Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Thiết kế quy trình phân tích alpha lipoic acid trong một số thực phẩm chức năng...

Tài liệu Thiết kế quy trình phân tích alpha lipoic acid trong một số thực phẩm chức năng

.PDF
88
28
110

Mô tả:

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA --------------- BÙI MINH ĐỨC THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC Đà Nẵng 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA --------------- BÙI MINH ĐỨC THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành : Kỹ thuật hóa học Mã số : 8520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Diệu Hằng Đà Nẵng 2019 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu và tổ chức thí nghiệm dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Diệu Hằng. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS. Nguyễn Thị Diệu Hằng, Phó trưởng phòng Đào tạo Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý cho tôi những kiến thức quý báu và chỉ ra những thiếu xót để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Các thầy cô giảng viên khoa Hóa, phòng Đào tạo Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã tham gia giảng dạy, hổ trợ những kiến thức nền, góp ý phản biện bảo vệ đề tài này. Viện An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc gia đã tổ chức đánh giá so sánh liên phòng giúp đề tài nghiên cứu có độ chính xác và tin cậy cao hơn. Trung Tâm Kiểm Nghiệm Thuốc, Mỹ Phẩm, Thực Phẩm Quảng Ngãi và các anh chị trong Khoa Mỹ Phẩm – Thực phẩm đã giúp đỡ, hỗ trợ chia sẻ những khó khăn với tôi trong công việc. Và cuối cùng tôi xin chúc các quý thầy cô và các tổ chức; cá nhân ở trên lời chúc sức khỏe và thành công. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Diệu Hằng. Các số liệu, kết quả nên trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Bùi Minh Đức TÓM TẮT LUẬN VĂN THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Học viên: Bùi Minh Đức Chuyên Ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 8520301 Khóa: 2017-2019 Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN Tóm tắt - Alpha Lipoic Acid (ALA) là một trong những chất chống oxy hóa hiện diện tự nhiên trong tất cả các tế bào nhân sơ và sinh vật nhân thực. ALA có chức năng tổng hợp nội sinh là một trong yếu tố tạo thành cho một số phức hợp enzyme quang trọng trong ty thể. Do đặc tính chống oxy hóa độc đáo của nó, nó đã được sử dụng trong nhiều bệnh liên quan đến mất cân bằng oxy hóa và thường có sẵn trên thị trường dưới dạng thực phẩm bổ sung. Mục đích của công việc nghiên cứu hiện tại là xây dựng và tối ưu phương pháp phân tích để xác định hàm lượng ALA trong thực phẩm bổ sung khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Thiết kế quy trình phân tích bao gồm: Điều kiện sắc ký HPLC; Điều kiện sử lý mẫu; Đánh giá xác nhận giá trị của phương pháp; Thử nghiệm thành thạo hay so sánh liên phòng; Phân tích mẫu ở địa phương. Tác giả đã tóm tắt các kết quả đạt được và đưa ra các hướng phát triển tiếp theo. Từ khóa - Alpha Lipoic Acid (ALA); Đánh giá phương pháp; So sánh liên phòng; Tối ưu phương pháp; Điều kiện sử lý mẫu. DESIGN OF ALPHA LIPOIC ACID ANALYSIS PROCESS IN SUPPLEMENTS FOOD Abstract - Alpha Lipoic Acid (ALA) is a universal antioxidant present naturally in all prokaryotic and eukaryotic cells. Endogenously synthesized ALA functions as a cofactor for several important mitochondrial enzyme complexes. Due to its unique antioxidant properties, it has been administered in many oxidative stress related diseases and is also commercially available in the form of supplements food. The aim of the present research work was to build and optimal analytical method to determine ALA content in various supplement food using high performance liquid chromatography (HPLC). Analysis process design includes: HPLC conditions; Sample handling conditions; Selection, verification and validation of method; Proficiency testing inter-laboratory comparision; Analyzing samples in the locality. The achieved results are summarized and perspective of the work is provided. Key words - Alpha lipoic acid (ALA); verification and validation of method; interlaboratory comparision; optimal analytical method; Sample handling conditions. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................. 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu......................................................................... 2 4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 2 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 2 6. Cấu trúc của luận văn ............................................................................................ 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Khái quát về thực phẩm chức năng .......................................................................... 3 1.2. Tổng quan về Alpha Lipoic Acid ............................................................................. 4 1.3. Sản xuất ALA trong công nghiệp ............................................................................. 6 1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC ............................................................................. 6 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................................. 12 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 12 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 14 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31 3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện đo sắc ký lỏng ...................................................... 31 3.2. Kết quả Khảo sát và tối ưu điều kiện Xử lý mẫu trên modde 5 ............................. 36 3.3. Đánh giá quy trình phân tích ala ............................................................................. 41 3.4. Đánh giá phương pháp bằng so sánh liên phòng .................................................... 54 3.5. Phân tích một số mẫu lấy trên địa bàn .................................................................... 55 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 58 PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao) DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt ALA Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt Alpha-Lipoic Acid Alpha Lipoic Acid AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội những nhà hóa học phân tích chính thức HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao ISO International Oranization for Standardization Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm CODEX BOA AGL 03 Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế quốc tế Bureau of Accreditation Supplementary requirements for accreditation in the field of chemical testing Văn phòng công nhận chất lượng Yêu cầu bổ sung để công nhận các phòng thử nghiệm lĩnh vực hóa. Trung ương TW LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng ACN Acetonitril MeOH Methanol DAD UV-Vis RSD SD Diode Array Detector Đầu dò Diode Array Ultraviolet – Visible spectroscopy Quang phổ tử ngoại khả kiến Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Standard Deviation Độ lệch chuẩn EURACHEM Analytical Chemistry in Europe Hiệp hội Phân tích Hóa học Châu Âu TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam QCVN Quy chuẩn Việt Nam KNV ISO 17025:2017 Kiểm nghiệm viên Tiêu chuẩn quốc tế qui định các yêu cầu nhằm đảm bảo năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng 2.1. 2.2. Danh mục các loại cột khảo sát trong quá trình nghiên cứu Đặc điểm các dung môi làm pha động thường dùng trong sắc ký pha đảo Trang 16 17 2.3. Giá trị α2 phụ thuộc vào k và no 20 3.4. Kiểm tra lại quá trình quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm 40 3.5. Bảng kết quả phân tích và độ chệch đường chuẩn 44 3.6. Bảng kết quả xác định LOD, LOQ 45 3.7. Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu 1 46 3.8. Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu 2 46 3.9. Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu 3 47 3.10. Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ nền mẫu 1 48 3.11. Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ nền mẫu 2 48 3.12. Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ của nền mẫu 3 49 3.13. Đánh giá độ thu hồi nền mẫu 1 50 3.14. Đánh giá độ thu hồi trên nền mẫu 2 51 3.15. Đánh giá độ thu hồi trên nền mẫu 3 51 3.16. Kết quả đánh giá độ không đảm bảo đo nền mẫu 1 52 3.17. Kết quả độ không đảm bảo đo nền mẫu 2 53 3.18. Đánh giá độ không đảm bảo đo trên nền mẫu 3 53 3.19. Kết quả đánh giá so sánh liên phòng Alpha Lipoic Acid 54 3.20. Kết quả phân tích ALA trong các mẫu lấy trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi 55 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình hình 1.1. Công thức cấu tạo của ALA Trang 4 1.2. Một số thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường 5 1.3. Nguyên lý hoạt động của hệ thống HPLC 6 1.4. Pic của một chất 10 1.5. Hệ số đối xứng trong sắc ký 10 2.1. Hệ thống máy HPLC Ultimate 3000 15 2.2. Giao diện phần mềm Chromeleon của máy HPLC Ultimate 3000 15 2.3. Phổ UV-VIS của hoạt chất ALA 19 2.4. Đường chuẩn và phuơng trình hồi quy của một chất 24 2.5. Xác định LOD, LOQ bằng nhiễu đường nền 26 3.1. Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,001M 31 3.2. Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,005M 32 3.3. Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,01M 32 3.4. Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,05M 32 3.5. Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,025M 33 3.6. Sắc ký đồ chuẩn ALA khi chạy tỉ lệ ACN:H3PO4 (50:50) 33 3.7. Sắc ký đồ chuẩn ALA khi chạy tỉ lệ ACN:H3PO4 (30:70) 33 3.8. Sắc kí đồ chuẩn với hệ pha động ACN: 0,025M H3PO4 (40:60) (v/v) 34 3.9. Thông số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,1mg/ml ở các bước sóng khảo sát 34 3.10. Thông số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,2mg/ml ở các bước sóng khảo sát 35 3.11. Thông số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,3mg/ml ở các bước sóng khảo sát 35 3.12. Thông số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,4mg/ml ở các bước sóng khảo sát 35 3.13. Thông số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,5mg/ml ở các bước sóng khảo sát 36 3.14. Các mức yếu tố cần khảo sát trên Modde 5 37 Số hiệu hình Tên hình Trang 3.15. Mô hình ma trận các yếu tố trên Modde 5 37 3.16. Phương án thí nghiệm và kết quả phân tích mẫu Modde 5 38 3.17. Tỷ lệ và tương quan của các hệ số hồi quy 38 3.18. Hệ số và kết quả kiểm tra các hệ số phương trình hồi quy 39 3.19. Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố 39 3.20. Tối ưu hóa thực nghiệm 40 3.21. Sắc ký đồ nền mẫu trắng 41 3.22. Sắc ký đồ nền mẫu chuẩn ALA nồng độ 0,1mg/ml 42 3.23. Sắc ký đồ nền mẫu 1 42 3.24. Sắc ký đồ nền mẫu 2 42 3.25. Sắc ký đồ nền mẫu 3 43 3.26. Phổ UV-Vis của dung dịch chuẩn và các nền mẫu thử 43 3.27. Phương trình hồi quy tuyến tính ALA 44 3.28. Sắc kí đồ ALA ở nồng độ 1,50mg/L 45 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chất lượng thực phẩm chức năng là một vấn đề cần phải được quan tâm bởi vì được sử dụng trực tiếp vào trong cơ thể con người. Nếu thực phẩm chức năng giả, kém chất lượng, không đảm bảo nguồn gốc thì có khả năng ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Trong khi “Thuốc” có những quy định rất chặt chẽ như cần phải ghi rõ nguyên liệu, công dụng và luật định, sự chuyển hóa trong cơ thể, đào thải ra sao, tác dụng phụ, hàm lượng… thì thực phẩm chức năng lại không có những yêu cầu khắt khe. Do vậy, việc sản xuất thực phẩm chức năng trở nên dễ dàng hơn, nhất là trong khâu đăng ký sản xuất hay các khâu kiểm định chất lượng. Trong thời gian qua, việc sản xuất, kinh doanh thực phẩm chức năng không đảm bảo chất lượng, không rõ nguồn gốc xuất xứ, chưa đăng ký bản công bố với cơ quan quản lý, đặc biệt kinh doanh qua mạng điện tử có chiều hướng diễn biến phức tạp, ảnh hưởng đến quyền lợi và sức khỏe người tiêu dùng, gây bức xúc với xã hội. Ngày 19/06/2018, Thử tướng Chính phủ đã ban hành Chỉ thị số 17/CT-TTg về việc “Tăng cường đấu tranh chống buôn lậu, gian lận thương mại, sản xuất, kinh doanh hàng giả, hàng kém chất lượng thuộc nhóm hàng dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng, dược liệu và vị thuốc y học cổ truyển”. Hiện nay trong thị trường có nhiều loại thực phẩm chức năng có thành phần chính là Alpha Lipoic Acid (ALA). Tuy nhiên chất lượng của các sản phẩm là vấn đề cần quan tâm chính vì vậy cần có phương pháp tối ưu để phân tích định lượng hàm lượng hoạt chất trên trong sản phẩm. Trong đó hầu như các quy trình phân tích chỉ được tham khảo từ các tiêu chuẩn và các kênh nước ngoài. Các hệ thống TCVN; QCVN; Dược Điển Việt Nam; Dược Điển Anh… hiện tại chưa thấy có quy trình chính thức về phân tích chất lượng Alpha Lipoic Acid và chưa tìm ra các bài báo khoa học ở Việt Nam nói về việc xây dựng quy trình và tối ưu điều kiện chiết xuất phân tích ALA trong thực phẩm chức năng. Các quy trình phân tích ở Việt nam chỉ là các quy trình nội bộ cho nên điều kiện phân tích thiết bị hóa chất khác nhau, và chưa được đánh giá tối ưu theo điều kiện phân tích. Chính vì vậy cần xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá và tối ưu để hoàn thiện quy trình phân tích này. Ngoài ra thực trạng nhu cầu về quản lý trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi cần tìm hiểu về chất lượng các sản phẩm thực phẩm chức năng, đặc biệt là những hoạt chất mới, những hoạt chất đáng quan tâm và được sử dụng nhiều như ALA. Với những lý do và các vấn đề thực tiễn trên tôi xin được lựa chọn đề tài “Thiết kế quy trình phân tích Alpha Lipoic Acid trong một số thực phẩm chức năng”. 2 2. Mục tiêu nghiên cứu 1. Xây dựng và đánh giá được quy trình phân tích ALA trong một số thực phẩm chức năng, quy trình này phải tối ưu và phân tích được hầu hết các mẫu thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường. 2. Từ quy trình đã xây dựng lập hướng dẫn phương pháp ở cơ quan đơn vị để phân tích các mẫu nghiên cứu có trên địa bàn. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Thực phẩm chức năng có chứa ALA trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi. - Sắc ký lỏng cao áp HPLC. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết. - Phân tích dữ liệu. - Xây dựng quy trình. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Xây dựng và lựa chọn quy trình phân tích, lựa chọn các thông số và điều kiện quy trình phân tích. - Xây dựng và tối ưu được quy trình xử lý mẫu phân tích - Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích. Sau đó tiến hành thực hiện phân tích đối chứng về quy trình với các phòng thí nghiệm khác nhau. - Phân tích một số mẫu đối chứng trên địa bàn. 6. Cấu trúc của luận văn Cấu trúc luận văn gồm các Chương sau: - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Đối tượng, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Thực nghiệm và thảo luận - Chương 4: Kết luận 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về thực phẩm chức năng 1.1.1. Định nghĩa về thực phẩm chức năng Khái niệm thực phẩm chức năng được người Nhật sử dụng đầu tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những thành phần giúp nâng cao sức khoẻ cho người sử dụng. Vào nửa cuối thập niên 1990, Ủy ban Châu Âu xây dựng và thảo luận về khái niệm thực phẩm chức năng. Tại cuộc họp này góp mặt với nhiều chuyên gia về dinh dưỡng và các ngành khoa học liên quan khác để đưa ra một khái niệm đồng thuận và từ đó đã được sử dụng rộng rãi. Theo đó “Thực phẩm chức năng là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các chất chức năng. Cũng như thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng nằm giữa nơi giao thoa thực phẩm và thuốc cho nên đôi khi người ta cũng gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm thuốc. Sở dĩ thực phẩm chức năng có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh và phòng ngừa bệnh vì nó có khả năng phục hồi tất cả các cấu trúc tế bào trong cơ thể đang bị tổn thương”. Bộ Y tế Việt Nam định nghĩa thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cở thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh. Tùy theo công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khỏe, sản phẩm dinh dưỡng y học. 1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng Thực phẩm chức năng được phân loại như sau [2]:  Thực phẩm bổ sung (Supplemented Food) là thực phẩm thông thường được bổ sung vi chất và các yếu tố có lợi cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym, probiotic, prebiotic và chất có hoạt tính sinh học khác.  Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Food Supplement, Dietary Supplement) là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên hoàn, viên nén, cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc hỗn hợp của các chất sau đây:  Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác.  Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa. 4  Thực phẩm dinh dưỡng y học còn gọi là thực phẩm dinh dưỡng dùng cho mục đích y tế đặc biệt (Food for Special Medical Purposes, Medical Food) là loại thực phẩm có thể ăn bằng đường miệng hoặc bằng ống xông, được chỉ định để điều chỉnh chế độ ăn của người bệnh và chỉ được sử dụng dưới sự giám sát của nhân viên y tế.  Thực phẩm dùng cho chế độ ăn đặc biệt (Food for Special Dietary Uses) dùng cho người ăn kiêng, người già và các đối tượng đặc biệt khác theo quy định của Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế (CODEX) là những thực phẩm được chế biến hoặc được phối trộn theo công thức đặc biệt nhằm đáp ứng các yêu cầu về chế độ ăn đặc thù theo thể trạng hoặc theo tình trạng bệnh lý và các rối loạn cụ thể của người sử dụng. Thành phần của thực phẩm này phải khác biệt rõ rệt với thành phần của những thực phẩm thông thường cùng bản chất, nếu có. 1.1.3. Yêu cầu kiểm nghiệm của thực phẩm chức năng [2] Việc lấy mẫu kiểm nghiệm định kỳ được thực hiện bởi tổ chức, cá nhân hoặc tổ chức, cá nhân chủ động mời cơ quan có thẩm quyền thực hiện. Các chỉ tiêu để kiểm nghiệm định kỳ là các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu đã công bố trong bản thông tin chi tiết về sản phẩm hoặc trên nhãn sản phẩm đang lưu hành; một số chỉ tiêu hóa lý, vi sinh vật đã công bố trong bản thông tin chi tiết về sản phẩm hoặc theo quy định của pháp luật. Các hoạt chất có tác dụng chính tạo nên công dụng của sản phẩm, mà các đơn vị kiểm nghiệm trong nước thực hiện kiểm nghiệm được thì phải định lượng hoạt chất chính đó trong sản phẩm. Hoạt chất chính mà các đơn vị kiểm nghiệm trong nước chưa có phương pháp thử, mẫu chuẩn để kiểm nghiệm định lượng được thì yêu cầu công bố hàm lượng thành phần có chứa hoạt chất chính trong hồ sơ công bố. 1.2. Tổng quan về Alpha Lipoic Acid 1.2.1. Cấu tạo và tính chất lý hóa Alpha Lipoic Acid (ALA) có tên hóa học là 1,2-dithiolane-3-pentanoic acid. Một số tên khác của ALA: 1,2-dithiolane-3-valeric acid; acetate-replacing factor; iletan; 5-(1,2dithiolan-3-yl) valeric acid; 6,8-dithiooctanoic acid; Heparlipon; lipoic acid; Liposan; Lipothion; protogenA; pyruvate oxidation factor; Thioctacid; thioctic acid; 6,8-thioctic acid; 6-thioctic acid; thioctidase; thiooctanoic acid; Tioctan. O OH S S Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ALA 5 Một số tính chất vật lý của ALA [10]:  Công thức phân tử: C8H14O2S2  Khối lượng phân tử: 206,33g/mol  Mô tả: là dạng bột màu vàng  Điểm nóng chảy: 60-61oC  Điểm sôi: 160-165 oC  Độ hòa tan: Không tan trong nước, hòa tan trong dung môi chất béo. 1.2.2. Công dụng đối với sức khỏe ALA là một chất tự nhiên được tổng hợp trong ty thể của tế bào, đóng vai trò là coenzyme cho hai loại enzyme:  Pyruvate Dehydrogenase  Ketoglutarate -Dehydrogenase. ALA được sử dụng trong cơ thể để phá vỡ carbonhydrate và tạo năng lượng cho các cơ quan khác trong cơ thể. ALA được tế bào cơ thể người sản xuất ra nhưng với nồng độ thấp và lượng giảm dần theo tuổi. Khi được cung cấp đủ nhu cầu cần thiết cơ thể sẽ khỏe mạnh và trẻ đẹp. ALA là một chất chống oxy hóa mạnh đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thực phẩm chức năng:  Kích thích tổng hợp glutathione  Tăng cường tác dụng của các chất chống oxy hóa khác (ví dụ: Vitamin C và E)  Tăng cường hoạt động insulin  Giảm sơ hóa niêm mạc  Ngăn ngừa và điều trị hóa trị gây ra tác dụng phụ, chẳng hạn như bệnh thần kinh ngoại biên. Hơn nữa, có một số báo cáo về ALA đang được sử dụng như một tác nhân có đặc tính chống ung thư. Hiện nay trên thị trường có các loại thực phẩm chức năng có chứa ALA thường được bào chế dưới dạng thuốc có hàm lượng dao động từ 50mg đến 600mg/viên và dạng bào chế thường: Viên nén, viên bao phim, gói bột thuốc, viên nang cứng hay mềm... Hình 1.2. Một số thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường 6 1.3. Sản xuất ALA trong công nghiệp [13] Acid lipoic có thể được điều chế bằng cách phản ứng: Acid 6,8-dichlorooctanoic + Natri disulfide. Trong sản xuất công nghiệp acid-lipoic người ta sử dụng phương pháp chuyển đổi monomethyl hoặc monoethyl adipate thành acid clorua tương ứng bằng phản ứng với thionyl clorua. Hỗn hợp này được xử lý bằng ethylene và nhôm clorua khan tạo ra một hợp chất trung gian sau khi khử được xử lý bằng natri disulfide. Quá trình tạo ra este dithionooctyl sau đó tạo ra acid-lipoic sau khi thủy phân. 1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC [1] Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột. Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể. Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector. Hình 1.3. Nguyên lý hoạt động của hệ thống HPLC 7 1.4.2. Hệ thống bơm Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không đổi. Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ cho dung môi chạy qua một thiết bị giảm xung. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Các bơm có thể được lắp với thiết bị loại bỏ bọt khí. Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hoặc hằng định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải gradient) theo một chương trình xác định. Trong trường hợp rửa giải gradient, hệ thống bơm lấy các dung môi từ một vài bình chứa và các dung môi có thể được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp suất cao. 1.4.3. Bộ phận tiêm mẫu Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu hoặc đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao. Có thể dùng vòng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vận hành bằng tay hoặc tự động. Khi tiêm mẫu bằng tay có thể gây ra sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ. 1.4.4. Pha tĩnh Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm:  Silica (silicon dioxide), nhôm oxide hoặc than graphit xốp thường được dùng trong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về khả năng hấp phụ hoặc phân bố khối lượng;  Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng trong sắc ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự cạnh tranh giữa các ion cần tách và các ion trong pha động;  Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ không gian;  Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc than graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia tách về nguyên tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động và pha tĩnh;  Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose hoặc amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v.v... dùng để tách các đồng phân đối quang (sắc ký đối quang). Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa học làm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động. Bề mặt của chất mang, ví dụ như các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc thử silan khác nhau tạo thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che phủ một số lượng khác nhau các 8 vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang. Bản chất của các pha liên kết là tham số quan trọng để xác định các tính chất tách của hệ sắc ký. Các pha liên kết dùng phổ biến là:  Octyl = Si–(CH2)7–CH3 C8  Octadecyl = Si–(CH2)17–CH3 C18  Phenyl = Si–(CH2)n–(C6H5) C6H5  Cyanopropyl = Si–(CH2)3–CN CN  Aminopropyl = Si–(CH2)3–NH2 NH2  Diol = Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH Đặc điểm và yêu cầu của pha tĩnh sắc ký:  Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc ký pha đảo dựa trên silica được coi là ổn định đối với pha động có pH từ 2,0 tới 8,0. Cột chứa than graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer như styren - divinylbenzen copolymer ổn định ở một khoảng pH rộng hơn.  Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica không bị biến đổi, than graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa học làm cho phân cực (ví dụ cyanopropyl hoặc diol) và pha động không phân cực được sử dụng trong một số trường hợp.  Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh phổ biến nhất từ 3 µm đến 10 µm. Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình dạng nhất định, có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu. Những tham số này cấu thành biểu hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể. Trong trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sung như bản chất của pha tĩnh, mức độ liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết, hoặc các nhóm hoạt động bề mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không. Sự kéo đuôi pic, đặc biệt của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặt của silica.  Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, có chiều dài và đường kính trong ( ) khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc ký. Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột. Nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích. Phần lớn quá trình tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60°C vì khả năng phân hủy của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể xảy ra. 1.4.5. Pha động Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực. Sự có mặt của 9 nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm thu được kết quả tái lặp lại. Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ. Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu phân lớn hơn 0,45 m. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị bằng cách đong các thể tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng) của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó trộn lẫn với nhau. Ngoài ra, dung môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng các van chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn. Dung môi thường được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí Heli, lắc siêu âm hoặc sử dụng hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt khí trong cốc đo của detector. Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất làm ổn định và phải trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát hiện, nếu như sử dụng detector tử ngoại. Dung môi và những thành phần khác được dùng phải có chất lượng phù hợp. Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện với thành phần nước của pha động mà không điều chỉnh với hỗn hợp. Nếu sử dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ thống bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ (5 % v/v) nhằm ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi kết thúc quá trình sắc ký. Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ một ion trái dấu trong sắc ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc đối quang trong trường hợp sắc ký sử dụng pha tĩnh không chọn lọc đối quang. 1.4.6. Detector Detector hấp thụ tử ngoại/khả kiến gồm cả detector chuỗi diod là được sử dụng phổ biến nhất. Detector huỳnh quang, detector khúc xạ vi sai, detector điện hóa, detector khối phổ, detector tán xạ ánh sáng bay hơi, detector phóng xạ hoặc các loại detector đặc biệt khác cũng có thể được sử dụng 1.4.7. Các thông số trong sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.4.7.1. Sắc đồ Sắc đồ (hay sắc ký đồ) là một đồ thị hay một cách trình bày khác mô tả sự thay đổi của đáp ứng của detector (hay nồng độ của chất hay một đại lượng khác dùng làm thước đo nồng độ của chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách. Một sắc đồ lý tưởng có dạng một chuỗi các pic kiểu Gauss trên một đường nền. 1.4.7.2. Thời gian lưu và thể tích lưu Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới dạng thời gian lưu tR. Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi vị trí của đỉnh pic. Từ thời gian lưu có thể tính được thể tích lưu VR dựa trên công thức: 10 VR  υ  t R Trong đó: tR (thời gian lưu) là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất; v (tốc độ dòng) là lưu lượng của dòng pha động. 1.4.7.3. Pic sắc ký Pic của một chất có thể được xác định bởi diện tích pic (A), hay chiều cao pic (h), và chiều rộng của pic ở nửa chiều cao (wh) hoặc chiều cao pic (h) và chiều rộng pic ở điểm uốn (wi). Với các pic dạng Gauss ta có hệ thức: wh = 1,18 wi Hình 1.4. Pic của một chất 1.4.7.4. Hệ số đối xứng Hệ số đối xứng (As) (hay hệ số kéo đuôi) của một pic được tính theo công thức: AS  w 0,05 2d Trong đó: w 0,05 là chiều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic; d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của pic ở 1/20 chiều cao của pic. Khi As = 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng). Hình 1.5. Hệ số đối xứng trong sắc ký
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan