Tài liệu Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens sh4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện MSSV: 1311100520 : TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện MSSV: 1311100520 : TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Hương ( Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM). Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 23 năm qua, người đã cùng con trải qua biết bao nhiêu khó khăn trong cuộc sống và luôn qua tâm con, chăm sóc cho con. Người luôn bên con những lúc khó khăn nhất. Em cũng xin cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hướng và ủng hộ em trên con đường học tập. Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tâm dạy bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Hoài Hương, người luôn nhiệt tình với học trò, luôn định hướng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em xuyên suốt quá trình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai người đã cho em lời khuyên trong quá trình nuôi sâu tơ thí nghiệm và cung cấp cho em giống nấm thí nghiệm. Em cũng xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Trần Thiện Đức đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm. Đồng thời, xin cảm ơn đến bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, Cao Thị Thanh Thúy đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn cùng thực hiện đồ án trong thời gian mình thực hiện đồ án ở phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá trình làm thí nghiệm. Cảm ơn em Hồ Trung Lộc lớp 14DSH, em Trần Nguyễn Tuấn Minh 14DSH, em Bùi Nhật Minh 14DSH đã phụ giúp anh trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC ...................................................................................................................1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................4 DANH MỤC HÌNH ẢNH ..........................................................................................5 DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................6 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................9 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học .................................................................9 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học ..............................................................9 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay ............9 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học ...........................10 1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin ......................................10 1.1.4.1 Ưu điểm .............................................................................................11 1.1.4.2 Nhược điểm .......................................................................................11 1.1.4.3 Cơ chế tác động ................................................................................12 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens ........................................................12 1.2.1 Lịch sử phát hiện ......................................................................................12 1.2.2 Phân loại ..................................................................................................13 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens ..........................................................13 1.2.4 Đặc điểm sinh lí .......................................................................................14 1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa.............................................................................15 1.1.3.2 Đặc điểm phân bố .............................................................................16 1.2 Giới thiệu về Prodigiosin ................................................................................17 1.3.1 Khái niệm về prodigiosin .........................................................................17 1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin .....................................................17 1.3.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin ..........................................................20 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin của Serratia marcescens ...........................20 1.4 Enzyme ............................................................................................................25 1.5 Yếu tố độc lực của Serratia marcescens .........................................................25 1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới ......................................................................26 1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens..............................................26 1 Đồ án tốt nghiệp 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin ...........................................................27 1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh ........................................................27 1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp ...................................................................27 1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp ........................................................................28 1.6.3.3 Nấm Trichoderma .............................................................................28 1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus .....................................................................29 1.7 Khái quát về sâu tơ Plutella xylostella ............................................................29 1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học ...................................................................29 1.7.2 Tập quán sinh sống và cách gây hại ........................................................30 1.7.3 Biện pháp phòng trừ.................................................................................30 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................32 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu ......................................................................32 2.1.1 Thời gian ..................................................................................................32 2.1.2 Địa điểm ...................................................................................................32 2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị ...............................................................................32 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens.......................................................32 2.2.2 Nguồn nấm ...............................................................................................32 2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii ..............................................................32 2.2.4 Nguồn cải ngọt Brassica integrifolia. ......................................................32 2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate .....................................................32 2.2.6 Môi trường nuôi cấy và hóa chất .............................................................32 2.2.7 Dụng cụ, thiết bị .......................................................................................33 2.3 Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................34 2.4 Nội dung nghiên cứu .......................................................................................34 2.5 Phương pháp thí nghiệm .................................................................................34 2.5.1 Phương pháp luận ....................................................................................34 2.5.2 Bố trí thí nghiệm.......................................................................................35 2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm ..................................................36 2.6.1 Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm ......................................36 2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens .........................37 2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học ................................................37 2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme .............................................................37 2 Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm ........................................42 2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp quét lá .........................44 2.6.3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii ...........................................................................................................................45 2.6.3.5 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cải ngọt Brassica integrifolia .........................................................................................................47 2.6.3.6 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên cá bảy màu ...................48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN...................................................................51 3.1 Khả năng tiết enzyme ngoại bào .....................................................................51 3.2 Hoạt tính kháng nấm .......................................................................................52 3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm .........................................................................55 3.4 Khảo sát độc tính của chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii ........57 3.5 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cải ngọt Brassica integrifolia ...............58 3.6 Khảo sát tác động của chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata .............61 1.Kết luận ..............................................................................................................65 2. Kiến nghị ...........................................................................................................66 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................67 PHỤ LỤC A. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG ..............................................71 PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH ........................................................................................74 PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ ............................................................................................86 PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ .......................................................................89 3 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Artemia nauplii : A.nauplii Brassica integrifolia : B. integrifolia Serratia mascescens : S.mascescens Plutella xylostella : P.xylostella Pepton glycerol : PG QCVN : Quy chuẩn Việt Nam. BNNVPTNT : Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn. 4 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) ..............................................................................................................14 Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens ........14 Hình 1.3 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008) .................................................18 Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) .........................................18 Hình 1.5 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor và cộng sự, 2001) ..................................21 Hình 1.6 Con đường được đề xuất cho quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. .........24 Hình 1.7 Vòng đời của sâu tơ Plutella xylostella .....................................................30 Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả năng diệt sâu và độc tính của chế phẩm. .........................................................................................................................36 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Casein .........38 Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Lipit .........................40 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức trên đĩa thạch môi trường Chitin .........41 Hình 2.3 Bố trí các nghiệm thức kháng nấm trên đĩa thạch PDA ............................43 Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P. xylostella phẩm bằng phương pháp quét lá (Maureen và cộng sự, 2012). .................................................................................45 Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella của chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925). .....................................................56 Hình 3.2 Tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin (mg/ml). .....................................................................................................................58 Hình 3.3. Tỉ lệ nảy mầm của cải ngọt B. integrifolia sau khi ngâm chế phẩm ........59 Hình 3.4. Tỉ lệ nảy chết của cải ngọt B. integrifolia sau khi phun chế phẩm ..........60 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 ........................................................................................................63 5 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .................................15 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) ...................................................................................................................................19 Bảng 3.1 các enzyme ngoại bào trong canh trường lên men sau xử lí acid. ............52 Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 ...............................................52 Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp. ..................................................................53 Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp..............................................................54 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. ...........................................................54 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết của sâu tơ tuổi 3. .......................................................................56 Bảng 3.6 Độc tính của chế phẩm đối với cây cải ngọt sau 9 ngày thử nghiệm. .......61 Bảng 3.7 Tỉ lệ chết của cá sau 5 ngày thử nghiệm. ..................................................62 6 Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo thống kê của tổ chức Lương – Nông thế giới cho thấy: các loài cây trồng hiện nay phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Đây quả là một lực lượng hùng hậu tấn công cây trồng, gây tổn thất lớn cho mùa màng. Để giải quyết vấn đề trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại. Từ đó đã ra đời nền công nghiệp thuốc trừ sâu hóa học, diệt các mầm bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, người nông dân đã dùng thuốc hóa học với liều lượng quá mức cho phép, vô tình tạo cho côn trùng khả năng kháng thuốc, làm cho tình hình sâu hại trở nên nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, sâu tơ Plutella xylostella là loài sâu đa thực và gây hại nặng đến màu màng, chúng gây hại trên hầu hết các loại rau cải, đặc biệt có nhiều trên cây cải ngọt . Chúng có khả năng kháng thuốc hóa học nếu người dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học không đúng cách. Vì vậy, xu hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đã và đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, an toàn cho sức khỏe con người, đồng thời không gây ô nhiễm môi trường. Những năm gần đây, việc trích ly được hợp chất prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens có khả năng diệt sâu đã mở ra một triển vọng mới trong việc tạo chế phẩm trừ sâu sinh học là hợp chất thứ cấp của vi sinh vật. Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ có một vài đề tài nghiên cứu về hợp chất thứ cấp này mà chưa có nghiên cứu nào về ứng dụng tạo phẩm diệt sâu từ hợp chất prodigiosin hoặc đã nghiên cứu nhưng vẫn chưa hoàn thiện được sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học. Dựa trên cơ sở đó mà người thực hiện đề tài đã chọn hướng cho Đồ ÁN tốt nghiệp là: “Thử nghiệm chế phẩm diệt sâu tơ Plutella xylostella từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4” 2. Mục đích nghiên cứu 7 Đồ án tốt nghiệp Sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu chứa prodigiosin từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens SH4. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH4 Thử nghiệm tính an toàn sinh học của chế phẩm lên cây cải ngọt để đánh giá an toàn sinh học của chế phẩm. Thử nghiệm độc tính của chế phẩm lên ấu trùng Artemia nauplii và thủy sinh đại diện là cá bảy màu 4. Kết quả cần đạt được Khảo sát được ảnh hưởng của việc xử lý acid lên enzyme ngoại bào của vi khuẩn S.marcesscens trong dịch nuôi cấy. Khảo sát được hoạt tính của dịch nuôi cấy sau xử lý: kháng nấm, kháng sâu tơ. Khảo sát được độc học của vi khuẩn tác động lên ấu trùng A.nauplii. Khẳng định tính an toàn của chế phẩm trong việc ứng dụng chế phẩm ngoài thực tế. 8 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học. Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các hợp chất thứ cấp do vi sinh vật tiết ra ( thường là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (chất độc hoặc dầu thực vật). 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học trên thị trường hiện nay 1. NPV là chế phẩm trừ sâu hoạt lực cao, gồm 2 loại V- Ha và V- S1. Thuốc chuyên dùng để diệt trừ sâu xanh, sâu khoang, sâu xanh đốm trắng, sâu tơ trên các loại cây rau màu, cây công nghiệp, cây ăn quả với hiệu quả rất cao. NPV có nồng độ đặc hơn so với các loại thuốc khác, sử dụng tương đối dễ dàng: chỉ cần hoà thuốc vào bình và phun bình thường với liều lượng 1,0- 1,2 kg/ha. 2. Chế phẩm Bt: Gồm 2 loại: dạng sữa 4.000 IU/ml và dạng bột Biotox 16.000 IU/mg chuyên dùng trừ sâu tơ, sâu xanh hại rau, sâu kéo ra lá, các loại sâu thuộc họ Leptidopera. 3. Chế phẩm M&B có 2 loại: Metarhizium và Beauveria. Metarhizium anisopliae 1,6- 2,5 x 109Bt/gr bọ hại dừa. Thử nghiệm tại Đà Nẵng, Phú Yên đạt hiệu quả tới 86,5%. Dạng nấm xanh được dùng để trừ rầy, bọ xít trên lúa và cây ăn quả đạt 70- 90%, dạng nấm trắng đạt 50- 85%. Chế phẩm Beauveria chuyên dùng để trị sâu róm thông và sâu đo nâu hại bồ đề với hiệu quả tiêu diệt sâu tới gần 87%. TS. Nguyễn Văn Vấn cho biết: “Loại thuốc này có thể sử dụng để tiêu diệt sâu róm hại thông đang xảy ra tại Nghệ An hiện nay”. 4. Chế phẩm tuyến trùng EPN Biostar 15- 20 x 106 IJs trừ sâu xám hại thuốc lá, đặc biệt là mía đạt hiệu quả khá cao. Hiện những sản phẩm đầu tiên đã được đưa vào ứng dụng để diệt trừ sâu xám hại thuốc lá tại Ba Vì (Hà Tây), bọ hung hại mía tại Thạch Thành (Thanh Hoá). 9 Đồ án tốt nghiệp 5. Chế phẩm hoá sinh Momosertatin (MM) 2IU/lít trừ các loại sâu hại rau màu đạt 45- 50%. 6. Chế phẩm Ditacin 8% và Ketomium 1,5 x 106 Cfu/g, trừ bệnh hại trên cây ăn quả, cây lâu năm. (Nguyễn Văn Tấn, 2004) 1.1.3 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học Ưu điểm  Không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát dịch côn trùng.  Thời gian phân hủy trong tự nhiên nhanh chóng, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè…  Ngoài ra, các nguyên liệu để làm thuốc trừ sâu sinh học thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc như ớt, tỏi, hành, rừng... Chi phí sản xuất khi tự làm thuốc trừ sâu sinh học thấp hơn so với thuốc trừ sâu hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Hạn chế  Các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so với thuốc hóa học.  Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. 1.1.4 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học Abamectin Abamectin là thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, là hỗn hợp của Avermectin B1a (80%) và Avermectin B1b (20%) được phân lập từ quá trình lên men của vi khuẩn Streptomycin avermitilis được sử dụng phổ biến để phòng trừ sâu hại trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là rau, hoa, chè, lúa. Hoạt chất Abamectin được 97 công ty đăng ký với 534 loại thuốc thương phẩm, gồm 294 thuốc thương phẩm đơn chất Abamectin (Abatin 1.8 EC; Alfatin 1.8 EC; Binhtox 1.8 EC; Reasgant 1.8EC; Tervigo 020SC…) và 240 thuốc thương phẩm 10 Đồ án tốt nghiệp dạng hỗn hợp với các hoạt chất khác như Emamectin benzoate (Sieufatoc 36EC), Azadirachtin (Goldmectin 36EC), Alpha – cypermethrin (Shepatin 18EC), Acetamiprid (Acelant 4EC) dầu khoáng (Đầu trâu Bihopper 24.5EC), Bacillus thuringiensis var.kurstaki (Kuraba WP …) 1.1.4.1 Ưu điểm - Hoạt chất Abamectin có hiệu lực diệt sâu nhanh, mạnh, kéo dài và ít chịu tác động của điều kiện thời tiết. - Thuốc ít hình thành tính kháng của dịch hại, ít gây độc cho người sử dụng. - Phổ tác động rộng, trừ được nhiều loài sâu miệng nhai, miệng chích hút thuộc bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh đều như ruồi đục lá, sâu tơ, sâu xanh, bọ trĩ, nhện ở liều lượng 5,4 -25gai/ha trên nhiều loại cây trồng như rau họ thập tự, họ cà, cây ăn quả (cam, quýt, chè…), lúa. 1.1.4.2 Nhược điểm - Các loại thuốc hoạt chất Abamectin thuộc nhóm độc II, LD50 qua miệng 300 mg/kg, LD50 qua da > 1800 mg/kg, dễ kích thích da và mắt. Thời gian cách ly ngắn nhất là 3 ngày, phổ biến là 7 ngày. - Hoạt chất Abamectin có chỉ số tác động môi trường (EIQ 36,68) cao hơn so với nhiều hoạt chất khác, kể cả một số thuốc thuộc nhóm lân hữu cơ như Acephate (EIQ 24,88), Chlopyriphos( EIQ 26,85). - Thuốc thuộc nhóm độc II, thời gian cách ly tương đối dài (7 ngày), mức độ ảnh hưởng của thuốc đối với người phun thuốc, người tiêu dùng không lớn nhưng độc đối với cá và ong. Vì vậy, mặc dù đã được đăng ký phòng trừ sâu hại trên cây rau nhưng Abamectin không có trong Danh mục các hoạt chất thuốc BVTV khuyến cáo lựa chọn để sử dụng trên rau an toàn khi cần thiết (Ban hành kèm theo văn bản số 580/BVTVQLT ngày 17/4/2014 của Cục Bảo vệ thực vật). 11 Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.3 Cơ chế tác động Thuốc ngăn chặn chất truyền luồng thần kinh gamma aminobutyric acid (GABA) tại chỗ nối cơ thần kinh của côn trùng. Thuốc làm côn trùng ngừng ăn hoặc ngừng đẻ trứng ngay, chúng có thể chết sau vài ngày. 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát hiện Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, vào năm 332 trước công nguyên, những người lính trong quân đội Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dường như có “máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tượng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng. Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969), đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố như vậy được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bóng tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh được sử dụng trong Thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia marcescens. Tuy nhiên, điều này lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya), là người đầu tiên phát hiện và đặt tên Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều được bao phủ bởi một lớp vi sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia, theo tên nhà vật lý nổi tiếng người Italya đã phát minh ra tàu hơi nước là Serrati, tên loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta. 12 Đồ án tốt nghiệp Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens như một loại nấm, do ông nhìn thấy những đốm đỏ dưới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn. 1.2.2 Phân loại Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là Serratia marcescens. Theo Bizio (1823), Serriatia marcescens được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Serratia Loài: Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm của Serratia marcescens Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). 13 Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát được dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) Hình 1.2 Hình dáng và màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.4 Đặc điểm sinh lí Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens thường bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012). Vi khuẩn Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường thạch, tạo thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl. Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. 14 Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường hiếu khí và kỵ khí. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng và nhờ có các enzyme như superoxide dismutase, calatas, peroxides,…bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa. Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl Red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 15 Đồ án tốt nghiệp 12 Triple sugar iron Môi trường chuyển sang không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide - 14 Lysine decarboxylase + 15 Ornithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men sorbitol + 19 Lên men fructose - 20 Lên men xylose - 21 Lên men rhaminose - 22 Lên men lactose - 23 Lên men arabinose - 1.1.3.2 Đặc điểm phân bố Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông và Serratia marcescens chiếm 75%. Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế. Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bênh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng chết bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập (Francine và Patrick, 2006). Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001). Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo mới 16