Tài liệu Thiết kế, sàng lọc một số dẫn xuất flavonoid và đánh giá hoạt tính gây độc lên dòng tế bào hela dựa vào các tính toán hóa lượng tử

LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án này là kết quả nghiên cứu thực sự của cá nhân dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phạm Văn Tất, trường Đại học Hoa Sen và PGS. TS. Trần Dương, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Huế. Luận án được thực hiện tại trường Đại học Khoa Học – Đại học Huế. Chưa từng có kết quả nghiên cứu tương tự được công bố dưới bất cứ hình thức nào trước khi thực hiện luận án. Một phần kết quả của công trình này đã được công bố trên: Tạp chí Hóa học và Ứng dụng, Tạp chí Hóa học, Tạp Chí Khoa học và Công nghệ trường Đại học Khoa học – Đại học Huế, Tạp chí Đại học Huế, Tạp chí Computational Chemistry, Cogent Chemistry, Taylor Francis, Tạp chí Organic & Medicinal Chemistry International Journal (OMCIJ), Tạp chí Natural products research. Ký tên Bùi Thị Phương Thúy i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Văn Tất, Trường Đại học Hoa Sen; PGS. TS. Trần Dương, Trường Đại học Sư Phạm Huế đã giao đề tài, hướng dẫn trực tiếp và truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báu, tận tình chỉ dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành luận án này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS.TS. Trần Thái Hòa, TS. Trần Xuân Mậu, TS. Nguyễn Thị Ái Nhung - Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa Học Huế. Các thầy cô đã giúp đỡ, động viên và chỉ dạy nhiều kiến thức quý báu trong quá trình em học tập tại trường. Em xin gửi lời cảm ơn các Thầy Cô trong Khoa Hóa, các Thầy Cô trong Khoa Sau đại học và toàn thể Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa Học Huế đã cho phép và tạo mọi thuận lợi cho em hoàn thành luận án này. Em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Phùng Văn Trung, TS. Hoàng Thị Kim Dung Viện Hoá học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em trong quá trình làm luận án. Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Nguyễn Hùng Huy, Khoa Hoá, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – ĐHQGHN đã giúp đỡ, tận tình chỉ dẫn em trong quá trình làm luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận án này. Ký tên Bùi Thị Phương Thúy ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA Phân tích phương sai ARE, % Giá trị tuyệt đối của sai số tương đối Bond Liên kết Cal Tính toán (Calculation) SKC Sắc kí cột COSY 1 d Đỉnh đôi (doublet) dd Mũi đôi của mũi đôi (duplet of duplet) DEPT Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) DMSO Dimethyl sulfoxide (CH3)2S=O Exp Thực nghiệm (Experiment) EtOAc Ethyl acetate (CH3COOC2H5) EtOH Ethanol (C2H5OH) E-State Trạng thái điện tử (electrotopological state) GI50 H-1H (Correlation Spectroscopy) Nồng độ thuốc ức chế 50% sự phát triển của tế bào gây ung thư (50% Growth Inhibition) pGI50 pGI50= -log(GI50) pGI50,exp Giá trị pGI50 thực nghiệm pGI50,pr Giá trị pGI50 dự đoán HMBC HSQC Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân (Heteronuclear Multiple Bond Vorrelation) Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân (heteronuclear single quantum coherence) HPV Vi rút u nhú ở người (Human Papillomavirus) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) iii LV Biến ẩn (Latent Variables) LogP Giá trị logarit hệ số phân tán Linear Tuyến tính m Mũi đa (multiplet) MM+ Phương pháp cơ học phân tử MM MARE, % Giá trị trung bình của ARE, % MSE Sai số trung bình bình phương (Mean Squared Error) MS Phổ khối (mass spectrometry) MetOH methanol (CH3OH) Nonlinear Phi tuyến tính NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OD Phương pháp đo mật độ quang (Optical Density) PCA Phân tích thành phần chính (Principal Components Analysis) PCR Hồi qui thành phần chính (Principal Components Regression) PLS Bình phương cực tiểu riêng phần (Partial Least Squares) QSPR QSAR QESAR QSDAR QSSR Q2 Quan hệ định lượng cấu trúc - tính chất (Quantitative Structure - Property Relationship) Quan hệ định lượng cấu trúc - hoạt tính (Quantitative Structure - Activity Relationship) Quan hệ định lượng giữa cấu trúc điện tử và hoạt tính sinh học (Quantitative Electronic Structure - Activity Relationship) Quan hệ định lượng giữa cấu trúc phổ NMR và hoạt tính sinh học (Quantitative Spectrum Data - Activity Relationship) Quan hệ định lượng cấu trúc - cấu trúc (Quantitative Structure - Structure Relationship) Hệ số tương quan đánh giá chéo (Cross-validation correlation coefficient) R2tr Hệ số tương quan R2 luyện R2pr Hệ số tương quan R2 dự đoán iv R2ad R2hiệu chỉnh Rf Hệ số lưu giữ (Retention Factor) SAR Quan hệ cấu trúc hoạt tính (Structure - Activity Relationship) s Đỉnh đơn (singlet) SRB Sulforhodamine B SK Sắc ký SKLM Sắc ký lớp mỏng t Mũi ba (triplet) TCA Trichloroacetic acid UV Phổ UV (Ultraviolet Spectroscopy) J (Hz) Hằng số ghép (Hz) (Coupling constant Hz) 1 H-NMR 13 C-NMR (ppm) QSARMLR (3.16) QSARMLR (3.17) QSARMLR (3.19) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon Nuclear Magnetic Resonance) Độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) tính bằng ppm QSARMLR phương trình 3.16 QSARMLR phương trình 3.17 QSARMLR phương trình 3.19 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Năng lượng tối thiểu (kcal/mol) của phân tử isoflavone (isofla-30)................................................. 63 Bảng 3.2 Tham số moment lưỡng cực (µ) của các flavonone và isoflavone ................................................... 65 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của loại biến độc lập đến giá trị R2tr............................................................................... 67 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của số biến độc lập đến giá trị R2tr, R2pr, SE................................................................... 67 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của số nơ ron ẩn đến giá trị R2tr ..................................................................................... 68 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của cấu trúc mạng đến giá trị R2tr và R2pr ....................................................................... 68 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của hàm truyền đến giá trị R2tr và R2pr ........................................................................... 69 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của moment và sai số luyện đến R2tr .............................................................................. 69 Bảng 3.9 Các mô hình tuyến tính QESARMLR (k = 2 - 10) và giá trị thống kê ................................................ 71 Bảng 3.10 Giá trị thống kê và các mô hình QESARMLR (với k = 5 - 7) ........................................................... 72 Bảng 3.11 Giá trị thống kê và giá trị đóng góp GMPmxi,% của nguyên tử trong các mô hình QESARMLR (với k = 5 – 7) .......................................................................................................................................................... 73 Bảng 3.12 pGI50 của nhóm kiểm tra dự đoán từ mô hình QESARMLR, QESARANN ........................................ 75 Bảng 3.13 Các mô hình QSDARMLR và các giá trị thống kê ........................................................................... 76 Bảng 3.14 Giá trị thống kê, các hệ số và phần trăm đóng góp của các độ dịch chuyển hóa học i trong các mô hình QSDARMLR .............................................................................................................................................. 77 Bảng 3.15 Hoạt tính pGI50,pr của các dẫn xuất kiểm tra và các giá trị ARE,% từ các mô hình QSDARMLR (với k = 7) và QSDARANN với kiến trúc I(7)-HL(2)-O(1) ....................................................................................... 79 Bảng 3.16 Mối tương quan của các hợp chất sử dụng mô tả điện tích nguyên tử............................................ 81 Bảng 3.17 Tính chất hóa lý và hoạt tính kháng ung thư pGI 50 của các hợp chất nghiên cứu bằng mô hình QSSRMLR và các chất dùng để dự đoán ........................................................................................................... 82 Bảng 3.18 Các mô hình QSARMLR (k từ 2 đến 10) với các giá trị R2, R2pred và MSE ...................................... 86 Bảng 3.19 Các giá trị thống kê và giá trị phần trăm đóng góp MPmxi,% và GMPmxi,% đối với các tham số mô tả phân tử 2D và 3D trong các mô hình QSAR MLR (với k là 8, 9 và 10) .......................................................... 87 Bảng 3.20 Hoạt tính sinh học pGI50 của nhóm kiểm tra từ các mô hình QSARMLR (3.16) và QSARANN(1) ..... 90 Bảng 3.21 Các mô hình QSARMLR (k từ 2 đến 10) với các giá trị R2, R2pred và MSE ...................................... 91 Bảng 3.22 Các giá trị thống kê và phần trăm đóng góp MPmxi,%, GMPmxi,% của các tham số mô tả phân tử 2D, 3D trong các mô hình QSARMLR (với k bằng 5, 6, 7) ............................................................................... 92 Bảng 3.23 Hoạt tính sinh học pGI50 của nhóm kiểm tra từ các mô hình QSARMLR (3.17), QSARPCR và QSARPCA-ANN ................................................................................................................................................... 95 Bảng 3.24 Các mô hình QSARMLR với các giá trị R2tr , SE và R2pr tương ứng .................................................. 97 Bảng 3.25 Các giá trị thống kê và phần trăm đóng góp MPmxi,%, GMPmxi,% của điện tích nguyên tử trong các mô hình QSARMLR..................................................................................................................................... 99 Bảng 3.26 Hoạt tính pGI50 trong nhóm kiểm tra dự đoán từ các mô hình QSARMLR (3.19), QSARPLS (3.20) và QSARANN(2) .................................................................................................................................................... 100 Bảng 3.27 Phần trăm gây độc tế bào GI50 (µg/ml) của các mẫu khảo sát trên dòng tế bào Hela ở các nồng độ khác nhau ....................................................................................................................................................... 112 vi Bảng 3.28 Giá trị GI50 (µg/ml) và pGI50 của các mẫu flavonoid khảo sát từ thực nghiệm in vitro ................ 113 Bảng 3.29 Hoạt tính pGI50 của các flavone và isoflavone mới được dự đoán từ mô hình QESARMLR và QESARANN..................................................................................................................................................... 114 Bảng 3.30 Hoạt tính pGI50 của flavone và isoflavone mới được thiết kế và dự đoán từ mô hình QSDAR MLR (M1) và QSDARANN (M2) ............................................................................................................................. 116 Bảng 3.31 Tính chất hóa lý và giá trị hoạt tính kháng ung thư pGI 50 của nhóm dẫn xuất flavone và isoflavone tương tự được nghiên cứu từ mô hình QSSRMLR ........................................................................................... 118 Bảng 3.32 Giá trị pGI50,pr từ 3 mô hình QSSRMLR, QSEARMLR và QSDARMLR ............................................ 119 Bảng 3.33 Nhiệt độ nóng chảy thực nghiệm và dự đoán từ mô hình QSSRMLR của các dẫn xuất flavonoid chiết xuất. ............................................................................................................................................................... 120 Bảng 3.34 Hoạt tính sinh học pGI50 của hai hợp chất phân lập ZZL1, ZZL2 từ các mô hình QSARMLR (3.16) và QSARANN(1) .............................................................................................................................................. 121 Bảng 3.35 Hoạt tính GI50 (µM) của 10 hợp chất mới nhận được từ mô hình QSAR ANN(1 ............................. 122 Bảng 3.36 Hoạt tính sinh học pGI50 của nhóm kiểm tra và hai hợp chất phân lập luteolin và daidzin từ các mô hình QSARMLR (3.18), QSARPCR và QSARPCA-ANN ....................................................................................... 123 Bảng 3.37 Hoạt tính kháng ung thư pGI50 của 5 hợp chất mới được dự đoán từ mô hình QSARPCA-ANN ) .... 124 Bảng 3.38 Hoạt tính pGI50 trong nhóm kiểm tra dự đoán từ các mô hình QSARMLR (3.19), QSARPLS (3.20) và QSARANN (2) .................................................................................................................................................. 125 Bảng 3.39 Hoạt tính kháng ung thư pGI50 của 5 hợp chất mới thiết kế bằng cách gắn nhóm thế vào vị trí C6, C3’ của quercetin, dự đoán từ mô hình QSARANN(2) ....................................................................................... 125 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Mối liên quan định lượng cấu trúc, tính chất, độ phản ứng, hoạt tính ................................................ 7 Hình 1.2 Giản đồ Venn mối liên quan định lượng cấu trúc và tác dụng [93] .................................................... 7 Hình 1.3 Mô hình hồi quy tuyến tính với (p = 2) [51, 66] .............................................................................. 15 Hình 1.4 Hồi quy đa biến thường với p = 2, N = 3 [51, 66] ............................................................................ 18 Hình 1.5 Ý nghĩa của hệ số hồi quy [51, 66]................................................................................................... 19 Hình 1.6 Giải thích F-test [51, 66] .................................................................................................................. 20 Hình 1.7 Hồi quy thành phần chính với p = 2, N = 3 [52, 107] ...................................................................... 24 Hình 1.8 Thành phần chính với p = 2 [51, 106] .............................................................................................. 27 Hình 1.9 Hồi quy PLS với p = 2, N = 3 [51, 106] ........................................................................................... 30 Hình 1.10 Sơ đồ giải thuật di truyền [10] ........................................................................................................ 34 Hình 1.11 Chọn lựa thế hệ cha mẹ (Pk) theo phương pháp bánh xe lăn [76] .................................................. 36 Hình 1.12 Chọn lựa thế hệ cha mẹ (Pk) theo phương pháp xếp hạng tuyến tính [76] ..................................... 36 Hình 1.13 Toán tử chéo đơn điểm [76] ........................................................................................................... 37 Hình 1.14 Toán tử chéo hai điểm [76] ............................................................................................................ 37 Hình 1.15 Hệ thống thần kinh sinh học tự nhiên ............................................................................................. 40 Hình 1.16 Hoạt động mạng thần kinh nhân tạo [50] ....................................................................................... 41 Hình 1.17 Cấu trúc mạng nơ ron [101] ........................................................................................................... 42 Hình 1.18 Quá trình học của mạng nơ ron [16] ............................................................................................... 43 Hình 1.19 Mô hình tính toán một nơ ron [69, 77] ............................................................................................ 44 Hình 1.20 Cấu khung flavonoid và quy ước đánh số [74] ............................................................................... 47 Hình 1.21 Một số dẫn xuất flavonoid [20, 74] ................................................................................................. 47 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát .............................................................................................................. 51 Hình 2.2. Nguyên liệu sử dụng phân lập flavonoid [2] ................................................................................... 54 Hình 2.3 Xây dựng các mô hình hồi quy đa biến ............................................................................................. 56 Hình 2.4 Quy trình phân lập các dẫn xuất flavonoid [3, 59] ........................................................................... 57 Hình 3.1 Sự giảm năng lượng phân tử theo mức gradient ............................................................................... 64 Hình 3.2 Ảnh hưởng của k đến R2 và SE.......................................................................................................... 67 Hình 3.3 Giá trị đóng góp trung bình toàn cục GMPmxi .................................................................................. 72 Hình 3.4 Mối tương quan giữa các hợp chất: a) sử dụng điện tích; b) sử dụng tính chất hóa lý ..................... 81 Hình 3.5 Quan hệ giữa tính chất hóa lý dự đoán và dữ liệu thực nghiệm ........................................................ 85 Hình 3.6 a) Hồi quy tuyến tính đa biến và b) giá trị pGI50 và pGI50,pred của flavonoid trong nhóm kiểm tra ... 88 Hình 3.7 Tính chất của các thành phần chính và tương quan giữa giá trị pGI 50 ............................................. 94 Hình 3.8 Cấu trúc phân tử CSL1, C12H20O11 ................................................................................................. 102 Hình 3.9 Cấu trúc phân tử AIL1, C15H10O7 ................................................................................................... 103 Hình 3.10 Cấu trúc POL1, C15H10O6 ............................................................................................................. 104 Hình 3.11 Cấu trúc phân tử của GML1, C21H20O9 ......................................................................................... 106 Hình 3.12 Cấu trúc phân tử của daidzin dưới dạng elipxoit với xác xuất 50% .............................................. 107 viii Hình 3.13 Cấu trúc phân tử của ZZL1, C16H12O6 .......................................................................................... 108 Hình 3.14 Cấu trúc phân tử của ZZL1 dưới dạng elipxoit với xác xuất 50% ................................................ 109 Hình 3.15 Cấu trúc phân tử của ZZL2 (C25H24O12) ....................................................................................... 110 Hình 3.16 Hoạt tính pGI50,pr dự đoán từ mô hình tuyến tính QESARMLR của các flavone, isoflavone mới và chất mẫu ......................................................................................................................................................... 113 Hình 3.17 Cấu trúc dược chất trong cây nghể (Polygonum hydropiper) [2] ................................................. 117 Hình 3.18 Cấu trúc dược chất trong cây hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) [2] ......................................... 117 Hình 3.19 Các giá trị pGI50 của hợp chất mới với hợp chất mẫu a) ZZL1, b) ZZL2 ..................................... 122 Hình 3.20 So sánh giữa các giá trị pGI50 của năm flavonoid mới với chất mẫu a) POL1; b) GML1 ............ 123 Hình 3.21 So sánh giữa các giá trị pGI50 của năm flavonoid mới với chất mẫu a) AIL1; b) CSL1 .............. 126 ix MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT........................................ iii DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ............................................................................... viii MỤC LỤC ..................................................................................................................x MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4 1.1. BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG........................................................................................... 4 1.1.1. Các nguyên nhân gây ung thư ......................................................................................... 4 1.1.2. Điều trị............................................................................................................................. 5 1.1.3. Phòng ngừa ...................................................................................................................... 6 1.2. LIÊN HỆ GIỮA CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH ....................................................................... 6 1.3. TÍNH TOÁN THÔNG TIN CẤU TRÚC .................................................................................. 9 1.3.1. Cơ học phân tử ................................................................................................................ 9 1.3.2. Cơ học lượng tử ............................................................................................................... 9 1.3.3. Phương pháp bán thực nghiệm ...................................................................................... 11 1.4. CÁC MÔ HÌNH TOÁN HỌC ................................................................................................ 12 1.4.1. Hồi quy đa biến ............................................................................................................. 12 1.4.2. Hồi quy thành phần chính.............................................................................................. 22 1.4.3. Bình phương tối thiểu riêng phần .................................................................................. 25 1.4.4. Giải thuật di truyền ........................................................................................................ 31 1.4.5. Mạng thần kinh nhân tạo (ANN) ................................................................................... 39 1.4.5.1. Khái niệm ............................................................................................................................. 39 1.4.5.2. Cấu trúc mạng ....................................................................................................................... 40 1.4.6. Thống kê đánh giá mô hình ........................................................................................... 45 1.4.7. Tính toán đóng góp của các tham số ............................................................................. 46 1.5. HỢP CHẤT FLAVONOID .................................................................................................... 46 1.5.1. Giới thiệu chung ............................................................................................................ 46 1.5.2. Phân loại dẫn xuất flavonoid ......................................................................................... 47 x 1.5.3. Phân bố flavonoid trong tự nhiên .................................................................................. 48 1.5.4. Hoạt tính sinh học của flavonoid ................................................................................... 48 1.6. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC FLAVONOID ....................................................... 50 1.6.1. Phân lập flavonoid ......................................................................................................... 50 1.6.2. Xác định cấu trúc flavonoid .......................................................................................... 50 1.6.3. Thử hoạt tính in vitro của flavonoid tự nhiên ................................................................ 50 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................51 2.1. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 51 2.2. CƠ SỞ DỮ LIỆU, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 52 2.2.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu thông tin phân tử ..................................................................... 52 2.2.2. Nguyên liệu và phương pháp......................................................................................... 52 2.2.2.1. Phần mềm ứng dụng ............................................................................................................. 52 2.2.2.2. Hóa chất, thiết bị................................................................................................................... 52 2.2.2.3. Nguyên liệu .......................................................................................................................... 53 2.3. NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT................................................................................................. 54 2.3.1. Phương pháp tính toán thông tin cấu trúc...................................................................... 54 2.3.1.1. Cơ học phân tử...................................................................................................................... 54 2.3.1.2. Hóa lượng tử ......................................................................................................................... 54 2.3.1.3. Các tham số cấu trúc ............................................................................................................. 55 2.3.2. Xây dựng các mô hình QSAR ....................................................................................... 55 2.4. SÀNG LỌC, PHÂN LẬP FLAVONOID TỰ NHIÊN ............................................................. 56 2.4.1. Phân lập các hợp chất flavonoid .................................................................................... 56 2.4.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid ........................................................ 58 2.4.2.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân ........................................................................... 58 2.4.2.2. Đo nhiễu xạ tia X đơn tinh thể .............................................................................................. 59 2.4.3. Kỹ thuật thử hoạt tính in vitro ....................................................................................... 59 2.4.3.1. Nguyên tắc phương pháp Sulforhodamine B ........................................................................ 59 2.4.3.2. Nuôi cấy tế bào ..................................................................................................................... 60 2.4.3.3. Nhuộm SRB .......................................................................................................................... 61 2.4.3.4. Xử lý kết quả ........................................................................................................................ 61 2.4.3.5. Xác định GI50 ........................................................................................................................ 61 2.5. THIẾT KẾ VÀ DỰ BÁO HOẠT TÍNH CỦA FLAVONOID .................................................. 62 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN ............................................................63 xi 3.1. NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT................................................................................................. 63 3.1.1. Tính toán thông tin cấu trúc........................................................................................... 63 3.1.1.1. Khảo sát phương pháp cơ học phân tử.................................................................................. 63 3.1.1.2. Khảo sát phương pháp hóa lượng tử ..................................................................................... 64 3.1.2. Tham số cấu trúc và tính chất phân tử ........................................................................... 65 3.1.2.1. Điện tích .............................................................................................................................. 65 3.1.2.2. Phổ 13C-NMR, 15O-NMR và độ dịch chuyển hóa học .......................................................... 66 3.1.2.3. Tham số hóa lý ..................................................................................................................... 66 3.1.2.4. Tham số hình học 2D, 3D ..................................................................................................... 66 3.2. XÂY DỰNG MÔ HÌNH QSAR .............................................................................................. 66 3.2.1. Khảo sát các biến số mô hình ........................................................................................ 66 3.2.2. Xây dựng các mô hình QESAR..................................................................................... 70 3.2.2.1. Mô hình tuyến tính QESARMLR ............................................................................................ 70 3.2.2.2. Mô hình mạng thần kinh QESAR ANN ................................................................................... 74 3.2.2.3. Kiểm tra khả năng dự đoán ................................................................................................... 75 3.2.3. Xây dựng các mô hình QSDAR .................................................................................... 75 3.2.3.1. Mô hình tuyến tính QSDARMLR ........................................................................................... 75 3.2.3.2. Mô hình mạng thần kinh QSDARANN ................................................................................... 78 3.2.3.3. Kiểm tra khả năng dự đoán ................................................................................................... 78 3.2.4. Xây dựng mô hình QSSRMLR ........................................................................................ 79 3.2.4.1. Nguyên tắc xây dựng ............................................................................................................ 79 3.2.4.2. Tính toán các tham số hóa lý ................................................................................................ 80 3.2.4.3. Xây dựng mô hình ................................................................................................................ 80 3.2.4.4. Kiểm tra khả năng dự đoán ................................................................................................... 84 3.2.5. Xây dựng mô hình QSARMLR (3.16) và QSARANN(1) ..................................................... 85 3.2.5.1. Dữ liệu .................................................................................................................................. 85 3.2.5.2. Xây dựng mô hình QSARMLR (3.16) .................................................................................... 85 3.2.5.3. Xây dựng mô hình QSARANN(1) ............................................................................................ 89 3.2.5.4. Khả năng dự đoán của mô hình QSAR MLR (3.16) và QSARANN(1) ........................................ 90 3.2.6. Xây dựng mô hình QSARMLR (3.17), QSARPCR (3.18) và QSARPCA-ANN ...................... 91 3.2.6.1. Dữ liệu .................................................................................................................................. 91 3.2.6.2. Xây dựng mô hình QSARMLR (3.17), QSARPCR (3.18) ......................................................... 91 3.2.6.3. Xây dựng mô hình QSARPCA-ANN ......................................................................................... 94 3.2.6.4. Khả năng dự đoán của các mô hình ...................................................................................... 95 xii 3.2.7. Xây dựng mô hình QSARMLR (3.19), QSARPLS (3.20) và QSARANN(2) ......................... 96 3.2.7.1. Dữ liệu .................................................................................................................................. 96 3.2.7.2. Xây dựng mô hình QSARMLR (3.19) và QSARPLS (3.20) ..................................................... 96 3.2.7.3. Xây dựng mô hình QSARANN(2) ............................................................................................ 99 3.2.7.4. Dự đoán hoạt tính sinh học của các hợp chất mới .............................................................. 100 3.3. SÀNG LỌC, PHÂN LẬP FLAVONOID TỰ NHIÊN ........................................................... 101 3.3.1. Phân lập cynaroside từ actiso ...................................................................................... 101 3.3.2. Phân lập quercetin từ xa kê ......................................................................................... 102 3.3.3. Phân lập luteolin từ tía tô............................................................................................. 103 3.3.4. Phân lập daidzin từ đậu nành....................................................................................... 105 3.3.4.1. Xác định cấu trúc daidzin bằng phương pháp NMR........................................................... 105 3.3.4.2. Xác định cấu trúc phân tử daidzin bằng phương pháp đo nhiễu xạ tia X ........................... 106 3.3.5. Phân lập kaempferol-3-O-methylether từ gừng gió..................................................... 107 3.3.5.1. Xác định cấu trúc kaempferol-3-O-methylether bằng phương pháp NMR ........................ 107 3.3.5.2. Xác định cấu trúc kaempferol-3-O-methylether bằng phương pháp đo nhiễu xạ tia X ...... 109 3.3.6. Phân lập kaempferol-3-O-(2,4-O-diacetyl-alpha-L-rhamnopyranoside) từ gừng gió . 110 3.3.7. Thử hoạt tính sinh học in vitro của các hợp chất flavonoid tự nhiên .......................... 111 3.4. THIẾT KẾ VÀ DỰ BÁO HOẠT TÍNH CÁC FLAVONOID ................................................ 113 3.4.1. Mô hình QESAR ......................................................................................................... 113 3.4.2. Mô Hình QSDAR ........................................................................................................ 115 3.4.3. Mô hình QSSRMLR ....................................................................................................... 116 3.4.4. Mô hình QSARMLR (3.16) và QSARANN (1) ................................................................ 121 3.4.5. Mô hình QSARMLR (3.17), QSARPCR và QSARPCA-ANN ............................................... 123 3.4.6. Mô hình QSARMLR (3.19 ), QSARPLS (3.20) và QSARANN(2) ...................................... 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................127 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ...............................................................................129 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................131 PHỤ LỤC ...............................................................................................................144 xiii MỞ ĐẦU Các phương pháp phòng và trị bệnh ung thư hiện nay như phẫu thuật, xạ trị, hóa trị. Tuy nhiên các phương pháp này vẫn có những tác dụng phụ nhất định đối với bệnh nhân. Nhu cầu về dược chất kháng ung thư có khả năng phòng và trị bệnh đang rất lớn nhưng khả năng đáp ứng còn hạn chế [70, 71]. Các nhà khoa học, dược học đã và đang quan tâm nghiên cứu, tìm kiếm các loại dược chất mới. Trong đó nhóm flavone, isoflavone nói riêng là nhóm dược chất có nhiều trong thực vật với hoạt tính kháng oxi hóa, kháng ung thư, kháng viêm, … hiệu quả [45, 104]. Các nghiên cứu thực nghiệm trên thế giới và Việt Nam đã cung cấp một cơ sở dữ liệu quý giá về nguồn dược chất trong tự nhiên, nhưng các nghiên cứu thực nghiệm thuần túy còn nhiều hạn chế để tạo ra hợp chất có hoạt tính kháng ung thư hiệu quả, nhanh chóng, kinh tế [41, 42]. Các nghiên cứu lý thuyết trên thế giới nói chung, trong nước nói riêng về nhóm flavone và isoflavone có hoạt tính kháng ung thư cổ tử cung còn khá khiêm tốn [90, 103]. Nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính nhằm thiết kế các dẫn xuất flavone, isoflavone mới có hoạt tính được cải thiện; các nghiên cứu lý thuyết là rất cần thiết để thúc đẩy và làm tiền đề cho các nghiên cứu thực nghiệm, nhằm tìm kiếm các dược chất kháng ung thư hiệu quả [80, 90]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các thông tin mô tả cấu trúc điện tích nguyên tử, độ dịch chuyển hóa học, tính chất hóa lý, tham số 2D và 3D của phân tử kết hợp các kỹ thuật phân tích hồi quy, mạng nơ ron, phân tích thành phần chính, giải thuật di truyền, bình phương cực tiểu riêng phần để xây dựng các mối quan hệ định lượng cấu trúc - hoạt tính (QSAR) [89]. Các flavonoid được xây dựng và tối ưu hóa bằng các phương pháp cơ học phân tử MM+. Các tham số mô tả phân tử 2D, 3D được sử dụng để xây dựng các mô hình đa biến như hồi quy tuyến tính đa biến (MLR), phân tích thành phần chính (PCR), bình phương cực tiểu riêng phần (PLS) và mạng nơ ron nhân tạo (ANN) [80, 90]. Xây dựng các mô hình QSAR nhằm xác định những yếu tố tham số mô tả phân tử ảnh hưởng đến tác dụng kháng ung thư cổ tử cung từ đó xác định hướng thiết kế phân tử mang lại hoạt tính cao hơn [86, 90, 103]. Trong nghiên này cũng đã tiến hành chiết tách và phân lập flavonoid 1 từ gừng gió, đậu nành, tía tô, xa kê, actiso, một vài kỹ thuật phân tích hóa lý cũng được sử dụng để xác định cấu trúc phân tử các dẫn xuất flavonoid. Các phân tử flavonoid đã phân lập sẽ được dự báo hoạt tính, và sử dụng làm chất mẫu để thiết kế hợp chất mới có hoạt tính cao hơn. Từ các cơ sở trên, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Thiết kế, sàng lọc một số dẫn xuất flavonoid và đánh giá hoạt tính gây độc lên dòng tế bào Hela dựa vào các tính toán hóa lượng tử”. Mục tiêu của luận án Tính toán, sàng lọc các tham số mô tả phân tử gồm: tham số điện tích, độ dịch chuyển hóa học, tính chất hóa lý, tham số 2D, 3D của các dẫn xuất flavonoid. Xây dựng các mô hình quan hệ cấu trúc – hoạt tính có khả năng dự đoán hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất flavone và isoflavone có cấu trúc tương tự. Sàng lọc, phân lập, xác định cấu trúc và thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng ung thư 6 hợp chất flavonoid từ actiso, xa kê, đậu nành, tía tô, gừng gió. Thiết kế, sàng lọc các dẫn xuất flavone và isoflavone và đánh giá hoạt tính kháng ung thư cổ tử cung cũng như các tính chất hóa lý của các dẫn xuất flavonoid mới thiết kế từ flavonoid mẫu. Ý nghĩa khoa học của luận án Nghiên cứu này đã sử dụng các tính toán lý thuyết và xây dựng các mối quan hệ định lượng cấu trúc - hoạt tính (QSAR). Các flavone và isoflavone được xây dựng và tối ưu hóa bằng các phương pháp cơ học phân tử MM+. Điện tích nguyên tử, độ dịch chuyển hóa học, các tính chất hóa lý và các tham số mô tả phân tử 2D, 3D từ các phương pháp lý thuyết được sử dụng để xây dựng các mô hình đa biến như hồi quy tuyến tính đa biến (MLR), hồi quy thành phần chính (PCR), hồi quy bình phương cực tiểu riêng phần (PLS) và mạng nơ ron nhân tạo (ANN). Các kỹ thuật thực nghiệm chụp cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng và kỹ thuật đo nhiễu xạ tia X đơn tinh thể cũng được sử dụng để xác định cấu trúc phân tử các dẫn xuất flavonoid chiết xuất. Các mô hình QSAR được xây dựng nhằm xác định được những vị trí nguyên tử ảnh hưởng đến tác dụng kháng ung thư cổ tử cung từ đó xác định vị trí tác dụng mạnh để xem xét gắn nhóm thế nhằm tạo ra hợp chất mới và chọn lựa được những 2 hợp chất có hoạt tính cao. Ngoài ra với kỹ thuật QSAR có thể xây dựng các mô hình khác nhau để dự đoán các tính chất hóa lý khác của các hợp chất. Từ công trình này, có thể ứng dụng phương pháp, kết quả nghiên cứu trong các nghiên cứu thực nghiệm, lý thuyết với sự hỗ trợ của công nghệ máy tính nhằm giảm thiểu đáng kể chi phí cho các nghiên cứu thực nghiệm. Kết quả nghiên cứu của luận án mở ra hướng nghiên cứu mới, phù hợp với định hướng nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam. Đây là cơ sở khoa học để áp dụng trong thiết kế, sàng lọc các hợp chất hữu cơ có cấu trúc tương tự, đồng thời dự đoán hoạt tính sinh học và các tính chất hóa lý của hợp chất làm tiền đề cho các quá trình thực nghiệm một cách hiệu quả. Những đóng góp mới của luận án Công trình này xác định được cấu trúc và thử hoạt tính pGI50 in vitro đối với 6 hợp chất flavonoid phân lập từ lá tía tô, lá xa kê, lá actiso, hạt đậu nành và củ gừng gió. Đã tính toán và sàng lọc các tham số mô tả cấu trúc phân tử như tham số điện tích, tham số độ dịch chuyển hóa học, tham số 2D, 3D ảnh hưởng chính đến hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất flavonoid. Đã xây dựng và đánh giá thành công khả năng dự báo của các mô hình QSAR. Các mô hình QESAR, QSDAR, QSSR, QSARNMR, QSARANN, QSARPCA-ANN, QSARPCR, QSARPLS đã dự đoán được hoạt tính kháng ung thư và tính chất hóa lý của các hợp chất mới được thiết kế từ các chất mẫu và hợp chất tự nhiên. Hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất mới tốt hơn hoạt tính kháng ung thư của chất mẫu, hợp chất phân lập từ gừng gió, đậu nành, tía tô, xa kê, actiso. Như vậy, việc tiến hành nghiên cứu xây dựng các mô hình QSAR trong nghiên cứu này là một định hướng hữu ích trong nghiên cứu tìm kiếm và tổng hợp các flavonoid khác nhau từ tự nhiên. Cấu trúc của luận án gồm các phần sau - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Kết luận và kiến nghị - Danh mục các công trình liên quan đến luận án - Tài liệu tham khảo 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 1.1.1. Các nguyên nhân gây ung thư Ung thư là một tập hợp các bệnh liên quan đến sự phân chia tế bào một cách mất kiểm soát, tiếp theo là quá trình các tế bào đó xâm lấn và di căn đến các mô khác qua hệ thống bạch huyết và máu [6]. Giai đoạn di căn là nguyên nhân chính gây tử vong của bệnh nhân ung thư. Hiện nay có trên 100 bệnh ung thư có loại từ bắp thịt và xương, có loại từ da hoặc lớp lót của các cơ quan, có loại xuất phát từ máu. Ở nam giới thường gặp ung thư phổi, gan, đại trực tràng, dạ dày, vòm hầu, thanh quản, thực quản, tuyến tiền liệt, ung thư máu [58, 70]. Ở nữ giới thường gặp ung thư vú, cổ tử cung, đại trực tràng, phổi, tuyến giáp, buồng trứng, gan, dạ dày, thân tử cung, da [70]. Ung thư làm cho cơ thể bệnh nhân tử vong bằng nhiều cách, nhưng đa số là làm cho cơ thể suy kiệt với các bệnh cơ hội. Trong đó, bệnh ung thư cổ tử cung hình thành ở biểu mô cổ tử cung (cổ tử cung là cơ quan nối giữa âm đạo với buồng trứng) [57, 96]. Ung thư cổ tử cung bắt đầu ở niêm mạc cổ tử cung, tại đây các tế bào phát triển bất bình thường và khó kiểm soát dẫn đến hình thành khối u. Phụ nữ trong độ tuổi từ 30 đến 59 thường dễ mắc bệnh hơn cả. Đây là căn bệnh có thể điều trị và phòng ngừa nếu phát hiện sớm [96, 112]. Triệu chứng biểu hiện bệnh: âm đạo xuất huyết bất thường, có mùi khó chịu, cơ thể bệnh nhân gầy gò, da trắng bệch, cơ thể đau nhức [32]. Điều trị bệnh: tuỳ theo giai đoạn phát triển của bệnh mà được điều trị theo phác đồ khác nhau: giai đoạn 1 ung thư khu trú tại cổ tử cung; giai đoạn 2 ung thư xâm lấn vùng lân cận; giai đoạn 3 ung thư xâm lấn xa hơn; giai đoạn 3 di căn sang các bộ phận khác của cơ thể [96]. Giai đoạn 1 và 2: chỉ cần mổ và chiếu xạ thì khả năng khỏi bệnh sẽ rất cao, tỉ lệ khỏi bệnh là 80 – 90%. Giai đoạn 3 và 4 chủ yếu là xạ trị, tỉ lệ khỏi bệnh rất thấp từ 3 – 25 %, tuỳ theo mức độ nặng hay nhẹ của bệnh [96]. 4 Các yếu tố bên ngoài gây bệnh ung thư bao gồm: các tia X, chất phóng xạ, tia cực tím, hóa chất gây hư hại cấu trúc gen di truyền. Các sản phẩm công nghiệp như: amiăng gây ung thư phổi; polivinylclorua gây ung thư gan; nitrosamin gây ung thư bao tử; các phẩm màu trong bánh kẹo, hay một số sản phẩm trong thuốc nhuộm tóc, các hoá chất kích thích trong chăn nuôi nhiễm estrogen cũng gây ung thư; thuốc ngừa thai và các chất kích thích nội tiết tố như DES (diethylstilbestrol) có khả năng gây ung thư; thuốc trừ sâu, rầy như DDT cũng có khả năng gây ung thư [23, 99]. Ô nhiễm không khí: các hoá chất gây ô nhiễm không khí như CO 2, hidrocacbon, benzopiren, bụi amiăng, khói thuốc lá gây ung thư phổi [70]. Ngoài ra còn có độc tố của nấm mốc chứa aflatoxin có trong nấm Aspergillus gây ung thư [26]. Các yếu tố do lối sống có thể là nguyên nhân gây bệnh ung thư như các hoá chất trong thuốc lá gây ung thư phổi, rượu gây ung thư thực quản; chế độ ăn gây ung thư: ăn nhiều mỡ động vật, bơ, ăn nhiều calo, ăn thiếu chất xơ, uống rượu, hay sử dụng thực phẩm không an toàn là nguyên nhân gây ung thư [23, 62]. Yếu tố sinh học gây ung thư thể hiện ở một số ít căn bệnh ung thư ở người được cho là do vi rút như ung thư gan, ung thư vòm họng, ung thư cổ tử cung [26]. Yếu tố di truyền gây ung thư chiếm tỉ lệ thấp, một số loại như ung thư mắt, ung thư vú, có khuynh hướng dễ gặp trong cùng một gia đình. Tuy nhiên, yếu tố di truyền không có tầm quan trọng về mặt thực tiễn [62]. 1.1.2. Điều trị Một số liệu pháp chính trong điều trị ung thư: phẫu trị là dùng lưỡi dao mổ để loại bỏ tận gốc khối u; xạ trị là phương pháp sử dụng dùng tia phóng xạ tàn tiêu diệt các tế bào ung thư; hoá trị là dùng hoá chất để tiêu diệt tế bào ung thư; liệu pháp miễn dịch là liệu pháp tăng cường khả năng đề kháng tự nhiên của cơ thể để kháng lại sự phát triển của tế bào ung thư [23, 58]. Phẫu thuật và xạ trị có ưu điểm là tấn công mạnh các loại ung thư thời kì còn khu trú, nhưng phương pháp này không hiệu quả khi ung thư di căn trên cơ thể người bệnh. Đối với phương pháp hoá trị chỉ cho kết quả tạm thời và không hiệu 5 quả. Liệu pháp miễn dịch chưa được nghiên cứu chuyên sâu nên chỉ là phương pháp bổ trợ trong điều trị bệnh [58, 96]. 1.1.3. Phòng ngừa Biện pháp phòng ngừa ung thư bao gồm một số biện pháp như: Giảm thiểu việc tiếp xúc với thuốc lá, rượu, hoá chất công nghiệp; thực hiện các biện pháp bảo vệ cơ thể chặt chẽ khi tiếp xúc với tia phóng xạ; ngừa ung thư qua việc chọn lựa chế độ ăn uống an toàn như không nên ăn một số thức ăn được khuyến cáo có thể gây ung thư, thức ăn có chứa các hóa chất nguy hiểm và các hormon; khám sức khoẻ định kỳ, tầm soát ung thư sớm đều đặn; tiêm vacxin ngừa ung thư; lối sống lành mạnh [47, 99]. 1.2. LIÊN HỆ GIỮA CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH Liên hệ giữa cấu trúc – hoạt tính là nguyên tắc cơ bản nhất để xây dựng các mô hình quan hệ cấu trúc – hoạt tính (QSAR) hay mô hình quan hệ cấu trúc – tính chất (QSPR), mô hình quan hệ cấu trúc - cấu trúc để dự đoán tính chất vì cấu trúc – tính chất - hoạt tính có mối quan hệ biện chứng với nhau, là các mối liên hệ nhân – quả có thể được tính toán một cách chính xác và thiết lập theo những mô hình toán học rõ ràng [17, 93]. Theo Testa và Kier, quan hệ định lượng cấu trúc – tác dụng là tổng hòa các mối quan hệ thể hiện trên Hình 1.1. Trên cơ sở này nhiều kiểu mô hình được xây dựng với các thông tin về cấu trúc khác nhau. Mô hình tổng quát dạng QSXR: X có thể là A – hoạt tính (Activity); tính chất – P (Property); cấu trúc – S (Structure) [17, 93]. Cấu trúc – tính chất không phải lúc nào cũng được phân định rõ ràng, nên mối liên quan giữa chúng được biểu hiện bằng phần giao trên giản đồ Venn, Hình 1.2 [17, 93]. Tính chất – tác dụng có thể là một trong một số trường hợp nên mối liên quan giữa tính chất và tác dụng cũng được diễn tả bằng giản đồ Venn có phần giao. Cấu trúc – hoạt tính có sự phân định rõ ràng nên mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng, điều này được mô tả bởi hai vòng tròn không có phần giao nhau mà tiếp xúc tại một điểm. 6 Hoạt tính Tính chất Dữ liệu cấu trúc Sàng lọc dữ liệu QSXR X=aixi + b0 Mô hình phân tử Hình 1.1 Mối liên quan định lượng cấu trúc, tính chất, độ phản ứng, hoạt tính Tính chất Cấu trúc Tác dụng Hình 1.2 Giản đồ Venn mối liên quan định lượng cấu trúc và tác dụng [93] Theo quan điểm hóa học, một phân tử có tác dụng sinh học mang hai nhóm chức: nhóm tác dụng (thường có cấu tạo đặc biệt) và nhóm ảnh hưởng (thường là các nhóm có khả năng thay đổi tính chất lý hóa của phân tử như hydroxyl, halogen, carboxyl, nitro, ...) [17, 93]. Theo quan điểm sinh hóa, một phân tử có tác dụng sinh học có 2 thành phần chính: Khung phân tử đặc trưng cho tính chất lý hóa, còn nhóm chức quyết định hoạt tính sinh học [17, 93]. Theo quan điểm hiện đại, phân tử hợp chất là một thể thống nhất (gồm các nguyên tử tạo khung phân tử, nhóm chức...). Tác dụng sinh học không những do 7