Tài liệu Tạo dòng vi khuẩn escherichia coli biểu hiện protein dung hợp ecotin miniproinsulin dạng tan trong chu chất

MỤC LỤC Trang I. Báo cáo kết quả thực hiện đề tài ...............................................................2 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................2 1.2. Nội dung thực hiện ................................................................................4 1.3. Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp .............................................4 1.4. Kết quả, biện luận .................................................................................9 1.5. Kết luận, đề nghị .................................................................................21 II. Phụ lục Tài liệu tham khảo 2 I. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1.1. Mục tiêu của việc thực hiện đề tài [1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 14] Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hóa đường làm đường glucose trong máu tăng cao đưa đến nước tiểu có đường, cơ thể bị nhiễm độc keto axit, kèm theo triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhanh… Bệnh xảy ra do hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hoặc insulin đủ nhưng hoạt động kém hiệu quả. ĐTĐ có thể gây biến chứng cấp như nhiễm trùng, nhiễm toan, hôn mê, tăng thẩm thấu hoặc biến chứng mãn tính như tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim, mù lòa, suy thận, rối loạn tiêu hóa, niệu sinh dục, loét bàn chân, bị cắt cụt tứ chi… Trong sản xuất protein tái tổ hợp, mục tiêu hàng đầu là tạo ra số lượng lớn nhưng đồng thời protein mục tiêu phải tồn tại ở cấu hình có hoạt tính tức phải có sự gấp cuộn chính xác. Vi khuẩn Gram âm E. coli là một trong những ưu tiên chọn lựa làm tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp do khả năng sinh sản nhanh, đạt mật độ cao trong những môi trường nuôi cấy rẻ tiền đồng thời bộ gen của E. coli đơn giản và đã được giải trình tự. Thông thường, khi sử dụng E. coli làm tế bào chủ để sản xuất protein tái tổ hợp thì những protein này được định vị trong tế bào chất. Đây là môi trường khử nên những protein mục tiêu biểu hiện vượt mức thường có xu hướng kết tụ, hình thành một dạng không tan (thể vùi) và protein không có hoạt tính do cấu hình không chính xác. Để phục hồi hoạt tính mong muốn của protein mục tiêu, đầu tiên thể vùi (protein mục tiêu) phải được tách chiết từ tế bào chất, hòa tan thể vùi và phải được tái gấp cuộn để có cấu hình chính xác. Tuy nhiên, hiệu suất của quá trình tái gấp cuộn còn tùy thuộc rất nhiều yếu tố, một trong những yếu tố quan trọng nhất chính là protein mục tiêu. Nếu phân tử protein mục tiêu ở dạng tự nhiên càng có nhiều cầu nối disulfide, thì quá trình tái gấp cuộn càng có hiệu quả thấp. Trong phân tử insulin tự nhiên có 3 cầu nối disulfit, trong đó hai cầu nối disulfide tại vị trí amino acid A7-B7, A20-B19 hình thành ở vùng A và B, một cầu nối 3 disulfide giữa amino acid A6-A11 bên trong chuỗi A. Sự hiện diện của 3 cầu nối này làm cho hiệu suất tái gấp cuộn MPI không cao khi biểu hiện vượt mức trong tế bào chất của E. coli. Trong khi đó, vùng chu chất của E. coli là một môi trường có tính oxi hóa và chứa nhiều nhân tố xúc tác hình thành cầu nối disulfide như họ protein Dsb (disulfide bond) nên thuận lợi cho tái gấp cuộn cho protein mục tiêu. Một ưu điểm khác khi biểu hiện protein mục tiêu trong chu chất là số lượng và chủng loại protein của tế bào chủ hiện diện không nhiều trong chu chất (khoảng 100 loại) so với tế bào chất (trên 3000 loại) nên quá trình tinh chế protein mục tiêu sẽ thuận lợi hơn và hiệu quả hơn khi protein mục tiêu được biểu hiện trong tế bào chất. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng Ecotin, protein ức chế trypsin ở E. coli được tổng hợp và tiết vào chu chất nhờ một trình tự tiết nằm ở đầu N của Ecotin. Bằng cách dung hợp trình tự tiết và trình tự mã hóa Ecotin vào đầu N của proinsulin thì proinsulin sẽ được chuyển vào chu chất và sự tái gấp cuộn của proinsulin có hiệu quả cao so với việc dung hợp với các peptide tín hiệu của các gen pelB, dsbA, hay ompT. Trong nghiên cứu này, trình tự tiết và trình tự mã hóa Ecotinđược sử dụng để dung hợp với đầu N của MPI để cấu trúc dòng vi khuẩn E. colicó khả năng biểu hiện Ecotin-miniproinsulin dạng tan trong chu chất có cấu hình gấp cuộn tự nhiên. Dòng tái tổ hợp này sẽ sử dụng như là nguồn giống để tạo insulin tái tổ hợp có hoạt tính dùng trong sản xuất thuốc chữa bệnh ĐTĐ. 1.1.2. Sự cần thiết của nghiên cứu đề tài [6, 7, 8, 9] Số lượng bệnh nhân TĐ ngày càng gia tăng tạo ra nhu cầu rất lớn về insulin. Quy trình sản xuất insulin thương phẩm dùng trong điều trị TĐ được bắt đầu bằng việc chiết xuất insulin từ tụy của bò và heo. Tuy nhiên, nguồn insulin ly trích từ động vật không đủ, có nhiều rủi ro và giá thành cao. Năm 1955, Frederick Sanger đã tìm ra chuỗi axit amin của insulin người, tạo cơ sở cho các nhà khoa học tổng hợp được gen mã hóa cho insulin người và dùng công nghệ gen để sản xuất số lượng lớn insulin người tái tổ hợp với hiệu quả cao và giá thành rẻ hơn nhiều lần 4 [9]. Vào năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học Genetech đã dòng hóa gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Đến năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra một cơ hội lớn cho các nước đang phát triển tiếp cận và sản xuất loại thuốc này. Con số điều tra không đầy đủ nhưng đã cho thấy rằng Việt Nam cũng nằm trong những nước có tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường ở mức cao, vì vậy nhu cầu insulin là rất lớn. Tuy nhiên, việc phụ thuộc lâu dài vào nguồn insulin ở nước ngoài với giá thành cao rõ ràng không phải là con đường tối ưu nền kinh tế Việt Nam. Trước tình hình như trên và với điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng như về nhân lực của PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phục vụ trong điều trị bệnh tiểu đường với giá thành phù hợp với mức chi tiêu của người dân là một định hướng nghiên cứu thiết thực và cần thiết. Mục tiêu và nội dung của đề tài này cũng nằm trong định hướng nghiên cứu trên và cũng là hướng nghiên cứu mới. 1.2. NỘI DUNG THỰC HIỆN Khuếch đại đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa ecotin từ bộ gen E. coli W3110 bằng phản ứng PCR và phân lập; cấu trúc plasmid dòng hóa pGEM-T Easy mang đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa Ecotin; cấu trúc plasmid biểu hiện pET-43a mang đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa Ecotin dung hợp với gen mã hóa miniproinsulin (MPI) người; biến nạp plasmid này vào chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli B834(DE3); khẳng định tính chính xác của protein tái tổ hợp ecotin-miniproinsulin (EMPI) bằng phương pháp Western-blot; khảo sát nồng độ cảm ứng của IPTG và chất hỗ trợ (ethanol) để tối ưu 5 sự biểu hiện EMPI dạng tan trong chu chất; tối ưu hóa điều kiện chiết tách phân đoạn chu chất. 1.3. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP 1.3.1. Chủng vi sinh vật - Chủng chủ E. coli DH5[F-, 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17 (rk-, mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] được dùng để dòng hóa các gen và tạo lượng lớn các plasmid tái tổ hợp. - Chủngchủ E. coli B834(DE3) [F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm met (DE3)] được dùng để nghiên cứu sự biểu hiện gen trong plasmid pET43EMPI. - Chủng chủ E. coli W3110 [F-λ- rph-1 INV(rrnD, rrnE)] dùng để tách bộ gen. - Chủng chủ E. coli DH5/pET43Ins mang plasmid chứa gen mã hóa cho mini-proinsulin 1.3.2. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường được sử dụng là môi trường LB (Luria-Bertani) có thành phần trong 1 lít như sau: Bacto-Tryptone 10g, cao nấm men 5g và 10g NaCl. 1.3.3. Hóa chất Các hóa chất phân tích dùng trong thí nghiệm phân tử được mua từ các hãng Merck, Fermentas, …, và cách thức thực hiện theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất. 1.3.4. Phƣơng pháp 1.3.4.1. Cấu trúc gen mpi để đƣợc biểu hiện dạng tan trong chu chất E. coli [5] Nhằm biểu hiện MPI ở dạng tan trong chu chất của E. coli, chúng tôi chọn phương án dung hợp trình tự mã hóa MPI với trình tự mã hóa ecotin và thẻ 6xHis ở đầu N. Trình tự tín hiệu (ss) và gen mã hóa ecotin giúp cho MPI được biểu hiện 6 trong chu chất E. coli. Thẻ 6xHis giúp cho bước tinh chế bằng phương pháp sắc kí ái lực với cột Ni-NTA. (GS)6 (trình tự lặp lại 6 lần của Gly-Ser) giúp tạo ecotin ở dạng dimer đồng hóa trị. Ngoài ra, một vị trí cắt của TEV protease (ENLYFQG) đã được chèn vào cấu trúc này giữa ecotin và 6xHis có vai trò giúp loại bỏ ecotin ra khỏi protein dung hợp 6xHis-MPI. Một gốc methionine (R) được chèn giữa thẻ 6xHis và MPI giúp việc loại bỏ thẻ 6xHis khỏi MPI bằng CNBr. Do đó, chỉ bằng một bước tinh chế bằng phương pháp sắc kí ái lực với cột Ni-NTA và xử lý bằng cặp enzyme trypsin/ carboxypeptidease B, chúng tôi dự kiến có thể thu nhận được insulin hoàn chỉnh giống với cấu trúc tự nhiên. Cấu trúc gen để biểu hiện MPI dung hợp với ecotin và 6xHis trong chu chất E. coli để thu nhận insulin được minh họa ở Hình 1. Cấu trúc này được tạo thành bằng cách: (i) Nhân bản gen mã hóa ecotin cùng với trình tự peptide tín hiệu bằng phản ứng PCR dùng khuôn DNA bộ gen của E. coli và tạo dòng trong plasmid pGEM thành plasmid pGEco; (ii) Tổng hợp trình tự linker chứa đoạn (GS)6 và trình tự nhận biết của TEV protease (ENLYFQG) bằng phản ứng PCR tái tổ hợp; nối trình tự linker này vào đầu C của ecotin trong plasmid pGEco tạo thành plasmid pGEcolin chứa gen mã hóa ecotin và trình tự linker; (iii) Thu nhận gen mã hóa ecotin và trình tự linker từ plasmid pGEcolin và nối vào trình tự mã hóa 6xHis-MPI trong plasmid pET43-Ins tại vị trí tương ứng với đầu N của 6xHis-MPI để có được plasmid pET43EMPI biểu hiện MPI ở dạng dung hợp với ecotin (Hình 1). Hình 1. Sơ đồ mô tả cấu trúc trình tự mã hóa protein dung hợp ecotin-MPI được dòng hóa trong pET43EMPI. Đoạn gen mã hóa ecotin gồm trình tự tín hiệu (ss) và gen cấu trúc được dung hợp ở đầu N của MPI. Đoạn linker gồm trình tự lặp lại của 6 Gly-Ser và một vị trí cắt của TEV protease. Thẻ 6His và gốc methionine (R) giúp loại bỏ thẻ 6His và MPI bằng CNBr. Vị trí cắt protease được chỉ bằng mũi tên. 7 1.3.4.2. Cảm ứng biểu hiện ecotin-MPI trong các chủng E. coli a. Cảm ứng biểu hiện ecotin-MPI Cấy một khuẩn lạc của dòng E. coli/ pET43EMPIvào bình nuôi cấy chứa 5ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100µg/ml. Nuôi cấy qua đêm, 37oC. Hút dịch huyền phù tế bào chuyển vào bình nuôi cấy mới chứa 10ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100µg/ml. Nuôi cấy lắc ở 37oC đến khi OD600 của dịch nuôi cấy đạt đến 0,8. Bổ sung IPTG sao cho nồng độ cuối đạt 0,5mM và tiếp tục nuôi cấy lắc ở 25 oC, trong 24 giờ. Ly tâm thu sinh khối ở thời điểm OD 600 = 2,5 với tốc độ 10.000 vòng/phút, 5phút, nhiệt độ phòng. Rửa sinh khối tế bào 2 lần với nước cất.Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ hết phần dịch.Hòa sinh khối trong 100µl dH 2O. Bổ sung tiếp 25µl dung dịch nạp mẫu điện di protein 5X. Vortex đều, đun sôi 100oC, trong 10 phút.Ủ ngay vào đá lạnh trong 15 phút để biến tính protein. Ly tâm thu dịch nổi 10.000 vòng/phút, 5 phút, 4oC và phân tích bằng điện di SDS-PAGE. b. Tạo shock thẩm thấu và kiểm tra khả năng tiết của ecotin-MPI trong chu chất Thu 1,5ml dịch nuôi cấy đã cảm ứng bằng IPTG vào eppendorf.Ly tâm 10.000 vòng, 5 phút.Sinh khối được huyền phù trong 200µl dung dịch chứa sucrose 25%, Tris-HCl 0,3M, MgCl2 0,5mM, EDTA 1mM, pH 8.Để eppendorf ở nhiệt độ phòng 30 phút.Ly tâm 13.000 vòng, 5 phút, 4oC. Dịch nổi được loại bỏ và cặn được làm tan trong 100µl dung dịch đã làm lạnh chứa MgCl2 0,5mM, EDTA 1mM, TrisHCl 10mM, pH 8, để trong đá 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng, 15 phút, 4oC. Dịch nổi (phân đoạn chu chất) được thu nhận. Cặn tủa (phân đoạn tế bào chất) được huyền phù trong nước. Phân tích sự hiện diện của ecotin-MPI trong chu chất và trong tế bào chất bằng điện di SDS-PAGE. c. Phân tích sự biểu hiện ecotin-MPI bằng điện di SDS-PAGE Nạp mẫu vào mỗi giếng của gel gom trong bản gel polyacrylamide 12,5%. Điện di với điện thế 160V, 2mA/giếng cho đến khi phẩm màu xanh tiếp cận đầu dưới của gel. Dừng điện di và nhuộm gel trong dung dịch nhuộm khoảng 1 giờ. Giải nhuộm cho đến khi nền gel trong suốt không màu. 8 d. Xác nhận protein dung hợp ecotin-MPI bằng Western blot * Chuyển màng - Điện di SDS-PAGE các mẫu và thang phân tử lượng protein đã nhuộm sẵn. Sau khi điện di cắt bỏ gel gom, đánh dấu gel phân tích. Ngâm và lắc gel trong dung dịch chuyển màng (Towbin) 10 phút. - Chuẩn bị một màng lai nitrocellulose, hai tấm giấy thấm có kích thước phù hợp với kích thước của gel. Ngâm trong dung dịch chuyển màng ít nhất 10 phút. - Điện chuyển thẩm: làm ướt tất cả các miếng xốp bằng dung dịch chuyển màng, sau đó xếp theo thứ tự cực âm, miếng xốp, giấy lọc, gel, màng lai, giấy lọc, miếng xốp, cực dương. Khóa bộ điện chuyển màng lại, thêm dung dịch chuyển màng ngập các miếng xốp. - Lắp vào bồn điện di, chuyển với dòng điện 25V, 350mA trong 1 giờ. - Lấy màng lai ra, đánh dấu mặt trên. * Khóa màng - Chuyển màng lai vào hộp chứa dung dịch khóa màng. - Lắc nhẹ trong 1 giờ, ở nhiệt độ phòng. * Phát hiện protein bắt đặc hiệu với kháng thể - Rửa màng lai 3 lần, với 15ml - 20ml PBST/lần, 5 phút/lần. - Bổ sung 15ml dung dịch chứa kháng thể kháng HUI-18. Lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. - Rửa màng lai 5 lần, 15ml - 20ml PBST/lần, 5 phút/lần. * Hiện phim - Đặt màng lai lên bìa nylon kiếng, phủ khắp bề mặt của màng bằng 1ml hỗn hợp reagent 1 và 2 (bộ Kit HyperfilmTM ECL). Đậy màng lai lại bằng nylon. - Chuyển vào phòng tối, áp sát mặt phim lên phía trên, đúng với vị trí của màng lai, giữ cố định 5-10 phút. - Nhúng phim vào dung dịch developer đến khi vạch protein xuất hiện. - Nhanh chóng chuyển phim sang dung dịch fixer, rửa đến khi nền phim trong suốt. 9 - Rửa phim lại bằng nước, mang ra khỏi phòng tối, phơi khô. 1.3.5. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy và cảm ứng đến biểu hiện ecotin-MPI trong chu chất a. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG Chủng được nuôi cấy ở 250C và cảm ứng trong 24 giờ bằng các nồng độ IPTG khác nhau là 0,25mM, 0,5mM, 0,75mM và 1,0mM để phân tích mức độ biểu hiện ecotin-MPI trong chu chất. Ứng với mỗi điều kiện, thu sinh khối từ 1,5ml dịch nuôi cấy và thu nhận phân đoạn chu chất để kiểm tra mức độ hiện diện của ecotin-MPI trong chu chất bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%. b. Ảnh hưởng của ethanol Chủng được nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung 1%, 2%, 3%, 4% hoặc 5% ethanol với các điều kiện nuôi cấy, cảm ứng và phân tích tương tự như mục a. 1.3.6. Các phƣơng pháp ly trích EMPI dạng tan từ chu chất [3, 5, 13] 1. 3.6.1. Ly trích EMPI bằng phƣơng pháp shock thẩm thấu [1] Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 10000 vòng, 5 phút. Sinh khối được huyền phù trong 500ul dung dịch chứa 25% sucrose, 0.3M Tris–HCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8.0, để ở nhiệt độ phòng 30 phút sau đó ly tâm 13000 vòng, 5 phút, 4oC. Dịch nổi được loại bỏ và cặn được làm tan trong 500ul dung dịch đã làm lạnh chứa 0.5 mM MgCl2, 1mM EDTA, 10 mM Tris–HCl, pH 8.0, để trong đá 30 phút. Ly tâm 13000 vòng, 15 phút, 4oC. Dịch nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận chứa EMPI. 1.3.6.2. Ly trích EMPI bằng phƣơng pháp shock thẩm thấu [2] Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 13000 vòng, 2 phút, 4oC. Rửa bằng dung dịch PBS lạnh (8g NaCl, 0.2g KCl; 1.15g Na2HPO4.7H2O; 0.2g KH2PO4 trong 1 lít nước cất), pH 7.3, vortex kỹ, lặp lại hai lần. Huyền phù sinh khối bằng dung dịch 20% sucrose (20g sucrose trong 100ml dung dịch Tris-HCl 10mM pH 7.5; giữ lạnh 4oC), vortex, thêm 0,5M EDTA, pH 8.0. Để yên trong đá 10 phút, ly tâm 13.000 vòng, 5 10 phút, lấy phần tủa. Thêm nước cất lạnh, vortex, để yên trong đá trong 10 phút, ly tâm 13.000 vòng, 5 phút. Dịch nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận chứa EMPI. 1. 3.6.3. Ly trích EMPI bằng phƣơng pháp shock thẩm thấu [3] Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 10000 vòng, 5 phút. Sinh khối được rửa 2 lần trong dung dịch chứa 10mM Tris-HCl, pH 8, 30mM NaCl. Cặn được tái huyền phù trong dung dịch sucrose 20% (20g sucrose trong 100ml dung dịch Tris-HCl 30mM), 1mM EDTA, pH 8. Để yên trong đá 10 phút, ly tâm 13000 vòng, 5 phút. Tái huyền phù cặn trong nước cất. Để yên trong đá 10 phút ly tâm 13.000 vòng, 5 phút. Dịch nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận chứa EMPI. 1.4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 1.4.1. Tạo plasmid pET43EMPI biểu hiện ecotin-miniproinsulin trong chu chất E. coli 1.4.1.1. Thu nhận gen mã hóa cho ecotin Đoạn gen ecotin mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa ecotin được thu nhận bằng phương pháp PCR từ DNA bộ gen của E. coli W3110 với cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR và Pfu DNA polymerase. Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 500bp khi phân tích trên gel agarose 1% đúng như dự đoán (Hình 2). Sản phẩm này được tinh chế và dòng hóa vào plasmid pGEM. 11 bp 2 3 500 ecotin 100 Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen ecotin từ E. coli W3110 bằng cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR; 1, DNA bộ gen; 2, Thang DNA 100 bp; 3, Sản phẩm PCR. Như vậy, gen ecotin đã được khuếch đại thành công bằng phương pháp PCR và có mang vị trí cắt giới hạn của hai enzyme NdeI và EcoRI ở hai đầu.Sản phẩm PCR sau đó được xử lý bằng hai enzyme NdeI/EcoRI và tinh chế để chuẩn bị cho bước tạo dòng hóa vào plasmid pGEM. 1.4.1.2. Tạo dòng gen mã hóa ecotin vào plasmid pGEM a. Tạo plasmid pGEM mang gen ecotin (pGEco) Plasmid pGEM được tách chiết bằng phương pháp SDS kiềm xử lý bằng hai enzyme NdeI/EcoRI và tinh chế. Gen ecotin đã được xử lý bằng NdeI/EcoRI được nối với plasmid pGEM bằng T4 ligase. Sản phẩm nối được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5 và trải trên môi trường LB-Amp có bổ sung X-gal. Chúng tôi thu được các khuẩn lạc xanh và các khuẩn lạc trắng (kết quả không trình bày). Các khuẩn lạc trắng được chọn làm các dòng dự tuyển cho các bước sàng lọc phía sau. 12 b. Sàng lọc thể biến nạp (E. coli DH5) chứa plasmid pGEco Thể biến nạp E. coli DH5 mang plasmid pGEco được tuyển chọn và kiểm chứng từ các khuẩn lạc trắng bằng phương pháp cắt giới hạn với enzyme NdeI và EcoRI.Sản phẩm cắt cho hai vạch với kích thước khoảng 3.015bp (tương ứng với kích thước của plasmid pGEM) và 500bp (tương ứng với kích thước của gen ecotin) (Hình 3, giếng 2). Như vậy chúng tôi đã tạo dòng thành công gen ecotin vào plasmid pGEM. Plasmid pGEco thu được đã được giải trình tự với cặp mồi T7/ SP6 để thu nhận thông tin của trình tự gen ecotin chèn vào. Kết quả so sánh mức độ tương đồng với trình tự lý thuyết cho thấy trình tự gen ecotin chính xác 100% (Hình 4). Plasmid pGEco này được dùng làm nguồn gen ecotin cho các bước tiếp theo. Hình 3. Kết quả kiểm tra E. coli DH5 / pGEco bằng phương pháp cắt giới hạn. 1, Thang DNA 1kb; 2, pGEM/EcoRI; 3, pGEco/EcoRI; 4, pGEco/NdeIEcoRI; 5, Thang DNA 100bp 13 Hình 4. Kết quả giải trình tự pGEco và kiểm tra trình tự gen ecotin 1.4.1.3. Tạo dòng gen mã hóa ecotin dung hợp với trình tự nhận biết bởi TEV protease Trình tự linker mã hóa đoạn peptide gồm vùng 6 lần lặp lại của dipeptide Gly-Ser (GS)6 và trình tự nhận biết của TEV protease (ENLYFQG) được tổng hợp bằng phương pháp PCR tái tổ hợp với cặp mồi A1F/A2R và Pfu DNA polymerase. Sản phẩm PCR có kích thước 81bp khi được phân tích trên gel agarose 1% đúng như dự đoán trên lý thuyết (Hình 5giếng 2). Sản phẩm PCR này được tinh chế và dòng hóa vào plasmid pGEco. Trình tự linker thu nhận ở trên được xử lý với cặp enzyme EcoRI-NcoI và được nối vào plasmid pGEco đã được mở vòng cũng bằng hai enzyme trên để tạo plasmid tái tổ hợp được đặt tên là pGEcolin. Tiếp theo, sản phẩm nối được hóa biến nạp vào chủng E. coli DH5. Thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp được sàng lọc dựa vào khả năng kháng ampicillin. Trên đĩa môi trường LB-Agar-Amp, chỉ những tế bào mang plasmid mới có khả năng sống sót và hình thành khuẩn lạc đơn. Đây là các khuẩn lạc E. coli DH5/pGEcolin dự tuyển. 14 Hình5. Khuếch đại đoạn linker bằng mồi tổng hợp. 1, Thang DNA 100bp. 2, Sản phẩm khuếch đại Một số khuẩn lạc được chọn để kiểm tra bằng phương pháp PCR, cắt giới hạn. Plasmid tách chiết từ các khuẩn lac được chọn sẽ được phân tích bằng phương pháp PCR với cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR và Ec_NdeIF/A2R. Kết quả PCR plasmid được điện di trên gel agarose 1% cho thấy với cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR có vạch đậm mang kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin khoảng 500bp (Hình 6, giếng 2) và với cặp mồi Ec_NdeIF/A2R có vạch đậm mang kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin-linker khoảng 581bp (Hình 6, giếng 3) đúng như dự đoán lý thuyết. Khi plasmid pGEcolin được cắt bằng NdeI, sản phẩm cắt cho hai vạch với kích thước khoảng 3.015bp (tương ứng với kích thước của plasmid pGEM) và 581bp (tương ứng với kích thước của gen ecotin-linker) (Hình 7, giếng 2). Plasmid pGEcolin thu nhận được giải trình tự với cặp mồi SP6pro/T7ter để thu nhận thông tin của trình tự gen ecotin-linker chèn vào. Kết quả so sánh mức độ tương đồng với trình tự lý thuyết cho thấy trình tự gen ecotin-linker chính xác 100% (Hình 8). 15 Hình 6. Kiểm tra plasmid pGEcolin bằng phương pháp PCR 1, Thang DNA100 bp; 2, Cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR; 3, Cặp mồi Ec_NdeIF/A2R Hình 7. Kiểm tra thể plasmid pGEcoLin bằng enzyme cắt giới hạn 1, Thang DNA 1kb; 2, Sản phẩm cắt với NdeI Hình 8. Kết quả giải trình tự pGEcolin và kiểm tra trên trình tự gen ecotin-linker Các kết quả trình bày ở trên cho phép kết luận rằng chúng tôi đã tạo dòng thành công gen ecotin-linker vào pGEM tạo thành plasmid pGEcolin. Plasmid này được dùng làm nguyên liệu cung cấp gen ecotin-linker để dung hợp với gen mã hóa MPI. 16 1.4.1.4. Tái tạo dòng gen mã hóa ecotin-MPI trongplasmid biểu hiện pET43.1.a Plasmid pET43.1.a biểu hiện ecotin-MPIđược đặt tên là pET43EMPI được tạo thành từ pGEcolin (mang gen mã hóa ecotin + linker) và pET43Ins (mang gen và biểu hiện MPI trong E. coli) (Hình 9). Hình 9. Quy trình thiết lập plasmid pET43EMPI biểu hiện MPI dung hợp với ecotin dạng tan trong chu chất 17 Plasmid pET43Ins được tách chiết từ dòng tế bào E. coli DH5/pET43Ins và được cắt mở vòng bằng NdeI. Gen ecotin-linkerđược thu nhận từ plasmid pGEcolin bằng enzyme NdeI cho ra sản phẩm có kích thước khoảng 581bp (Hình 10, giếng 2). Gen ecotin-linker được nối vào plasmid pET43Ins đã được mở vòng bằng NdeI. Biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối vào E. coli DH5 và trải trên môi trường LBAmp.Các khuẩn lạc mọc trên môi trường LB-Amp là thể biến nạp chứa plasmid tái tổ hợp pET43EMPI.Plasmid tái tổ hợp pET43EMPI được tách chiết và được kiểm tra bằng phương pháp PCR và phương pháp cắt giới hạn. Kết quả PCR plasmid trên gel agarose 1% với cặp mồi chuyên biệt Ec_NdeIF/ A2R cho thấy có vạch DNA đậm mang kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin-linker khoảng 581bp (Hình 10, giếng 2). Đồng thời khi PCR plasmid pET43EMPI với cặp mồi T7P/A2R để kiểm tra chiều thì được vạch có kích thước tương đương với vạch khoảng 631bp (như dự đoán) (Hình 10, giếng 3). Plasmid pET43EMPI được cắt bằng NdeI đã cho ra 2 vạch: vạch lớn có kích thước 5.740bp (Hình 11, giếng 3) tương ứng với vạch của pET43Ins khi cắt bằng XhoI (Hình 11, giếng 2) và vạch bên dưới nhạt hơn có kích thước khoảng 581bp (Hình 11, giếng 4) tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin-linker. Hình 10. Kiểm tra pET43EMPI bằng PCR. 1, Thang 100bp; 2, Cặp mồi Ec_NdeIF/A2R; 3, Cặp mồi T7P/A2R Hình 11. Kiểm tra pET43EMPI bằng enzyme cắt giới hạn. 1, Thang 1kb; 2, pET43Ins/XhoI; 3, pET43EMPI/XhoI; 4, pET43EMPI/NdeI 18 Plasmid pET43EMPI sau khi được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cắt giới hạn được giải trình tự. Kết quả (Hình 12) cho thấy gen ecotin-linker được chèn vào đồng khung với plasmid pET43Ins. Hình 12. Kết quả giải trình tự pET43EMPI và kiểm tra sự đồng khung của gen mã hóa ecotin-MPI Như vậy, chúng tôi đã tạo dòng thành công gen mã hóa ecotin-MPI vào plasmid biểu hiện pET43.1a cho phép biểu hiện MPI dung hợp với ecotin dạng tan trong chu chất. 1.4.2. BIỂU HIỆN ECOTIN-MPI DẠNG TAN TRONG CHU CHẤT 1.4.2.1. Biểu hiện ecotin-MPI trong chu chất E. coli B834(DE3)/pET43EMPI Để đánh giá khả năng tạo protein tái tổ hợp ecotin-MPI trong chu chất của chủng E. coli B834(DE3)/pET43EMPI, mẫu sinh khối sau cảm ứng được thu nhận và tiến hành ly trích lấy phân đoạn protein trong chu chất bằng phương pháp shock thẩm thấu. Đồng thời tiến hành thu mẫu protein tổng số và phân đoạn tế bào chất. Các kết quả thu nhận được phân tích kiểm tra bằng SDS-PAGE và khẳng định bằng phương pháp Western blot. 19 Kết quả phân tích SDS-PAGE cho thấy phân đoạn chu chất của chủng E. coli B834(DE3)/pET43EMPI được cảm ứng bằng IPTG xuất hiện rõ nét một vạch protein ecotin-MPI có kích thước khoảng 30kDA (Hình 11 A, giếng 5). Khi thực hiện lai Western blot với kháng thể kháng thẻ kháng insulin HUI18 cũng thu được kết quả dương tính trên bản phim tương ứng với vị trí protein cần khẳng định trên gel SDS-PAGE. Như vậy, protein tái tổ hợp ecotin-MPI đã được biểu hiện thành công ở dạng tan trong chu chất của E. coli như mong đợi. Bên cạnh đó, protein ecotin-MPI hầu như không được tìm thấy trong phân đoạn tế bào chất khi sử dụng phương pháp shock thẩm thấu để thu nhận phân đoạn chu chất. Kết quả này cho thấy dòng tế bào E. coli B834(DE3) mang plasmid pET43EMPI có khả năng biểu hiện ecotin-MPI một cách vượt mức trong phân đoạn chu chất. Do đó, có thể khẳng định ecotin đã đưa và biểu hiện protein dung hợp với nó, ecotin-MPI vào trong chu chất một cách triệt để. Hình 11. Kết quả khảo sát sự biểu hiện của MPI dung hợp ecotin trong chu chất. (A) Điện di SDS-PAGE; (B) Lai Western-Blot với kháng thể kháng Insulin HUI18. 1, Thang phân tử lượng A B protein; 2, B834(DE3)/pET43EMPI không cảm ứng IPTG; 3, B834(DE3)/pET43EMPI được cảm ứng IPTG; 4, Protein ở phân đoạn tế bào chất; 5, Protein ở phân đoạn chu chất. Vậy chúng tôi đã thành công trong việc tạo dòng tế bào B834(DE3)/pET43EMPI có khả năng biểu hiện MPI ở dạng dung hợp với ecotin trong chu chất khi được cảm ứng bởi IPTG đồng thời chứng minh được sự biểu hiện vượt mức protein trong phân đoạn này bằng SDS-PAGE và Western Blot. 20 1.4.3. TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ NÂNG CAO BIỂU HIỆN MPI DUNG HỢP VỚI ECOTIN TRONG CHU CHẤT E. coli Nhằm cải thiện hiệu quả tổng hợp MPI trong chu chất E. coli, chúng tôi khảo sát các điều kiện nuôi cấy, cảm ứng nhằm tìm ra các thông số thích hợp nhất cho quá trình lên men B834(DE3)/pET43EMPI để tổng hợp eccotin-MPI. 1.4.3.1. Ảnh hƣởng của IPTG IPTG là chất cảm ứng đối với T7 promoter trong đó promoter này điều khiển trực tiếp quá trình sinh tổng hợp ecotin-MPI.Vì thế nghiên cứu ảnh hưởng của dãy nồng độ IPTG khác nhau là điều rất cần thiết. Chúng tôi tiến hành khảo sát sự biểu hiện ecotin-MPI tái tổ hợp trên chủng biểu hiện B834(DE3)/pET43EMPI khi được cảm ứng bằng theo các nồng độ IPTG khác nhau là 0,25mM, 0,5mM, 0,75mM và 1mM. Kết quả khảo sát trên Hình 12 chỉ ra rằng lượng ecotin-MPI trong chu chất tăng lên nhưng không nhiều khi bổ sung nồng độ IPTG từ 0,25mM lên đến 0,5mM và giảm xuống không đáng kể khi tiếp tục tăng nồng độ IPTG lên 0,75mM và 1mM. Vạch protein ecotin-MPI đậm nhất ứng với 0,5mM IPTG (Hình 12, giếng 3). Hình 12. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện ecotin-MPI trong chu chất. 1, Thang protein chuẩn; 2, 0,25mM; 3, 0,5mM; 4, 0,75mM; 5, 1mM; 6, B834(DE3)/pET43EMPI không cảm ứng IPTG