Tài liệu Thiết kế bộ chỉ thị str phục vụ chẩn đoán hemophilia a trước chuyển phôi

  • Số trang: 94 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 24 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Tham gia: 31/07/2015

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Kim Ngân THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A TRƯỚC CHUYỂN PHÔI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS. Đặng Tiến Trường TS. Trần Đức Long Hà Nội – 10/2019 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực nghiệm để hoàn thành luận văn, tôi đã may mắn nhận được sự hỗ trợ cả về vật chất và tinh thần từ các thầy cô, cộng sự và bạn bè. Tôi luôn trân trọng những sự giúp đỡ quý báu đó. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.BS. Đặng Tiến Trường – Phó Chủ nhiệm Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y, người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, kĩ năng chuyên ngành và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi được học tập và nghiên cứu cho đến ngày hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Đức Long – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người đã luôn hỗ trợ, động viên, chỉ bảo tôi khắc phục những thiếu sót và truyền cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN và đặc biệt là các thầy cô Bộ môn Di truyền học - những người đã giảng dạy cho tôi trong quá trình học tập; các cán bộ của Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân Y, đặc biệt là ThS.BS. Nguyễn Minh Tâm, các cán bộ tại Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW và Bệnh viện Nam Học và Hiếm muộn Hà Nội đã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thu mẫu. Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới những người bạn, người anh chị em tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN – chỗ dựa tinh thần vững chắc đã luôn ở bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ, cổ vũ và giúp tôi vượt qua mọi giai đoạn khó khăn trong cuộc sống nói chung và trong quá trình hoàn thiện luận văn nói riêng. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn và ghi nhớ. Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2019 Học viên Nguyễn Kim Ngân Nguyễn Kim Ngân – K26 CH MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Bệnh hemophilia A ...................................................................................................... 3 1.1.1. Tổng quan hemophilia A ................................................................................... 3 1.1.2. Cơ sở phân tử của bệnh ..................................................................................... 5 1.1.3. Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A....................................................... 11 1.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A ......................................................... 15 1.2.1. Kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi ........................................................... 15 1.2.2. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A ................................................. 16 1.3. Phân tích di truyền liên kết ....................................................................................... 19 1.3.1. Ứng dụng của phân tích di truyền liên kết ...................................................... 19 1.3.2. Chỉ thị phân tử STR ........................................................................................ 21 1.3.3. Các chỉ số đa hình di truyền ............................................................................ 22 1.4. Kỹ thuật PCR đa mồi ............................................................................................... 22 1.5. Kỹ thuật điện di mao quản ........................................................................................ 24 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 26 2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ......................................................................................... 26 2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình gen .................................... 27 2.2.3. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................................. 28 2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................................................ 29 2.4. Các kỹ thuật được sử dụng ....................................................................................... 29 2.4.1. Giai đoạn tối ưu và xác định tính đa hình ....................................................... 29 2.4.2. Giai đoạn áp dụng và phân tích di truyền trước chuyển phôi ......................... 38 2.4.3. Giai đoạn xác nhận kết quả bằng chẩn đoán trước sinh .................................. 39 2.5. Các chỉ tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 40 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH 2.6. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................ 40 2.7. Vấn đề y đức và đạo đức trong nghiên cứu ............................................................ 40 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 41 3.1. Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT-M hemophilia A tại Việt Nam ..................................................................................................................................... 41 3.1.1. Các STR nằm cách gen F8 1Mb ..................................................................... 41 3.1.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi khuếch đại các STR ...................... 42 3.1.3. Chỉ số đa hình và chỉ số dị hợp tử của các STR ............................................. 48 3.1.4. Chuẩn hóa quy trình PGT-M trên mẫu tế bào phôi ............................................ 52 3.2. Áp dụng bộ chỉ thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A ........... 56 3.2.1. Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân ....................................... 56 3.2.2. Kết quả mang thai và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân.............. 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 68 Kết luận ............................................................................................................................... 68 Kiến nghị ............................................................................................................................ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 69 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng ..............................4 Bảng 2. Các phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia ........................10 Bảng 3. Một số STR được sử dụng trong chẩn đoán Hemophilia A .......................18 Bảng 4. Thành phần D2 ............................................................................................32 Bảng 5. Thành phần Mastermix ................................................................................33 Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi ...........................................................34 Bảng 7. Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR đơn mồi ......................................34 Bảng 8. Thành phần phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang .........................35 Bảng 9. Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang ....................35 Bảng 10. Thông tin mồi huỳnh quang.......................................................................36 Bảng 11. Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản ....................36 Bảng 12. Chu trình nhiệt biến tính DNA ..................................................................36 Bảng 13. Thông tin các STR được sử dụng trong nghiên cứu ..................................42 Bảng 14. Trình tự mồi khuếch đại các chỉ thị STR ..................................................43 Bảng 15. Kết quả nồng độ và độ tinh sạch DNA tách từ mẫu máu ..........................44 Bảng 16. Nồng độ mồi trong phản ứng PCR đa mồi ................................................47 Bảng 17. Kết quả tính toán chỉ số Ho, He, PIC ..........................................................49 Bảng 18. Kết quả nồng độ sản phẩm WGA 05 mẫu phôi bào phục vụ tối ưu hóa ...52 Bảng 19. Kết quả phân tích đột biến gen F8 ở phôi IVF ..........................................63 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp ..................3 Hình 2. Vị trí của gen tổng hợp FVIII ........................................................................5 Hình 3. Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam ...............6 Hình 4. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 ..............................................................7 Hình 5. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 .................................................................8 Hình 6. Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A ..........................................................11 Hình 7. Vị trí 4 mồi A, B, P, Q trong Long-range PCR phát hiện đảo đoạn int22 trong gen F8 ........................................................................................................................12 Hình 8. Kết quả LD-PCR phát hiện đảo đoạn int22 gen F8 .....................................13 Hình 9. Vị trí cắt giới hạn của enzyme BclI ..............................................................14 Hình 10. Sơ đồ nguyên lý 3 kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen ..................................16 Hình 11. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản ...................................24 Hình 12. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................................28 Hình 13. Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để sàng lọc ......30 Hình 14. Giao diện phân tích kết quả phần mềm Genemapper 4.0. .........................37 Hình 15. Sơ đồ vị trí các STR sử dụng trong nghiên cứu trên NST X .....................41 Hình 16. Kết quả tối ưu hóa các mồi X1 đến X5 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65 ..............44 Hình 17. Kết quả tối ưu hóa các mồi X6 đến X10 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC ........44 Hình 18. Kết quả tối ưu hóa các mồi X11 đến X15 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC ......45 Hình 19. Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có .......46 Hình 20. Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có nồng độ phản ứng đã hiệu chỉnh ........................................................................................48 Hình 21. Biểu đồ tần số dị hợp tử quan sát Ho trong các quần thể nghiên cứu ........50 Hình 22. Biểu đồ tần số dị hợp tử lý thuyết He trong các quần thể nghiên cứu........50 Hình 23. Biểu đồ chỉ số đa hình PIC trong các quần thể nghiên cứu .......................51 Hình 24. Biểu đồ tỉ lệ cá thể dị hợp tử các chỉ thị STR ở 2 bên gen F8 ...................52 Hình 25. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 1 .............................................................53 Hình 26. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 2 .............................................................54 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Hình 27. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 3 .............................................................54 Hình 28. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 4 .............................................................55 Hình 29. Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 5 .............................................................55 Hình 30. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q1 ......................................................................................................................57 Hình 31. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q2 ......................................................................................................................58 Hình 32. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q3 ......................................................................................................................59 Hình 33. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q4 ......................................................................................................................60 Hình 34. Kết quả phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A của gia đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu ........................................................................62 Hình 35. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng Longrange PCR do Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thực hiện ...........................................................................64 Hình 36. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và dịch ối ........................................................................................................................65 Hình 37. Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ STR thiết kế được......................................................................................................66 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADO Bp CGH CSGE DHPLC DNA DOP F8 Nghĩa tiếng Anh Allele drop out Mất allele base pair Cặp bazơ nitơ Comparative genomic hybridization Lai so sánh hệ gen Conformation sensitive gel Điện di phân biệt cấu hình phân electrophoresis tử Denaturing high pressure Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng liquid chromatography cao Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Degenerate oligonucleotide primed F8 gene Khuếch đại bằng mồi thoái hóa Gen quy định yếu tố VIII Yếu tố VIII FVIII FISH Nghĩa tiếng Việt Fluorescence in situ hybridization Lai huỳnh quang tại chỗ Ho Observed Heterozygosity Chỉ số dị hợp tử quan sát He Expected Heterozygosity Chỉ số dị hợp tử lý thuyết Int1 Intron 1 Intron 1 Int22 Intron 22 Intron 22 I-PCR Inversion PCR PCR phát hiện đảo đoạn In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm Intra-cytoplasmic sperm Tiêm tinh trùng vào bào tương injection trứng IVF ICSI MDA Mbp Multiple displacement amplification Mega base pair Khuếch đại đa điểm thay thế Triệu cặp bazơ nitơ Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Multiplex ligation dependent Nhân bản các đoạn đầu dò phụ probe amplification thuộc vào phản ứng nối NST Chromosome Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase Preimplantation genetic Chẩn đoán di truyền trước chuyển diagnosis phôi Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước testing chuyển phôi Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước testing for Aneuploidies chuyển phôi phát hiện dị bội MLPA PGD PGT PGT – A PIC Polymorphism Information Content Hàm lượng thông tin tính đa hình Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước testing for monogenic/single chuyển phôi phát hiện bệnh đơn gene disorders gen Preimplantation genetic Xét nghiệm di truyền trước testing for chromosome chuyển phôi phát hiện rối loạn cấu structural rearrangements trúc nhiễm sắc thể STR Short tandem repeat Trình tự lặp kế tiếp WGA Whole genome amplification Khuếch đại toàn bộ hệ gen µl Microliter Micro lít µM Micromole Micro mol PGT – M PGT – SR Nguyễn Kim Ngân – K26 CH ĐẶT VẤN ĐỀ Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền liên kết nhiễm sắc thể (NST) X, do đột biến gen F8, giảm yếu tố VIII, gây chảy máu không cầm, có thể dẫn tới tử vong. Trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/5000 người nam [38]. Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, có khoảng 30.000 người mang gen F8 đột biến [82]. Điều trị hemophilia A chủ yếu bằng truyền máu tươi hoặc yếu tố VIII nên kinh phí điều trị rất cao nhưng không giải quyết được nguyên nhân bị bệnh. Vì vậy, việc dự phòng không sinh con bị bệnh hoặc không mang gen bệnh bằng chẩn đoán trước sinh và xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi là rất cần thiết. Kỹ thuật chẩn đoán trước sinh giúp tránh sinh con bị bệnh dựa trên việc chọc ối ở thời điểm thai 16 tuần tuổi - tuy nhiên, cặp vợ chồng mang gen phải đối mặt với nguy cơ đình chỉ thai nghén khi thai nhi bị bệnh. Để khắc phục hạn chế này, kỹ thuật xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Testing –PGT) được ưu tiên sử dụng. PGT là sự kết hợp giữa kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization – IVF) tạo phôi với việc chẩn đoán di truyền. Việc lựa chọn trên nhiều phôi giúp khả năng chọn được phôi và mang thai không bị bệnh cao hơn nhiều việc chỉ lựa chọn trên một thai nhi trong chẩn đoán trước sinh. Hơn nữa, PGT giúp các thai phụ tránh phải đình chỉ thai nghén, giảm gánh nặng về tâm lý và bảo vệ sức khỏe của người phụ nữ. Gen F8 lớn, tổn thương trong bệnh hemophilia A phức tạp nên khó có một kỹ thuật xác định trực tiếp các đột biến gen F8 trên tế bào phôi. Bên cạnh đó, hiện tượng khuếch đại hỏng một hoặc cả hai allele (Allele DropOut-ADO) ở mẫu tế bào phôi, được xác định trên 40% các ca chẩn đoán trước chuyển phôi [12], có thể dẫn tới chẩn đoán sai. Ngoài ra, ngoại nhiễm cũng là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây chẩn đoán sai trong PGT. Do vậy, kỹ thuật phân tích liên kết gen sử dụng nhiều trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat – STR) giúp chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A được ưu tiên lựa chọn vì giúp kiểm soát ADO và ngoại nhiễm. Các STR phục vụ PGT phải có tính đa hình cao và nằm gần gen tổn thương để 1 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH đảm bảo tính liên kết. Tỷ lệ dị hợp tử quan sát là một trong những chỉ tiêu quan trọng đánh giá tính đa hình của các STR, quyết định giá trị của STR trong chẩn đoán. Tỷ lệ dị hợp tử quan sát càng cao, giá trị STR trong chẩn đoán càng cao. Ngược lại, tỷ lệ dị hợp tử quan sát thấp, sử dụng các STR này trong chẩn đoán ít có giá trị, gây lãng phí về kinh tế, thời gian và công lao động. Trên thế giới, một số nghiên cứu đã đánh giá tính đa hình trên quần thể người Brazil [47, 50], New Zealand [42], Trung Quốc [17, 72], nhằm lựa chọn các STR phục vụ chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A. Ngoài ra, lựa chọn các STR nằm càng gần gen tổn thương giúp hạn chế hiện tượng trao đổi chéo gây chẩn đoán sai. Tại Việt Nam, đã có nghiên cứu xây dựng quy trình PGT cho bệnh hemophilia A dựa trên phân tích STR [2] nhưng một số STR nằm khá xa gen F8. Hơn nữa, các báo cáo trên thế giới thấy tính đa hình của các STR này thấp, thậm chí tỷ lệ dị hợp tử quan sát chỉ đạt 1,5% trên một số quần thể người khác nhau [6, 61]. Tính đa hình của các STR phục vụ PGT chưa được đề cập trên quần thể người Việt Nam [2]. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi” với hai mục tiêu: 1. Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A cho quần thể người Việt Nam, đảm bảo liên kết chặt với gen F8 và có chỉ số đa hình cao trong quần thể này. 2. Áp dụng bộ chỉ thị thiết kế được trong chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh hemophilia A cho gia đình bệnh nhân người Việt Nam. Nghiên cứu thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR phân tích các trình tự lặp ngắn trong chẩn đoán bệnh hemophilia A trước chuyển phôi tại Hà Nội” mã số 01C-08/11-2017-3 thực hiện tại Phòng phân tích DNA, Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y. 2 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh hemophilia A 1.1.1. Tổng quan hemophilia A Hemophilia, hay bệnh ưa chảy máu, là bệnh rối loạn đông máu di truyền biểu hiện lâm sàng chủ yếu là máu chảy khó cầm ở các vết thương như đứt tay, nhổ răng và các khối máu tụ ở khớp, cơ thường xuất hiện nhiều lần ở một khớp (hình 1). Người mắc bệnh này phải truyền máu thường xuyên, sống nhờ máu người khác với dung tích lớn, không được hoạt động mạnh. Cơ chế di truyền của bệnh liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên NST X, không có allele tương ứng trên NST Y, gây thiếu hụt hay bất thường chức năng của các yếu tố đông máu. Bệnh gồm 3 thể: hemophilia A (80-85%) thiếu yếu tố VIII, hemophilia B (15-20%) thiếu yếu tố IX, hemophilia C (chủ yếu ở người Do Thái với tỷ lệ mắc đồng hợp tử khoảng 1-3‰ ) thiếu yếu tố XI [34]. Hình 1. Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp [15, 83] Trong ba thể bệnh trên, hemophilia A là thể phổ biến nhất trên toàn thế giới, cứ 100000 người nam thì khoảng 10 người mắc bệnh này trong đó 3 – 4 người thuộc các nước châu Á [49, 74]. Sự xuất hiện của các đột biến tự phát trên gen F8 được phản ánh qua 30-33% các ca bệnh ở gia đình không có tiền sử. [34, 51, 54]. Người 3 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A. Triệu chứng lâm sàng thể hiện khác nhau giữa các bệnh nhân, trong đó triệu chứng chảy máu là đặc trưng của bệnh. Các thể xuất huyết nhẹ có triệu chứng xuất huyết xảy ra khi răng sữa rụng hoặc nhổ răng. Bệnh càng nặng thì triệu chứng xuất hiện càng sớm. Bệnh hemophilia A thể nặng đặc trưng bởi bầm tím và chảy máu thường xuyên tái phát vào khớp, đặc biệt là đầu gối, mắt cá chân, hông và khuỷu tay gây giới hạn chuyển động của các khớp. Bệnh nhân có thể chảy máu tự phát hoặc sau một chấn thương nhỏ. Đây là nguyên nhân phổ biến khiến bệnh nhân hemophilia A có thể chảy máu đến chết sau chấn thương. Có thể chẩn đoán thể bệnh hemophilia A theo mức độ yếu tố VIII: bình thường nồng độ FVIII ở người là 200 ng/ml, trường hợp bị bệnh, lượng yếu tố VIII giảm dưới 30%. Hemophilia A được chia làm ba thể: nặng, trung bình và nhẹ. Ở thể nặng, hoạt tính FVIII dưới 1%, những bệnh nhân này thường bị chảy máu vài lần trong tháng. Với thể trung bình, hoạt tính FVIII từ 1-5%, những bệnh nhân này chỉ bị chảy máu sau những chấn thương nhẹ. Còn ở thể nhẹ, hoạt tính FVIII từ 5-30% so với mức bình thường, những người này chỉ bị chảy máu sau phẫu thuật hoặc những chấn thương nặng, sau những động tác mạnh khi chơi thể thao [5]. Bảng 1. Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng [86] Thể bệnh Nặng (chiếm 70%) Nồng độ % yếu tố Biểu hiện chảy máu VIII (đơn vị/ml) 1% (<0,01) Trung bình 1–5% (chiếm 15%) (0,01 – 0,05) Nhẹ 5 – 40% (chiếm 15%) (0,04 – 0,4) Chảy máu tự nhiên không liên quan đến chấn thương, thường chảy máu ở khớp và cơ. Chảy máu tự nhiên hoặc liên quan đến chấn thương nhỏ. Chảy máu nặng sau chấn thương, phẫu thuật. Chảy máu sau chấn thương lớn/phẫu thuật. 4 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Hiện nay đã có nhiều phương pháp điều trị và hỗ trợ bệnh nhân mắc hemophilia, trong đó điều trị liệu pháp gen hứa hẹn nhiều lợi ích vì bệnh được gây ra bởi khiếm khuyết gen, có thể điều trị để biến đổi một dạng bệnh từ thể nặng thành thể nhẹ của bệnh. Sử dụng liệu pháp gen có thể kích hoạt lên đến 150% hoạt động của FVIII [48]. Các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột và chó đã chứng minh sự thành công khi sử dụng liệu pháp gen điều trị, tuy nhiên vẫn cần thêm các nghiên cứu và thử nghiệm về khả năng đáp ứng miễn dịch ở người để đảm bảo độ an toàn khi áp dụng [33]. Thêm vào đó, kinh phí cho liệu pháp gen còn cao so với mặt bằng kinh tế xã hội ở Việt Nam (trung bình một người bệnh mức độ nặng chảy máu 40 lần 1 năm với chi phí điều trị có thể lên tới 1 – 2 tỷ đồng [88]) nên việc chẩn đoán hemophilia nói chung và chẩn đoán di truyền trước sinh và trước chuyển phôi nói riêng là công tác quan trọng nhằm giảm thiểu tối đa các hậu quả cho thế hệ sau của các gia đình mang gen bệnh. 1.1.2. Cơ sở phân tử của bệnh Gen F8 nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính X (chrX: 154,835,795-155,022,753; University of California, Santa Cruz genome browser, GRCh38/hg38), là một trong những gen lớn nhất cơ thể, có kích thước 186 kb gồm 26 exon trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp - 262 bp và 2 exon lớn nhất exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp) [27, 65], mã hóa cho protein FVIII gồm 2332 amino acid và có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD. Hình 2. Vị trí của gen tổng hợp FVIII [65] 5 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp protein FVIII gây nên bệnh hemophilia A [18]. Cơ sở phân tử của hemophilia A được phân tích trong nhiều năm và rất nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh đã được công bố. Các nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau [65]: Bệnh nhân hemohilia A thể nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-50%), trong khi đó đột biến điểm chiếm đa số ở bệnh nhân hemophilia A thể bệnh vừa và nhẹ 90-95% [25] . Ở Việt Nam, đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ cao nhất 38,1%. Tiếp theo là đột biến sai nghĩa chiếm tỷ lệ 23,9%. Chiếm tỷ lệ cao thứ ba là các dạng đột biến mất nucleotide, đột biến vô nghĩa, đột biến thêm nucleotide với tỷ lệ 9,8%. Tỷ lệ thấp nhất là dạng đột biến ở biên giới exon-intron và đột biến mất đoạn lớn chiếm tỷ lệ 4,3% [1]. Vào năm 2014, bản đồ đột biến gen F8 của các bệnh nhân Hemophilia ở Việt Nam đã được xây dựng nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh này (hình 3) [1]. Hình 3. Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam [1] Nghiên cứu của Kaufman và cộng sự năm 1995 khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau của bệnh nhân mắc hemophilia [65]. Cụ thể, nhiều cơ chế đột biến khác nhau có thể gây bệnh hemophilia A thể 6 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH nặng, tuy nhiên dạng đột biến thường gặp nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm 45-50% bệnh nhân (hình 4) và intron 1 chiếm khoảng 5% bệnh nhân (hình 5) của gen F8 [16, 53]. Đảo đoạn intron 22 xảy ra do sự tái tổ hợp giữa bản sao của vùng int22h1 (vùng lặp lại gồm 9,5 kb) thuộc intron 22 với một trong hai bản sao của vùng tương đồng nằm ở telomere vùng int22h2, int22h3; vị trí 400 kb ở đầu 5’ ngoài gen F8 [41]. Hiện tượng đảo đoạn dẫn đến đứt gãy gen F8 và gây thể bệnh nặng cho bệnh nhân với biểu hiện kiểu hình là chảy máu ở mức độ nặng và biến dạng khớp. Đảo đoạn intron 1 xảy ra tương tự, do sự tái tổ hợp vùng int1h1thuộc intron 1 (kích thước 900 bp) nằm vị trí 140 kb ở đầu 5’ của gen F8 với bản sao int1h2 nằm ngoài gen F8 [41]. Hình 4. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 [25] Đột biến mất đoạn lớn phát hiện thấy ở 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng [9], có thể ở dạng mất một exon hoặc mất toàn bộ gen [70]. Dạng đột biến này là do quá trình tái tổ hợp giữa các đoạn lặp Alu [23, 75, 77]. Đột biến chèn đoạn lớn làm đứt gãy gen F8 cũng gây hemophilia A thể nặng [55, 68]. Ngoài ra, đột biến thay thế một nucleotide cũng có thể gây hemophilia A thể nặng: đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã kết thúc hoặc đột biến mất nucleotide gây lệch khung dịch mã dẫn đến không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức năng. Đột biến tại biên giới intron và exon đã được các tác giả công bố. Nhiều đột 7 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH biến thay thế ảnh hưởng đến dinucleotide CpG được phát hiện trên một số bệnh nhân, ví dụ đột biến c.6496C>T dẫn đến chuyển thành Arg2147X (Tại vị trí 6496 trên trình tự Genebank nucleotide C thay bằng nucleotide T làm thay đổi protein Arginine ở vị trí 2147 tạo thành stop codon) [39]. Mất đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấy trong hemophilia A thể nặng, thay đổi từ 1-55 nucleotide. Phổ biến nhất là mất hoặc chèn nucleotide A vào exon 14 [8], thường xảy ra trong vùng từ c.3637 đến c.4379 [39]. Hình 5. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 [25] Đối với hemophilia A thể vừa và nhẹ, cơ chế chính là đột biến điểm gây lệch khung dịch mã và đột biến thay thế nucleotide (missense), chiếm 90-95% bệnh nhân. Đột biến tại vị trí nối và vùng promoter của gen được phát hiện ở một số bệnh nhân. Hiện tượng lặp đoạn exon 13 cũng được mô tả ở các bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ [25]. Thông thường, các trường hợp nam giới bị đột biến gen F8 thể nặng gây bệnh hemophilia A trong cùng một gia đình có những biểu hiện lâm sàng nặng nề tương tự nhau. Tuy nhiên, hiệu ứng di truyền và môi trường khác nhau có thể thay đổi mức độ biểu hiện lâm sàng của bệnh [19]. Các nghiên cứu đã chỉ ra 10-15% bệnh nhân với “kiểu hình đặc trưng” chảy máu mức độ nặng (khi nồng độ FVIII hoạt động <1%) có biểu hiện triệu chứng tương đối nhẹ trên lâm sàng [12, 22, 59]. Không phải tất cả 8 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH những bệnh nhân hemophilia A thể nặng thường xuyên chảy máu tự phát, thậm chí trong số những người bị chảy máu, mức độ nặng của bệnh cũng khác biệt đáng kể. Cơ sở cho sự khác biệt này vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn [36, 71]. Gần đây đã có báo cáo chứng minh được tần số một số loại đột biến là khác nhau ở hai giới: tỷ lệ đảo đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần ở tế bào mầm sinh dục nữ. Đối với đột biến điểm ở tế bào sinh dục nam cao hơn gấp 5 – 10 lần, còn đột biến mất đoạn cao hơn 5 lần so với tế bào mầm sinh dục nữ [58]. Nghiên cứu sinh học phân tử giúp phát hiện ra các dạng, các vị trí đột biến trên gen F8 gây bệnh hemophilia A để chẩn đoán phát hiện người mang gen bệnh. Có nhiều phương pháp để xác định đột biến gen, tuỳ thuộc vào kiểu đột biến mà có các phương pháp phân tích khác nhau. Một số kỹ thuật phân tích đột biến được sử dụng hiện nay là PCR phát hiện đột biến mất exon, Longrange-PCR, Inversion PCR (IPCR) phát hiện đảo đoạn intron 22 [41, 44, 69], PCR đa mồi phát hiện đảo đoạn intron 1 [7] và Southern Blot. Ngoài ra còn có hai kỹ thuật sàng lọc đột biến dựa trên phân tích sợi kép là phương pháp điện di gel phân biệt cấu hình phân tử (Conformation Sensitive Gel Electrophoresis - CSGE) và sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao (Denaturing high pressure liquid chromatography - DHPLC), trong đó DHPLC hiện là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích gen F8 [6, 57]. Những năm gần đây, kỹ thuật nhân bản các đoạn đầu dò phụ thuộc vào phản ứng nối (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8 [6, 57]. Đây là phương pháp bán định lượng xác định số lượng bản sao tương đối của trình tự DNA, được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người. Ngoài ra, MLPA còn giúp phát hiện tổn thương gen, chẩn đoán dị hợp tử với độ chính xác cao, cho kết quả nhanh chóng [52]. Phương pháp giải trình tự DNA của toàn bộ gen F8 có thể được sử dụng để xác định các đột biến điểm gây bệnh. Tuy nhiên, do kích thước lớn của gen F8 và các cơ chế đột biến phức tạp nên giải trình tự cũng không thể giúp chẩn đoán bệnh trong mọi trường hợp. Tại Việt Nam, phát hiện đột biến gen F8 bằng kỹ thuật giải trình tự hiện nay đang 9 Nguyễn Kim Ngân – K26 CH được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội [1]. Bảng 2. Các phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia Phương Loại đột biến pháp phát hiện Southern Đảo blot intron 22 Ưu điểm Nhược điểm đoạn Cho phép xác định những Thời gian thực hiện đoạn DNA đột biến với lâu, nhiều công đoạn. nồng độ nhỏ trong hỗn hợp mẫu mà khó có thể xác định được bằng các phương pháp khác. Longrange- Xét nghiệm phân tích Có nhiều yếu tố ảnh PCR gen được tiến hành đơn hưởng kết quả PCR; I-PCR giản, dễ thực hiện. PCR đa mồi PCR Đảo đoạn đòi hỏi nồng độ DNA trong mẫu cao và mẫu intron 1 phải được bảo quản Mất exon 14, tốt. 26 DHPLC Các dạng đột Có thể phát hiện 85-90% Đòi CSGE biến khác. đột biến gen F8 [6, 26]. hỏi thiết bị chuyên môn đắt tiền, MLPA tốn kém tiền bạc và Giải trình tự công sức DNA Kết quả đột biến DNA cần phải được giải thích một cách thận trọng, do những nguy cơ tiềm ẩn của thể khảm trong gia đình có tiền sử bệnh hemophilia A (chiếm khoảng 10%) có thể gây ra sự không chắc chắn về tình trạng mang gen bệnh: quy trình phát hiện đột biến thông thường có thể không phát hiện ra khiếm khuyết di truyền tiềm ẩn, nếu tỷ lệ các allele đột biến là <5% so với nền allele kiểu thông thường [61]. 10
- Xem thêm -