Tài liệu Thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các Enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM (a)(a)(a)(a)(a) -------------- VŨ HOÀI NAM TÊN ĐỀ TÀI: THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC ENZYME XÚC TÁC CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP β- carotene TRONG VI KHUẨN Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2015 Thái Nguyên, 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -------------- VŨ HOÀI NAM TÊN ĐỀ TÀI THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC ENZYME XÚC TÁC CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP β- carotene TRONG VI KHUẨN Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 43-CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2015 Giảng viên hƣớng dẫn: 1 .TS. Dƣơng Văn Cƣờng 2. ThS. Ma Thị Trang Thái Nguyên, 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi đã nhân được sự giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành khóa luận: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo T.s Dương Văn Cường, người đã tận tình giúp đỡ hướng dẫn chỉ bảo, giải đáp thắc mắc và củng cố kiến thức cho tôi. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.S Ma Thị Trang, cán bộ phòng thí nghiệm công nghệ gene đã trực tiếp chỉ bảo kĩ năng làm việc, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm đã đào tạo và dạy dỗ tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá trình học tập nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 06 năm 2015 Sinh viên Vũ Hoài Nam ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Amp : Ampicillin Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ CoA : Coenzyme Acetoacetyl Cs : Cộng sự DNA : Deoxyribonucleic Acid E. coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetraaxetic acit IPTG : Isopropyl Thiogalactoside Kb : Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB : Laria Broth NCBI : Nation Cetrer for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Recation S. chromofuscus : Streptomyces chromofuscus TAE : Tris-acetate-EDTA UV : Ultraviolet X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside ROS : Reactive Oxygen Species RNS : Reactive Nitrogen Species iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Hàm lượng carotenoid có trong thực vật ........................................ 15 Bảng 3.1: Các thành phần của vector pRSET-A............................................. 27 Bảng 3.2: Các thành phần của vector pET22b(+) ........................................... 28 Bảng 3.3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài .................................... 31 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI và HindIII ............................ 36 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt với KpnI và EcoRI ................................ 36 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI và XbaI ................................ 37 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng gắn nối ........................................................ 39 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Công thức cấu tạo của β-carotene...............................................................4 Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A...........................................6 Hình 2.3: Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010 và dự kiến đến năm 2018. ...9 Hình 2.4: Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MAV .............................11 Hình 2.5: Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MEP ..............................12 Hình 2.6: Quá trình sinh tổng hợp carotenoids từ IPP và DMAPP ..........................13 Hình 2.7: Quá trình chuyển hóa phyopene thành lycopene.......................................13 Hình 2.8: Tổng hợp β-carotene từ lycopene .............................................................14 Hình 2.9: Sơ đồ tổng hợp β- carotene của BASF .....................................................16 Hình 2.10: Sơ đồ tổng hợp β-carotene của Roche ....................................................17 Hình 2.11: Quá trình chuyển hóa β-carotene dưới sự tham gia các gene Crt...........19 Hình 2.12: Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter.....................................20 Hình 2.13: Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pRSET .................................................22 Hình 2.14: Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pET ......................................................22 Hình 2.15: Tương tác giữa protein tái tổ hợp chứa 6xHis và giá thể Niken .............23 Hình 3.1: Cấu trúc vector biểu hiện pRSET .............................................................26 Hình 3.2: Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+) .........................................................28 Hình 3.3: Quy trình thiết kế vector pR-iEIBY ..........................................................33 Hình 3.4: Quy trình thiết kế vector pET22iEIBY. .....................................................34 Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pR-iEIY ................................41 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra sự có mặt của gene crtY...............42 Hình 4.3: Hình minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gen crtY trên vector pR-iEIY ..........43 Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra chiều gắn gene crtY trên pRiEIY ..........44 Hình 4.5: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pR-iEIBY .............................45 Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm cắt kiểm tra sự có mặt của gene crtB ..............46 Hình 4.7: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pET22-Y ................................47 Hình 4.8: Kết quả điện di chọn lọc dòng pET22-Y với enzyme EcoRI.....................47 v Hình 4.9: Hình minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gen crtY trên vector pET22-Y........48 Hình 4.10:Kết quả điện di kiểm tra chiều gắn crtY trên vector pET22-Y..................49 Hình 4.11: Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pET22-iEIBY ......................49 Hình 4.12: Kết quả điện di chọn lọc dòng pET-iEIBY với enzyme XbaI và EcoRI .........50 Hình 4.13: Hình minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn cụm gene iEIB trên vector pET22iEIBY .......51 Hình 4.14: Kết quả điện di kiểm tra chiều gắn cụm iEIB trên vector pET22-iEIBY ..........52 Hình 4.15: Kết quả biểu hiện vector pR-iEIBY trong chủng E. coli BL21 (DE3) ...53 Hình 4.16: Kết quả biểu hiện vector pET22iEIBY trong chủng E. coli BL21 (DE3) ....54 Hình 4.17: Kết quả so sánh so sánh biểu hiện của hai hệ vector pRSET-A và pET22b(+)...55 vi MỤC LỤC PHẦN 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2 Mục đích nghiên cứu ............................................................................................. 3 1.3 Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................. 3 1.4 Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................. 3 1.4.1 Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 3 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4 2.1 Khái quát về sắc tố β-carotene .............................................................................. 4 2.1.1 Cấu trúc và tính chất lý hóa................................................................................ 4 2.1.2 Vai trò của sắc tố β-carotene với con người ...................................................... 5 2.1.2.1 Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người ........................................ 5 2.1.2.2 Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp.................................................. 8 2.1.3 Con đường tổng hợp β-carotene ...................................................................... 10 2.1.4 Nguồn cung cấp β-carotene ............................................................................. 14 2.1.4.1 Nguồn cung từ thực vật ................................................................................. 14 2.1.4.2 Nguồn cung từ vi sinh vật ............................................................................. 15 2.1.4.3 Nguồn cung từ tổng hợp hóa học .................................................................. 16 2.1.5 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên ........ 18 2.2 Vi khuẩn E.coli và các hệ vector biểu hiện trong sản xuất protein tái tổ hợp. ... 19 2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp ..................... 19 2.2.2 Một số hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E. coli ................................. 21 2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ......................................................... 23 2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 23 2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................... 25 Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 26 3.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 26 3.1.1 Vi khuẩn ........................................................................................................... 26 3.1.2 Vật liệu ............................................................................................................. 26 3.1.2.1 Enzyme .......................................................................................................... 26 vii 3.1.2.2 Vector ............................................................................................................ 26 3.1.3 Hóa chất ........................................................................................................... 29 3.1.4 Dụng cụ ............................................................................................................ 31 3.1.5 Thiết bị ............................................................................................................. 31 3.1.6 Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 31 3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................................... 32 3.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 32 3.4 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 33 3.4.1 Phương pháp thiết kế in silico .......................................................................... 34 3.4.2 Phương pháp lập bản đồ giới hạn ..................................................................... 35 3.4.3 Phương pháp điện di DNA trong gel agarose .................................................. 37 3.4.4 Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose .................................................... 38 3.4.5 Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện ......................... 38 3.4.6 Phương pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả biến ................................................. 39 3.4.7 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt ...... 39 3.4.8 Phương pháp tách chiết DNA plasmid ............................................................. 40 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 41 4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY. ........................... 41 4.1.1. Kết quả gắn gene crtY vào vector pR-iEI tạo vector tái tổ hợp pR-iEIY ....... 41 4.1.2. Kết quả gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY .... 45 4.2 Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY. ............................... 46 4.2.1 Kết quả gắn gene crtY vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-Y ..... 46 4.2.2 Kết quả gắn cụm gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY............................................................................................................... 49 4.3. Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene. ..................................................... 52 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 56 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 56 5.2 Kiến nghị ............................................................................................................. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 57 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Carotenoid là một dạng sắc tố tự nhiên xuất hiện chủ yếu ở thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như nấm, tảo và một vài loại vi khuẩn (SchmidtDannert, 2000) [57]. Chúng có vai trò hình thành màu sắc cho cây, che chắn ánh sáng (Vershinin, 1999) [70] và có khả năng chống oxy hóa mạnh (Stahl and Sies, 2003) [63]. Ngày nay có khoảng 600 loại carotenoid được tìm thấy và 40 loại trong số đó là cần thiết cho chế độ dinh dưỡng của con người (Rao and Rao, 2007) [52]. β-carotene là sắc tố có màu vàng hoặc da cam, thuộc nhóm carotenoid. Chúng được tìm thấy ở một số loại cây như cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry, Netto et al. 1998) [18]. β-carotene được biết đến như một tiền chất để tổng hợp vitamin A – một loại vitamin rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al. 2003; Stutz, Bresgen et al. 2015) [35, 65]. Theo tổ chức WHO và FAO mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị mắc các bệnh về mắt mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu provitamin A trong khẩu phần ăn (Harjes, Rocheford et al. 2008) [26]. Ở động vật, β-carotene được sử dụng trong suốt quá trình sinh trưởng, chúng tham gia vào một loạt các quá trình sinh lý, sinh sản, phát triển biểu bì của mô, cấu trúc xương và tăng cường khả năng miễn dịch (Sklan, 1987) [60]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có tác dụng ngăn ngừa quá trình oxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc oxy tự do để bảo vệ tế bào và cơ thể, ngăn ngừa quá trình phát triển của tế bào ung thư, và các bệnh tim mạch (Igielska-Kalwat, Goscianska et al. 2015) [29]. Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng. Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018. Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD (chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11]. Để đáp ứng nhu cầu đó βcarotene được sản xuất theo hai con đường chính: Một là con đường tổng hợp hóa 2 học, hai là chiết xuất từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên (Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto et al. 2011, Vachali, Bhosale et al. 2012) [12, 69]. Sản phẩm β-carotene tổng hợp hóa học chỉ có chứa 1 đồng phân duy nhất, trong khi đó β-carotene tự nhiên không những có chứa β-carotene mà còn có α-carotene và γcarotene; do đó β-carotene tự nhiên có hoạt tính sinh học cao hơn 10% so với tổng hợp hóa học (Voutilainen, Nurmi et al. 2006; Baky. and El-Baroty. 2013) [71, 9]. Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng nguyên liệu. Vấn đề đặt ra là cần phải có phương pháp khác để tạo nguồn cung β-carotene tự nhiên. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cùng với ứng dụng các kĩ thuật di truyền đã giải quyết được các vấn đề nêu trên. Các nghiên cứu về tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp βcarotene đang gặt hái được những thành công nhất định. Năm 1990, Misawa và cộng sự tạo chủng sinh vật có khả năng sinh tổng hợp carotene, thành công đầu tiên trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa, Yamano et al. 1991) [45] và sau đó là trên Escherichia coli (Lee, Momen et al. 2003) [36]. Sự biểu hiện của các gene liên quan tới một loạt các yếu tố như: Hệ vector, promoter, chủng chủ; và các cơ chế phiên mã, dịch mã và sau dịch mã (Jana and Deb 2005) [32]. Vector là một trong những tiêu chí đầu tiên được quan tâm tới, theo lý thuyết một hệ vector có số bản sao cao sẽ làm tăng tần số mRNA và tăng năng suất biểu hiện protein tái tổ hợp (Camps 2010) [15]. Tuy nhiên, số lượng bản sao cao liệu có phải là tốt nhất? Theo nghiên cứu của Jones KL và cộng sự, một vài hệ vector có số bản sao thấp cũng có khả năng biểu hiện tương đương hoặc có phần tốt hơn so với một hệ vector có số bản sao cao (Jones, Kim et al. 2000) [33]. Bên cạnh đó, vị trí tiết cũng là một yếu tố quan trọng. Nếu protein lưu lại trong tế bào chất nó có thể trở nên không tan khi ở mức độ tổng hợp cao, dẫn đến sự hình thành các thể vùi. Việc thu hồi protein có hoạt tính sinh học từ những thể vùi này là rất khó 3 (Anupam Singh, Vaibhav Upadhyay et al. 2015) [6]. Nhằm giải quyết vấn đề này, ngày nay protein tái tổ hợp sẽ được gắn thêm một chuỗi tín hiệu tiết bằng cách đưa một trình tự mã hóa cho chuỗi tín hiệu đó lên vector biểu hiện. Chuỗi tín hiệu này được nhận biết bởi hệ thống tiết và được vận chuyển tới đúng nơi. Hiện nay, việc sản xuất các hợp chất carotenoid ở Việt Nam vẫn còn một vấn đề mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết từ thực vật và phân lập các chủng vi sinh vật sản xuất β-carotene ở quy mô nhỏ. Việc sử dụng các hợp chất β-carotene ở Việt Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất β-carotene tái tổ hợp. 1.2 Mục đích nghiên cứu Thiết kế thành công vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli. Kiểm tra ảnh hưởng của số bản copy tới năng suất biểu hiện β-carotene trong vi khuẩn E. Coli. 1.3 Mục tiêu nghiên cứu - Nội dung 1: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtEcrtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pRSET-A. - Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtEcrtI-crtB-crtY trên nền tảng vector pET22b(+). 1.4 Ý nghĩa của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về biểu hiện β-carotene trong E. coli sau này. 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất βcarotene mới, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu thực tiễn. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát về sắc tố β-carotene 2.1.1 Cấu trúc và tính chất lý hóa Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các loài thực vật, chúng có màu vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65-70 sắc tố tự nhiên và là một trong những hợp chất màu quan trọng nhất được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm. Carotenoid thường được chia làm hai nhóm: Thứ nhất là nhóm caroten hydrocacbon như là β-carotene, torulen và nhóm còn lại là xantophyl bị oxy hóa như astaxantin. Hiện nay, nhóm caroteonid đang được nghiên cứu rộng rãi, tiêu biểu trong đó phải kể đến β-carotene. Cấu trúc: β-carotene là một trong số hơn 600 loại caroteoid đã được tìn thấy trong tự nhiên. Chúng là một dẫn xuất isoprene chưa bão hòa bao gồm 40 nguyên tử cacbon và 56 nguyên tử hydro (C40H56) β-carotene có dạng tinh thể hình kim, trong cấu trúc có các nối đôi đơn xen kẽ tạo nên một chuỗi polyen (hình 2.1). Hình 2.1: Công thức cấu tạo của β-carotene Tính chất lý hóa: β-carotene là hợp chất có màu vàng cam, tan tốt trong dầu và các dung môi hữu cơ như aceton, etyl-ete, metanol, nhưng lại không tan trong nước. Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt độ. (Goodwin 1980) [23]. 5 2.1.2 Vai trò của sắc tố β-carotene với con người 2.1.2.1 Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người Hiện nay, β-carotene được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu bởi tác dụng hữu ích của nó đối với sức khỏe con người (Nagao 2009) [48]. β-carotene được biết đến như tiền chất vitamin A rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al. 2003) [35], bên cạnh đó chúng cũng có khả năng chống oxy hóa mạnh và ngăn ngừa một số bệnh ung thư. Vai trò là chất chống oxy hóa Gốc tự do là những phân tử bị thiếu hụt điện tích. Các gốc tự do này thường không cân bằng và rất dễ phản ứng. Chúng luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử từ các phân tử khác, các phân tử bị mất điện tích sẽ lại trở thành những gốc tự do mới. Quá trình này được gọi là quá trính oxy hóa và gốc tự do đó được gọi là chất oxy hóa. Chất oxy hóa tiêu biểu đến nay được phát hiện là ROS. ROS là một sản phẩm phụ của quá trình hô hấp và trao đổi chất trong cơ thể, đồng thời ROS cũng được kích thích sinh ra do các tác động của môi trường như tia UV hay tiếp xúc với nhiệt độ cao. ROS tích lũy có thể gây tổn thương tế bào và các phân tử sinh học như DNA, protein (Adetayo O. Omoni and Aluko 2005) [4]. Theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ROS tích lũy trong tế bào và cơ chế quá mức là nguyên nhân gây ra các bệnh thoái hóa như Alzheimer, ung thư, Parkinson, các bệnh mãn tính, bệnh tim mạch. Các chất chống oxy hóa là các chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa. Chúng ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do (Guerin, Huntley et al. 2003) [25]. Carotenoid đã được chứng minh là chất chống oxy hóa sinh học, bảo vệ tế bào và mô từ các tác hại của các gốc tự do (Maiani, Caston et al. 2009) [42]. Trong carotenoid, β-carotene có hiệu quả trong việc bảo vệ màng lipid của tế bào khỏi tác hại của các gốc tự do (Britton 1995) [14], bên cạnh đó cùng với một số nhóm carotenoid khác như lycopene có khả năng loại bỏ oxy tốt nhất, lutein và zeaxanthin có hiệu quả trong việc loại bỏ các gốc tự do là tăng tính toàn vẹn của tế bào (Smith 1998) [61]. 6 Tiền chất vitamin A β-carotene còn được biết đến với tên gọi là tiền chất vitamin A (Lampert, Holzschuh et al. 2003) [35]. Khi vào cơ thể, β-carotene bị phân cắt ở giữa mạch cacbon trung tâm tạo thành hai phân tử retinal bằng enzyme 15,15’dioxygenase (Biesalski, Chichili et al. 2007) [13]. Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzyme thành retinol. Retinol tạo thành có thể được hấp thu trực tiếp từ thức ăn vào thành ruột hay sẽ được vận chuyển nhờ liên kết với protein đến các cơ quan cần thiết hoặc đến gan là nơi tích lũy vitamin A dưới dạng retinyl este. Khi cơ thể cần, retinyl este được thủy phân thành retinol tự do và acid hữu cơ trước khi được hấp thụ. Quá trình thủy phân này được enzyme dịch tụy xúc tác, axit hữu cơ tạo thành thường là acid palmitat chiếm thành phần chủ yếu trong retinyl este thực phẩm. Quá trình chuyển hóa β-carotene thành vitamin A được kiểm soát chặt chẽ nên không tạo thành lượng dư thừa vitamin A có độc tính cao. Con người và động vật cần β-carotene trong suốt quá trình sinh trưởng của mình, song bản thân chúng lại không có khả năng tổng hợp được mà chủ yếu thu nhận qua con đường tiêu hóa (Fujisawa, Watanabe et al. 2008) [21]. Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A 7 Tăng cường thị giác Trong máu phân tử vitamin A dưới dạng retinol sẽ chuyển hóa thành retinal. Trong bóng tối, retinal kết hợp với protein opsin để tạo thành Rhodopsin – một sắc tố nhạy cảm với ánh sáng ở võng mạc mắt, giúp võng mạc nhận được các hình ảnh trong điều kiện thiếu sáng. Sau đó, khi ra sáng Rhodopsin lại bị phân hủy thành opsin và trans-retinal, rồi tran-retinal vào máu để trở lại cis-retinol (Wolf 2001) [72]. Bên cạnh đó, theo một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có khả năng làm chậm sự tiến triển của bệnh thoái hóa điểm vàng làm giảm thiểu các nguy cơ mù lòa (Snodderly 1995; Gordon and Schooff 2002) [62, 24]. Việc thiếu hụt vitamin A gây ra một loạt các thay đổi về sinh lý mà trong đó cơ quan bị ảnh hưởng nhiều nhất là mắt. Một trong những biểu hiện đầu tiên là sự suy giảm thị lực, điển hình như là bệnh quáng gà (khả năng nhìn giảm mạnh khi độ chiếu sáng thấp) (Roncone 2006) [56]. Giảm thiểu các bệnh về tim mạch Theo WHO, bệnh tim mạch đang là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở người trên toàn thế giới và chiếm nhiều nhất ở các nước đang phát triển. Mỗi năm, người chết do bệnh tim và đột quỵ nhiều hơn cả ung thư, lao, sốt rét và HIV cộng lại (Moran, Forouzanfar et al. 2014) [47]. Năm 1990, số ca tử vong do các bệnh tim mạch là 13,3 triệu ca chiếm 25,8%, đến năm 2013 con số này đã tăng lên 17,5 triệu người chiếm 31,5% tổng số ca tử vong trên toàn thế giới (Mendis, Shanthi; et al. 2014) [44]. Bệnh tim mạch bao gồm các bệnh suy tim, sơ vữa động mạch, động mạch vành và nhồi máu cơ tim (GBD 2015) [22]. Bệnh tim mạch được hình thành do sự tích lũy quá nhiều sản phẩm oxy hóa gây nên (Singh, Dhalla et al. 1995) [59], đặc biệt là quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) do ROS dẫn đến hình thành các mảng bám trên thành mạch gây sơ vữa thành mạch (Dhalla, Temsah et al. 2000) [19]. Tác động chính của β-carotene tới các bệnh tim mạch là chống lại quá trình oxy hóa, do β-carotene được vận chuyển trong các lipoprotein tỷ trọng thấp thông qua đó có thể trực tiếp ức chế quá trình oxy hóa của LDL (Reaven, Ferguson 8 et al. 1994) [53]. Chính vì thế, các chuyên gia thường khuyến các sử dụng các thực phẩm giàu carotene để phòng ngừa và chữa trị các bệnh về tim mạch. Ngăn ngừa bệnh ung thư Oxy là yếu tố không thể thiếu đối với cuộc sống. Khi các tế bào sử dụng oxy để tạo ra năng lượng, các sản phẩm phụ được tạo ra như là một hệ quả của ATP (adenosine triphosphate) sản xuất bởi các ty thể và lạp thể. Những sản phẩm phụ thường là chất oxy hóa (ROS) và các nitơ phản ứng (RNS). ROS và RNS đóng một vai trò kép vừa có lợi, vừa có hại đối với có thể. Ở mức độ thấp hoặc trung bình, ROS và RNS phát huy tác dụng có lợi trên các phản ứng của tế bào và chức năng miễn dịch. Ở nồng độ cao, chúng tạo ra sự căng thẳng oxy hóa có thể làm hỏng tất cả các cấu trúc tế bào gây nên các sai hỏng (Young and Woodside 2001, Lien Ai Pham-Huy, Hua He et al. 2008) [76, 39]. Những đột biến này thường xảy ra ở một tế bào hoặc một nhóm tế bào dẫn đến sự tăng lên không kiểm soát hình thành các khối U (Cooper GM 1992) [16]. β-carotene tác động mạnh mẽ vào tế bào ung thư do chúng điều khiển tăng trưởng của tế bào, điều hòa biểu hiện gene, và tác động lên các tế bào miễn dịch, hạn chế các sai khác bất thường dẫn tới sự phát triển không ngừng của tế bào ung thư. β-carotene tác động vào quá trình ung thư theo hai hướng: Một là chúng tác động vào quá trình oxy hóa tế bào do tính chất chống oxy hóa mạnh, hai là chúng tham gia vào quá trình biệt hóa và phân chia tế bào (Heller, Descamps et al. 1998) [27]. 2.1.2.2 Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp. β-carotene có tính chống oxy hóa mạnh giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa bệnh ung thư, các bệnh tim mạch và các bệnh mãn tính khác chính vì vậy chúng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm (Luis Carlos Mata-Gómez, Julio César Montanez et al. 2014) [40]. Trong đó, có hai mảng ứng dụng lớn là màu thực phẩm và thực phẩm bổ sung. Trong công nghiệp dược phẩm, β-carotene được sản xuất dưới dạng dược chất, sử dụng bổ sung ngoài chế độ ăn của con người. Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, β-carotene được thêm vào với tác dụng bảo vệ da chống lại tác hại của UV (Del Campo, 9 Moreno et al. 2000) [17]. Trong lĩnh vực màu thực phẩm, do có khả năng mang màu sắc nên β-carotene được sử dụng là chất bổ sung màu cho các thực phẩm tự nhiên như lòng đỏ trứng gà, thịt gà, cá. Đồng thời bên cạnh các thuộc tính màu sắc, β-carotene còn có tác dụng bảo quản thực phẩm, là nguồn cung cấp chất chống oxy hóa cho thực phẩm. Ngoài ra, sử dụng β-carotene từ nguồn vi tảo có thể tận dụng lượng chất khoáng có trong vi tảo để kích thích quá trình đồng hóa trong tế bào và cơ thể. Việc sử dụng β-carotene làm màu thực phẩm ngày nay rất phổ biến và không gây độc hại cho sức khỏe Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng. Theo báo cáo của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường dành cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018. Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11] (Hình 2.3). Hình 2.3: Biểu đồ khảo sát thị trƣờng carotenoid năm 2010 và dự kiến đến năm 2018. 10 Để đáp ứng nhu cầu đó, β-carotene được sản xuất bằng hai phương pháp: Đó là tổng hợp hóa học và chiết xuất từ tự nhiên. Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng β-carotene tổng hợp hóa học ở liều lượng cao có liên quan đến hiện tượng biến đổi nhiễm sắc thể, dẫn đến nguy cơ ung thư trong khi đó β-carotene tự nhiên lại có khả năng chống lại sự sai khác này do đó có khả năng ngăn ngừa ung thư. Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng nguyên liệu. Sự chênh lệch về giá giữa β-carotene tự nhiên (1000-2000 USD/kg) và β-carotene tổng hợp hóa học (400-800 USD/kg) (Tawfiq Abu-Rezq S., Suad Al-Hooti et al. 2010) [67] cũng luôn thôi thúc các nhà khoa học tìm ra con đường chuyển hóa β-carotene tự nhiên. 2.1.3 Con đường tổng hợp β-carotene Tất cả các carotenoid nói chung và β-carotene nói riêng quá trình sinh tổng hợp đều đi theo con đường isoprenoid. Con đường tổng hợp isotenoid được chia thành ba giai: (1) hình thành các đơn phân 5 cacbon (C5) gồm IPP và DMAPP, (2) giai đoạn hình thành các hợp chất C40, (3) thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoid để tạo thành β-carotene.  Giai đoạn một: Sinh tổng hợp các chất đầu tiên để đi đến DMAPP và IPP diễn ra theo 2 con đường riêng biệt: Con đường mevalonate (MAV) và con đường nonmevalonate (MEP). Sinh vật nhân chuẩn thường sử dụng con đường MAV để chuyển hóa acetylCoA thành IPP, tiếp theo là đồng phân hóa IPP thành DMAPP. Sinh vật nhân sơ trừ một số trường hợp ngoại lệ, thường sử dụng con đường MEP để sản xuất IPP và DMAPP qua phản ứng ngưng tụ đầu tiên giữa pyruvateandglyceraldehyde-3phosphate. Thực vật và Streptomycetes thì sử dụng cả hai con đường (Yoon, HyeMin Park et al. 2007) [74]. Con đƣờng MAV 11 Con đường MAV lần đầu tiên được phát hiện bởi Bloch và Lynen vào những năm 60 (Lynen, 1967) [41]. Trong con đường này, hai phân tử acetyl-CoA đầu tiên sẽ kết hợp lại với nhau để tạo thành acetoacetyl-CoA, sau đó một phân tử acetylCoA thứ ba được đưa vào thông qua liên kết cộng aldol để tạo thành beta-Hydroxybeta-methylglutaryl-CoA (HMG – CoA). Sau đó, dưới sự xúc tác của enzyme HMG –CoA reductase, HMG – CoA được chuyển hóa thành mevalonate. Mevalonate sau đó được phosphoryl hóa hai lần và decarbonxyl để tạo ra IPP (Isopentenyl pyrophosphate). IPP sau đó được đồng phân hóa thành một isoprene khác là DMAPP (Dimethylallyl pyrophosphate) nhờ sự xúc tác của enzyme IPP isomerase. Hình 2.4: Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đƣờng MAV Con đƣờng MEP Sau khi con đường MAV được khám phá, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện một số loại vi khuẩn như E. coli và S. chromofuscus có con đường sinh tổng hợp carotenoid không phụ thuộc vào mevalonate, con đường này được gọi là non-mevalonate hay còn gọi là MEP. Trong con đường này quá trình sinh tổng hợp