (63,4%), bệnh do ký sinh trùng (32,0%). Ngoài ra, còn có một số bệnh nguy hiểm khác nhưng xuất hiện với tần số thấp hơn như: bệnh vàng da (12,2%), bệnh đường ruột (11,5%), bệnh lồi mắt (11,4%), bệnh tuột nhớt (10,0%), bệnh lở loét (3,1%),…Theo điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong, (2008) cho thấy bệnh gan thận mủ xuất hiện với tần số cao nhất (93,8%), tiếp theo đó là bệnh xuất huyết (75%), bệnh trắng gan trắng mang (68,8%). Như vậy, thấy rằng bệnh gan thận mủ đang là mối đe dọa lớn nhất cho người nuôi cá tra hiện nay. Gần đây nhất, theo Trần Văn Đệ, (2010) thì tần số xuất hiện bệnh gan thận mủ là 100%. 2.2 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.2.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri Bệnh gan thận mủ được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 1998. Đây là một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra, basa ở ĐBSCL.Tỉ lệ chết cao nhất là 60 - 80% (Crumlish và ctv., 2002) làm giảm năng suất đáng kể trong các hệ thống nuôi. Theo Bùi Quang Tề (2005), tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, Edwarsiella thuộc họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Chúng là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, di động yếu ở 25oC và không di động ở nhiệt độ 30oC, catalase dương tính, oxidase âm tính và lên men đường glucose, không sinh ra H2S và indole âm tính, không có khả năng chịu được độ mặn cao hơn 1,5% NaCl. Vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng như gan, thận, tỳ tạng của cá da trơn. Có 1 - 3 Plasmid (Speyerer và Boyle, 1987; Newton và ctv., 1988), những plasmid có thể đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với kháng sinh. Vi khuẩn E. ictaluri thích hợp với điều kiện nhiệt độ 18 – 28oC. Vi khuẩn này tồn tại trong nước với thời gian ngắn hay dài phụ thuộc vào nhiệt độ. Nếu môi trường nước có nhiệt độ là 50C thì vi khuẩn có thể tồn tại trong ao khoảng 15 ngày nhưng khi nhiệt độ nước tăng lên 250C thì thời gian sống của chúng rút ngắn còn khoảng 10 ngày. Tuy nhiên, trong lớp bùn đáy ao thì vi khuẩn này có thể tồn tại khoảng 15 ngày ở 5 oC, 45 ngày ở 180C và 95 ngày ở 250C (Plum, 1999). Bệnh mủ gan thường xuất hiện phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ. Ở Việt Nam, nhiệt độ nước dao động từ 26 – 28oC là điều kiện thích hợp cho vi khuẩn gan thận mủ phát triển. 4 2.2.2 Thời gian bệnh xuất hiện Bệnh thường xuất hiện vào mùa lũ và cao điểm vào tháng 7 - 8. Tuy nhiên gần đây bệnh xuất hiện hầu như quanh năm. Trong một vụ nuôi cá bệnh có thể xuất hiện 3-5 lần. 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu không phát hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị. Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội quan (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 1 – 3 mm các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận (Từ Thanh Dung và ctv., 2004) 2.2.4 Phương thức lan truyền E. ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau. Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shotts và ctv., 1986). Theo nghiên cứu của Shotts và ctv. (1986) bệnh lan rộng từ màng não đến sọ và da E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu. Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá da trơn còn nhiễm E. ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột. Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh. 2.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong thủy sản Qua điều tra sơ bộ tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi cá riêng ở huyện Thốt Nốt, hiện có khoảng 47 loại thuốc và hóa chất được sử dụng. Trong đó nhóm thuốc dùng để trị bệnh được sử dụng nhiều nhất trên khoảng 20 loại, đa số các loại thuốc này là kháng sinh (Lê Thị Kim Liên, 2008). Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ở khu vực Châu Đốc, Châu Phú, Thốt Nốt cho thấy có tổng số 21 loài kháng sinh thường được người dân sử dụng, trong đó có các loài được sử dụng nhiều nhất là Flofenicol (tần suất xuất hiện 95%), kế đến là Doxycylin (90%), Erofloxacine (85%), Amoxcilline (70%). Ngoài ra các chất như Kanamycine, Cefalexcin, Colistin… cũng thường được người dân sử dụng (Phan Trọng Duy, 2007). 5 Khi bệnh xảy ra trong ao, nông dân thường sử dụng các sản phẩm thuốc thú y thủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá. Tuy nhiên, theo Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, (2007) việc sử dụng kháng sinh còn tùy tiện, không đúng về liều lượng và liệu trình điều trị. Nông dân thường dùng kháng sinh liều thấp để phòng bệnh cho cá. Vì vậy hiệu quả điều trị kháng sinh ngày càng giảm và hình thành khả năng kháng thuốc cho vi khuẩn. Theo Bùi Thị Tho, (2003) trong điều trị các bệnh truyền nhiễm nên có chiến lược sử dụng kháng sinh phù hợp, bao giờ cũng chọn thuốc mà vi khuẩn mẫn cảm nhất và chỉ nên phối hợp kháng sinh khi bị nhiễm đồng thời nhiều vi khuẩn hay khi phối hợp sẽ diệt được vi khuẩn kháng thuốc. Với sự phát triển nhanh chóng của nuôi thâm canh cá da trơn ở ĐBSCL dẫn đến việc sử dụng quá nhiều loại kháng sinh trong phòng và trị bệnh vi khuẩn. Việc sử dụng hóa chất và kháng sinh không đúng qui định, không kiểm soát có thể làm tác động đến môi trường, hệ sinh thái của khu vực hoặc để lại dư lượng trong sản phẩm thủy sản và dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh trong các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá (Aoki, 1988; Sarter và ctv., 2007; Dung và ctv., 2009). Nhiều nghiên cứu đã khẳng định tác động của việc sử dụng kháng sinh trong môi trường nuôi thủy sản sẽ tạo ra những chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh (Hansen và ctv., 1993; DePaola và ctv., 1995). Ở Việt Nam, hiện tượng kháng thuốc đã được một số tác giả ghi nhận trên vi khuẩn gây bệnh cũng như vi khuẩn trong môi trường nuôi cá, tôm (Dung và ctv.,1997; Van, 2005; Phuong và ctv., 2005 và Le và ctv., 2005; Sarter và ctv., 2007), (trích dẫn Từ Thanh Dung, 2009). 2.4 Thuốc kháng sinh Erythromycine Thyocinate 2.4.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra) hay do con người tổng hợp nên, có tác động một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của các nấm (tác nhân kháng nấm), của các virus (tác nhân kháng virus) (Lê Thị Kim Liên, 2008). 2.4.2 Cơ chế tác động của kháng sinh - Ức chế sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn (ức chế sự tổng hợp peptidoglycan). - Ức chế sự tổng hợp cần cho vi khuẩn - Ức chế sự tổng hợp hay ức chế chức năng của acid nucleic. 6 - Ức chế chức năng màng tế bào vi khuẩn. 2.4.3 Các yếu tố thuận lợi cho sự phân tán các chủng đề kháng - Việc sử dụng kháng sinh và cách dùng chưa hợp lý - Dùng thuốc kháng sinh quá thường xuyên, xem như là một thành phần của thức ăn công nghiệp cho vật nuôi. - Sự chọn lọc lọc chủng đề kháng do sử dụng kháng sinh - Một mạng duy nhất cho tất cả động vật bệnh - Trị liệu đơn kháng sinh - Sự tiếp cận của những cá thể bị nhiễm trùng - Sự nhân nhanh chóng của các vi khuẩn - Dùng kháng sinh trong giai đoạn ương giống 2.4.4 Kháng sinh Erythromycine Thiocynate Erythromycine là kháng sinh thuộc nhóm Macrolid, được sản xuất từ nấm Streptomyces erythreus và có cấu trúc gồm một nhân gắn với các phân tử đường bằng những liên kết glycoside. Là kháng sinh có tác động làm kìm khuẩn ở nồng độ trong huyết tương. Tuy nhiên, ở mô nồng độ thường cao hơn và có hiệu lực diệt khuẩn. Kháng sinh Erythromycine có kết tinh màu trắng to, kiềm tính, khó tan trong nước. Trong dung dịch toan tính dễ biến chất nếu pH < 4 hoàn toàn mất hiệu lực nhưng ngược lại trong dung dịch kiềm tính, khả năng diệt khuẩn tăng lên. Bảo quản điều kiện nhiệt độ thấp. Erythromycine là kháng sinh phổ rộng, ngăn cản sự tổng hợp protein ở riboxom trong tế bào vi khuẩn (Đỗ Thị Hòa & ctv, 2004). Erythromycine có phổ hoạt lực rộng như Penicilin, tác dụng mạnh với vi khuẩn gram dương, một số vi khuẩn gram âm cũng có tác dụng, ngoài ra còn có tác dụng với nhóm vi sinh vật Clamidia, các Streptococcus như Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Đỗ Thị Hòa & ctv, 2004). 2.5 Một số nghiên cứu về sự kháng thuốc của E. ictaluri vơí các loại kháng sinh Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà vi khuẩn có thể chịu được tác động của loại thuốc kháng nào đó. Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi sinh vật tạo ra kháng sinh nhằm bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh này. Vi khuẩn đã kháng thuốc kháng sinh có thể truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn khác và hiện tượng kháng thuốc có nguy cơ xảy ra ở 7 hầu hết các loại kháng sinh đã dùng trong nuôi trồng thủy sản (trích dẫn Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010). Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ ở cá tra đã được cảnh báo trong nhiều năm qua. Vi khuẩn này kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh được phép sử dụng hoặc hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn thông báo năm 2009 (Bảng 2.1). Bảng 2.1 Sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri (trích dẫn Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010) Kháng sinh Oxytetracylin Oxolinic acid Sulphonamid Streptomycin Flumequin Flofenicol Số chủng Số chủng Tỉ lệ kiểm tra kháng thuốc (%) 77 65 84.4 104 36 34.6 13 13 100 64 53 82.8 64 5 7.8 91 11 12.1 Trimethoprim/sulfamethoxazole 94 66 70.2 Tetracyline Doxycyline 30 27 7 4 23.3 14.8 Nguồn Phương và ctv., 2005; Dung và ctv., 2008; Oanh và ctv., 2010. Dung et al., 2008; Oanh và ctv., 2010. Oanh và ctv., 2010. a) Phương pháp kháng sinh đồ Hawke, (1979) là nhà khoa học đầu tiên đã làm kháng sinh đồ trên 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri. Shotts và Waltman, (1986) kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 E. ictaluri phân lập được ở Hoa Kỳ với 37 loại thuốc kháng sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy đa số vi khuẩn Gram âm nhạy với hầu hết các loại thuốc đã thí nghiệm. Tuy nhiên, hơn 90% số chủng vi khuẩn kháng với colistin và sulfamids. Reger et al. (1993) cũng xác định các chủng E. Ictaluri ở Hoa Kỳ đều nhạy với enrofloxacin, gentamicine và doxycycline. Từ Thanh Dung và ctv, (2004) làm nghiên cứu kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn này kháng với một số loại kháng sinh như oxytetracycline, oxolinic acid và sulphonamides. Theo nhóm tác giả, hơn 70% các chủng E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra đã kháng với trimethoprim, oxytetracycline và streptomycin. Nhóm quinolon như fumequin, oxolinic acid và enrofoxacin cũng đã giảm tác dụng (Dung et al., 2010). 8 Theo Đặng Thị Hoàng Oanh, (2005) làm nghiên cứu trên 196 dòng vi khuẩn được thử nghiệm với 6 loại kháng sinh và kết quả kháng sinh đồ cho thấy số dòng vi khuẩn chỉ kháng Chloramphenicol với tỷ lệ 2%. Phần lớn các dòng vi khuẩn thí nghiệm kháng với nhiều loại kháng sinh. Có 34% kháng nhiều loại kháng sinh như Chloramphenicol, ampicillin, tetracycline, trymethoprim/ sulfamethoxazole. Các dòng kháng với chloramphenicol thì lại nhạy với norfloxacin hơn 29%. E. ictaluri kháng với Bactrime (100%), colistin (97,7%), florfenicol (42,5%), amoxicillin (40,4%), tetracycline (31,9%), doxycycline (27,7%) (Trương Ngọc Loan et al., 2007); kháng với colistin (> 90%), flumequin (8%), oxolinic acid (6%), streptomycin (83%), oxytetracyclin (81%) và trimethrorim (73%) (Từ Thanh Dung et al., 2008). Bảng 2.2 So sánh độ nhạy của các loại kháng sinh đối với vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra bệnh gan thận mủ (Nguyễn Đức Hiền, 2008) Độ nhạy (% ) các loại kháng sinh khảo sát Norfl- Enr Sulfa+ Doxy flor Flume-quin Amox ox o Trime Năm 2006 87.2 66.4 61.6 53.6 77.6 55.2 22.4 (n=125) Năm 2007 67 10.7 45.2 41.62 57.8 35 0 (n=197) Tháng 1-3/ 2008 66.6 3.8 30.5 41.7 21.2 49.9 0 (n=120) Nguyễn Đức Hiền, (2008) thực hiện thí nghiệm kháng sinh đồ trên cá tra bệnh gan thận mủ và xuất huyết nuôi tại các trang trại tại các địa phương như Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu Giang và Bến Tre cho thấy mức độ nhạy của vi khuẩn đối với thuốc ngày càng giảm. Kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ từ 1/2006-3/2008 được trình bày ở bảng trên. Gần đây nhất theo Phạm Thị Ngọc Xuân, (2009) kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng hoàn toàn với streptomycin và oxolinic acid, các chủng vi khuẩn cũng kháng với florfenicol và vi khuẩn nhạy nhất với kháng sinh amoxicillin. b) Phương pháp MIC Huỳnh Thị Phương Quyên, (2008) đã làm thí nghiệm MIC với 2 chủng vi khuẩn E. ictaluri là E223 và E258 với 2 loại kháng sinh cefalexin và doxycylin 9 cho kết quả là đối với kháng sinh doxycylin nồng độ MIC là 16ppm, còn kháng sinh cefalexin nồng độ MIC lại cao hơn là 64ppm. Kết quả MIC của kháng sinh streptomycin trên 2 chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CA3.4TT và MX3.3G thấp, dao động từ 2-4 μg/ml (Phạm Thị Ngọc Xuân, 2009). Theo nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2010), làm thí nghiệm với 50 chủng E. ictaluri kết quả xác định giá trị MIC cho thấy đa số vi khuẩn kháng cao với streptomycin với giá trị MIC90 ≥256 μg/ml, chloramphenicol, enrofloxacine MIC90 (128μg/ml) và oxytetracyline với giá trị MIC90 (64 μg/ml). Đặc biệt, hiện tượng đa kháng đã tìm thấy 86% tổng số chủng kháng với ít nhất 3 loại kháng sinh. Lý Thị Phú Nhân, (2010) đã tiến hành thí nghiệm 5 chủng E. ictaluri với thuốc kháng sinh Bicomarin cho kết quả nồng độ MIC là 100.000 ppm. 2.6 Các nghiên cứu về phương pháp PCR: Phương pháp PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt trong ống nghiệm một đoạn DNA với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (Oligonucleotides), enzym tổng hợp DNA, các nucleotide tự do, dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis và các cộng sự (Mỹ) vào tháng 10 năm 1985. Đây là một kỹ thuật rất nhạy bén và đặc biệt, cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với một tiểu phân vi rút. Những vi rút ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này. Hiện nay, kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như để phát hiện và tạo ra đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh, … (Khuất Hữu Thanh, 2006). Lê Hữu Thôi và ctv, (2010) thực hiện qui trình PCR phát hiện đồng thời vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila nhiễm trên thận cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thực hiện và chuẩn hoá. Mồi xuôi EiFd-1 và mồi ngược EiRs Rs được sử dụng để khuếch đại đoạn đặc hiệu trên gen 16S RNA của E. ictaluri với sản phẩm PCR là 407 bp. Độ nhạy của qui trình là 100 pg DNA chiết tách từ thận cá tra cho E. ictaluri. Phạm Thị Ngọc Xuân, (2009) ứng dụng qui trình PCR để phát hiện 10 chủng E. ictaluri, sản phẩm PCR là 407bp. Victor và ctv, (2007) phát triển phương pháp m-PCR phát hiện cùng lúc ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá là Flavobacterium Columnare (504bp), E. ictaluri (407bp), Aeromonas hydrophyla (209bp). 10 Nguyễn Ngọc Dung, (2010) thực hiện chuẩn hóa qui trình realtime-PCR định lượng sử dụng Syber Green phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), với sản phẩm PCR là 178bp. Nguyễn Trúc Phương, (2009) đã ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán nhanh vi khuẩn E. ictaluri, thời gian được rút ngắn ¼ lần so với phương pháp định danh truyền thống. Mai Thị Loan, (2009) đã thực hiện nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp ly trích AND từ mô thận theo phương pháp của Taggart et al. (1992) và tối ưu hóa phương pháp PCR phát hiện E. ictaluri, có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui trình gốc, xác định được độ nhạy đối với ADN chiết tách trực tiếp từ thận có hàm lượng là 50ng, với ADN chiết tách từ vi khuẩn có hàm lượng 0.2 ng. 11