ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------
TRẦN QUỐC KHÁNH
TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B
TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------
TRẦN QUỐC KHÁNH
TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B
TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ TRUNG
TS. NGUYỄN ĐÌNH THẮNG
Hà Nội – 2016
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Trung, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi
trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Đình Thắng (Bộ môn sinh lý thực
vật và hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) cùng các thầy giáo, cô giáo
trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực
vật và Hóa sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy và dìu dắt tôi trong
thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, các bạn làm việc tại
Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập
và thực hiện luận văn tại phòng.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ động viên
tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2016
Học viên
Trần Quốc Khánh
iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1. Máu và hệ thống nhóm máu ở người
3
1.2. Truyền máu và nguyên tắc truyền máu
7
1.3. Kháng thể đơn dòng
10
1.3.1. Khái niệm
10
1.3.2. Vai trò và ứng dụng của kháng thể đơn dòng
11
1.3.3. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng
14
1.3.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam
17
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
19
2.1. Vật liệu
19
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
19
2.1.2. Sinh phẩm
19
2.1.3. Máy móc và thiết bị
20
2.2. Phương pháp nghiên cứu
20
2.2.1. Gây miễn dịch và đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch
20
2.2.1.2. Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch
23
2.2.2. Chuẩn bị tế bào nền
23
2.2.3. Nuôi cấy tế bào myeloma
24
2.2.4. Dung hợp và tạo dòng tế bào lai
24
2.2.5. Sàng lọc tế bào lai
26
2.2.6. Tách dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên
B
27
2.2.7. Đánh giá tốc độ sinh trưởng và sản xuất kháng thể của tế bào lai
28
2.2.8. Phương pháp đếm tế bào lai (xác định số lượng tế bào sống)
29
2.2.9. Xác định loại globulin miễn dịch và kiểm tra tính đơn dòng của tế bào lai 29
iv
2.2.10. Đánh giá kháng thể do tế bào lai sản xuất
31
2.2.11. Cô đặc kháng thể bằng ammonium sulfate
32
2.2.12. Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu B
33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
35
3.1. Lựa chọn nguyên liệu và gây miễn dịch cho chuột
35
3.1.1. Lựa chọn nguyên liệu gây miễn dịch cho chuột
35
3.1.2. Cách thức gây miễn dịch cho chuột
35
3.2. Nghiên cứu tạo tế bào lai giữa myeloma và tế bào lympho B chuột
37
3.2.1. Nuôi cấy tế bào đại thực bào để tạo lớp tế bào nền
37
3.2.2. Nghiên cứu tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng gây ngưng kết đặc hiệu
hồng cầu mang kháng nguyên B
38
3.2.2.1. Tách hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B từ hạch bẹn và lách của chuột
đã gây miễn dịch bằng hồng cầu B
38
3.2.2.2. Dung hợp giữa tế bào myeloma sp2/0 và hỗn hợp tế bào giàu tế bào
lympho B tách từ chuột gây miễn dịch bởi hồng cầu mẫu B
39
3.2.2.3. Nghiên cứu sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên B
41
3.2.2.4. Khả năng sinh trưởng của tế bào B4D10C9
42
3.2.2.5. Khả năng sản xuất mAb kháng kháng nguyên B của dòng tế bào lai
B4D10C9
43
3.2.2.6. Xác định độ đặc hiệu mAb do B4D10C9 sản xuất
44
3.2.2.7. Cường độ và ái tính mAb do B4D10C9 sản xuất với hồng cầu mẫu B
44
3.2.2.8. Xác định phân lớp mAb do dòng tế bào B4D10C9 sinh ra
45
3.2.2.9. Cô đặc dung dịch kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B
47
3.2.2.10. Tạo sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B
49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
52
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên Bảng
Trang
Bảng 1.1. Các nhóm máu hệ ABO ở người
06
Bảng 1.2. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu
09
Bảng 1.3. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu
10
Bảng 3.1. Biến động hiệu giá kháng thể trung bình khi gây miễn dịch
35
theo các con đường khác nhau
Bảng 3.2. Số giếng hình thành tế bào lai từ thí nghiệm dung hợp hỗn hợp
tế bào lympho giàu tế bào lympho B tách từ lách và hạch bẹn
chuột gây miễn dịch bằng hồng cầu mẫu B với tế bào myeloma
sp2/0
37
Bảng 3.3. Số giếng chứa tế bào lai tiết kháng thể gây ngưng kết hồng cầu
40
mẫu B
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình
Trang
Hình 1.1.
Kháng nguyên nhóm máu ở người
5
Hình 1.2.
Cấu tạo các chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm
máu hệ ABO
7
Hình 1.3.
Sơ đồ truyền máu
8
Hình 1.4.
Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu
11
Hình 1.5.
Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể
13
Hình 2.1.
Chuẩn bị vật liệu gây miễn dịch cho chuột
22
Hình 2.2.
Gây miễn dịch cho chuột bằng cách tiêm vào hai gan bàn
chân chuột
22
Hình 2.3.
Cách đọc kết của của phản ứng ngưng kết hồng cầu trên
đĩa 96 đáy chữ V
27
Hình 2.4.
Sơ đồ pha loãng tới hạn
28
Hình 2.5.
Vị trí các ô đếm trong buồng đếm tế bào
29
Hình 2.6.
Cách đọc kết quả trên đĩa elisa của bộ kit Pierce® Rapid
ELISA mouse mAb.
31
Hình 3.1.
Hình ảnh tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh
38
Hình 3.2.
Ảnh chụp tế bào lai quan sát dưới kính hiển vi soi ngược
(độ phóng đại 1000 lần: vật kính 10x, thị kính 20x, máy
ảnh 5x).
40
Hình 3.3.
Minh họa 5 giếng chứa dịch nuôi cấy gây ngưng kết hồng
cầu mẫu B mà không gây ngưng kết hồng cầu mẫu A và O
41
Hình 3.4.
Sàng lọc tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết hồng cầu
mẫu B
42
Hình 3.5.
Hiệu giá kháng thể của các dòng tế bào lai đơn tiết mAb
gây ngưng kết hồng cầu B
42
Hình 3.6.
Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng
trong môi trường DMEM +10% FBS và DMEM+1% FBS
43
vii
theo thời gian
Hình 3.7.
Đồ thị biểu diễn hiệu giá kháng thể theo thời gian của dịch
nuôi cấy tế bào B4D10C9 trong môi trường
DMEM+1%FBS và DMEM+10% FBS
44
Hình 3.8.
Phản ứng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B của mAb do tế
bào lai B4D10C9 sinh ra
45
Hình 3.9.
Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến kính xác định ái
tính mAb do dòng tế B4D10C9 sinh ra với hồng cầu mẫu B
45
Hình 3.10.
Phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể do dòng tế
bào B4D10C9 sản xuất
46
Hình 3.11.
Dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 trước và sau khi tủa
47
ammonium sulphate
Hình 3.12.
Cường độ phản ứng của kháng thể kháng B trước và sau
48
khi tủa
Hình 3.13.
Phản ứng ngưng kết hồng cầu của kháng thể kháng B thu
48
được sau khi tủa bằng ammonium sulphate
Hình 3.14.
Kháng thể kháng B (anti-B) được hoàn nguyên trong dung
50
dịch hoàn nguyên màu vàng. A. dung dịch chứa kháng thể B
(anti-B); B. dung dịch dùng hoàn nguyên kháng thể B
Hình 3.15.
A. Phản ứng ngưng kết của sinh phẩm B với hồng cầu mẫu
A, B và O; B. Lọ sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng B
viii
50
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
anti-A
anti-AB
anti-B
Tên đầy đủ
Anti-A antibody
Anti-AB antibody
Anti-B antibody
Tên tiếng việt
Kháng thể kháng A
Kháng thể kháng AB
Kháng thể kháng B
BSA
DMEM
Bovine serum albumin
Dulbecco's Modified Eagle's
Medium
Albumin huyết thanh bò
Môi trường Dulbecco biến
đổi
DMSO
E. coli
EBV
Dimethyl sulfoxide
Escherichia coli
Epstein – Barr virus
Virus Epstein-Barr
EDTA
ELISA
Ethylene diamine tetraacetic acid
enzyme-linked immunosorbent
assays
Fragment antigen-binding
Mảnh
Fetal Bovine Serum
Freund’s complete adjuvant
Food and Drug Administration
nguyên
Huyết thanh bê
Tá chất hoàn toàn
Cục quản lý Thực phẩm và
Fab
FBS
FCA
FDA
FIA
HAT
Freund’s incomplete adjuvant
hypoxanthyl aminoteptrin
liên
kết
kháng
Dược phẩm Hoa Kỳ
Tá chất không hoàn toàn
HT
thymidine
hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase
hypoxanthyl thymidine
mARN
PBS
PEG
Messenger RNA
Phosphate buffered saline
polyethylene glycol
ARN thông tin
Đệm muối phosphate
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
medium
World Health Organisation
Môi trường RPMI
HGPRT
WHO
ix
Tổ chức y tế thế giới
MỞ ĐẦU
Máu là thành phần vô cùng quý giá trong điều trị bệnh mà cho đến nay vẫn
chưa có một sinh phẩm nào có thể thay thế được, đặc biệt máu được sử dụng trong
điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa và triển khai nhiều kỹ thuật y học
cao cấp như ghép tạng, mổ tim, lọc máu ngoài thận. Tuy nhiên, việc sử dụng máu
trong điều trị bệnh gặp phải nhiều rủi ro, do có sự ngưng kết giữa kháng nguyên
trên màng hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận. Để
quá trình truyền máu thành công phải có sự tương thích giữa máu người cho và
người nhận. Do đó, trước khi truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu.
Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế đã thống kê có 35 hệ nhóm máu với hơn
300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau. Hầu hết các kháng nguyên trên màng
hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu được dùng để nghiên cứu di truyền và quan hệ
huyết thống, chỉ có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây ra phản ứng
ngưng kết khi truyền máu dẫn đến tai biến đó là kháng nguyên A, B của hệ nhóm
máu ABO và kháng nguyên D của hệ nhóm máu Rh. Các nhóm máu nêu trên được
xác định bằng phương pháp ngưng kết sử dụng hồng cầu mẫu hoặc huyết thanh
mẫu. Huyết thanh mẫu chính là các kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên
nhóm máu, có 3 loại huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB được sử dụng trong
xác định nhóm máu hệ ABO và huyết thanh mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ
Rh. Nhiều phương pháp được phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng như công
nghệ lai tế bào, công nghệ bất tử tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ
kháng thể tái tổ hợp, sử dụng chuột chuyển gene. Phương pháp lai tế bào đã được
ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng
nguyên nhóm máu hệ ABO. Hiện nay, nhiều thuốc thử nhóm máu có bản chất là
kháng thể đơn dòng được sản xuất thành công như Blood Grouping (Prestige
Diagnostics UK), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international),
Anti-A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad).
Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị bệnh ngày càng lớn do vậy
việc sử dụng huyết thanh mẫu càng gia tăng. Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa sản
xuất được kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu
1
mẫu thu thập từ các tình nguyện viên hoặc kháng thể đơn dòng nhập ngoại. Việc sử
dụng hồng cầu mẫu làm thuốc thử xác định nhóm máu tốn ít chi phí nhưng lại mất
rất nhiều máu thu được từ người tình nguyện. Còn sử dụng huyết thanh mẫu nhập
ngoại lại có giá thành cao làm tăng gánh nặng kinh tế đối với bệnh nhân. Xuất phát
từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng tế bào
lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B trên màng tế bào hồng cầu
người” với mục tiêu tạo ra dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng
kháng nguyên B sử dụng như thuốc thử xác định nhóm máu B ở người.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Máu và hệ thống nhóm máu ở người
1.1.1. Khái niệm máu và các thành phần của máu
Máu là một tổ chức di động được tạo thành từ thành phần là các tế bào (hồng
cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu) và huyết tương (chứa
protein, muối khoáng, nước) với vai trò cung cấp các chất nuôi dưỡng và cấu tạo
các tổ chức cũng như loại bỏ các chất thải trong quá trình chuyển hóa của cơ thể
như khí CO2 và acid lactic. Đồng thời máu cũng là phương tiện vận chuyển của các
tế bào (cả tế bào có chức năng bảo vệ cơ thể lẫn tế bào bệnh lý) và các chất khác
nhau (các amino acid, lipid, hormone) giữa các tổ chức và cơ quan trong cơ thể. Các
rối loạn về thành phần cấu tạo của máu hay ảnh hưởng đến sự tuần hoàn bình
thường của nó có thể dẫn đến rối loạn chức năng của nhiều cơ quan khác nhau [3,
4]. Máu chiếm 1/13 trọng lượng cơ thể (60 - 70 ml/kg); thể tích máu ở nam khoảng
5 - 6 lít, nữ 4,5 – 5 lít; tỷ trọng 1,055 – 1,063, pH 7,33 – 7,43.
Hồng cầu
Hồng cầu trưởng thành là bào quan hình đĩa lõm, không chứa nhân và các
bào quan (ty lạp thể, polyribosom) do vậy không có khả năng tổng hợp protein,
hồng cầu chứa chủ yếu huyết sắc tố làm nhiệm vụ gắn O2 ở phổi vận chuyển tới các
tổ chức sau đó vận chuyển CO2 đào thải qua phổi. Hồng cầu trưởng thành sống 120
ngày, được phân giải chủ yếu ở lách và tổ chức liên võng khác. Sự cân bằng giữa
môi trường và hồng cầu được duy trì bởi hoạt động của bơm natri nằm trên màng
hồng cầu.
1.1.2. Vai trò của máu trong y học
Máu mang oxy và các chất dinh dưỡng (protein, gluco, lipit, muối khoáng,
các nội tiết tố ...) đến các tế bào, đồng thời cũng mang đi các sản phẩm dư thừa của
các tế bào này. Ngoài ra, máu còn vận chuyển các tế bào miễn dịch để chống lại các
tác nhân lây nhiễm và mang tiểu cầu để tạo thành các vết đông máu khi mạch máu
bị tổn thương để ngăn chặn sự mất máu. Máu được vận chuyển đi khắp cơ thể qua
3
hệ thống tuần hoàn. Khi cơ thể bị viêm nhiễm, máu vận chuyển nhiều tế bào miễn
dịch đến vị trí lây nhiễm để ngăn chặn các tác nhân có hại [15].
Với những chức năng như trên máu đóng vai trò rất quan trọng đối với cơ
thể, thiếu máu hoặc máu không thực hiện được chức năng sẽ gây ra nhiều rối loạn
cho toàn bộ cơ thể. Mất máu do phẫu thuật, bị thương hoặc bị ốm. Cơ thể thiếu máu
(bệnh thiếu máu địa trung hải, bệnh thiếu máu cấp, tủy xương giảm khả năng sản
xuất hồng cầu đối với người xạ trị) hoặc do máu không thực hiện được chức năng
(bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm v.v) [4].
1.1.3. Phân loại các hệ thống nhóm máu ở người
Việc sử dụng máu để điều trị đã được áp dụng từ thế kỷ 17 và trong suốt thế
kỷ 18, tuy nhiên nhiều tai biến rất nguy hiểm đã xảy ra nhưng mãi đến năm 1900
con người mới bắt đầu hiểu được nguyên nhân của tai biến là do sự ngưng kết giữa
kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của
người nhận. Năm 1901, Karl Landsteiner là người đầu tiên phát hiện ra hệ thống
nhóm máu ABO, phân loại các nhóm máu dựa vào kháng nguyên bề mặt trên màng
tế bào hồng cầu, với phát hiện này, ông đã được nhận giải Nobel về sinh lý và y học
năm 1930. Nghiên cứu của ông chỉ ra rằng kiểu nhóm máu của những người khác
nhau có thể không giống nhau và phụ thuộc vào kháng nguyên tồn tại trên màng
hồng cầu. Do đó, nhóm máu được phân loại dựa vào sự có mặt hoặc không có mặt
của kháng nguyên A hoặc kháng nguyên B trên màng hồng cầu và việc xác định
nhóm máu trước khi truyền máu là cần thiết [5].
Năm 2014, theo thống kê của Hiệp hội truyền máu Quốc tế có khoảng 35 hệ
thống phân loại nhóm máu (hệ ABO, hệ Rh, hệ MNS, hệ Kell, hệ Kidd, hệ Lewis,
hệ Duffy, hệ Indian,…) với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau [6]. Trên
màng hồng cầu người có khoảng 30 loại kháng nguyên thường gặp và hàng trăm
loại kháng nguyên hiếm gặp. Hầu hết, kháng nguyên nhóm máu trên bề mặt hồng
cầu có tính kháng nguyên yếu, thường được sử dụng trong nghiên cứu di truyền chỉ
có 2 kháng nguyên A, B của hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ
thống nhóm máu Rh có tính kháng nguyên mạnh đóng vai trò quan trọng trong
4
truyền máu và trong sản khoa.
Kháng nguyên nhóm máu có thể là đường (glycan hoặc carbohydrate) hoặc
protein, chúng liên kết với các thành phần khác nhau trên màng hồng cầu. DNA của
người quy định kiểu kháng nguyên hình thành trên màng tế bào hồng cầu của họ:
kháng nguyên đường; kháng nguyên protein (protein xuyên màng một lần, nhiều lần
và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol). Kháng nguyên nhóm máu ABO
có bản chất là đường. Chúng được sản xuất bởi một loạt các phản ứng với sự tham
gia của các enzyme xúc tác chuyển hóa các đơn vị đường. DNA quy định kiểu
enzyme của mỗi cá thể thông qua đó quy định kiểu kháng nguyên đường hình thành
tương ứng trên màng tế bào hồng cầu. Ngược lại, kháng nguyên của nhóm máu Rh
lại có bản chất là protein, DNA của cá thể mang thông tin di truyền quy định protein
- kháng nguyên. Gen RhD mã hóa kháng nguyên D, được biểu hiện ở những người
mang gen, một vài người có gen không sản xuất kháng nguyên D và do đó protein
RhD vắng mặt trên tế bào hồng cầu của họ. Bên cạnh kháng nguyên đường, tế bào
hồng cầu có ba loại protein mang kháng nguyên nhóm máu: protein xuyên màng
một
lần,
protein
xuyên
màng
nhiều
lần
và
protein
liên
kết
glycosylphosphatidylinositol (GPI) [9].
Hình 1.1. Kháng nguyên nhóm máu ở người
1.1.4. Hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên nhóm máu ABO
Theo Landsteiner, trên màng hồng cầu có những kháng nguyên được gọi là
5
ngưng kết nguyên. Có 2 loại ngưng kết nguyên là A và B. Ngưng kết nguyên là
polysaccharide có mặt trên màng hồng cầu từ giai đoạn sớm của bào thai. Ðồng thời
trong huyết tương có những kháng thể đặc hiệu của nhóm máu được gọi là ngưng
kết tố. Có 2 loại kháng thể đặc hiệu là kháng A (anti-A) và kháng B (anti-B). Các
kháng thể này có khả năng làm ngưng kết hồng cầu khi hồng cầu nhóm máu A gặp
anti-A, hoặc hồng cầu nhóm máu B gặp anti-B. Tùy theo, sự có mặt hoặc vắng mặt
của một trong hai hoặc cả hai kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu,
Landsteiner phân hệ thống nhóm máu ABO thành 4 nhóm máu A, B, AB và O
(Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các nhóm máu hệ ABO ở người
Nhóm
máu
Hồng cầu có
kháng nguyên A hoặc B
Huyết thanh có
kháng thể anti-A hoặc anti-B
A
A
anti-B
B
B
anti-A
AB
A và B
(không có)
O
(không có)
anti-A và anti-B
Về bản chất, kháng nguyên nhóm máu ABO là các carbohydrate có mặt trên
màng hồng cầu và nhiều mô, được đặc trưng bởi một gốc đường đặc hiệu (Hình
1.2). Các chuỗi đường này được gắn trên bề mặt hồng cầu bởi một phần có cấu trúc
giống nhau được gọi là thân carbonhydrate (kháng nguyên H). Chuỗi đường cơ bản
này không gây ngưng kết hồng cầu nên hồng cầu mang chuỗi đường cơ bản được kí
hiệu là nhóm máu O. Khi chuỗi đường cơ bản gắn thêm một gốc đường galactose
hoặc galactosamine thì chúng gây ngưng kết hồng cầu B, nên đặc trưng cho nhóm
máu B. Chuỗi đường đặc trưng nhóm máu B được gắn thêm một nhóm N-acetyl thì
chúng gây ngưng kết hồng cầu A nên đặc trưng cho nhóm máu A [10].
6
Hình 1.2. Cấu tạo các chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO
(RBC – tế bào hồng cầu, GLU – Glucose, GAL – Galactose/Glucosamine,
FUC – Fructose, NAc – N-Acetyl)
Hệ miễn dịch có hiện tượng chống lại các kháng nguyên khác với kháng
nguyên tự thân của hồng cầu. Người nhóm máu A có kháng nguyên A trên hồng cầu
mà không có kháng nguyên B do đó có kháng thể kháng kháng nguyên B trong
huyết thanh. Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng
thể kháng A trong huyết thanh. Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B
trên màng hồng cầu do vậy không có kháng thể kháng A và kháng thể kháng B
trong huyết thanh. Còn người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể
kháng A và kháng B do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B [11].
1.2.
Truyền máu và nguyên tắc truyền máu
1.2.1. Nguyên tắc truyền máu
Truyền máu là quá trình đưa các thành phần của máu vào trong tĩnh mạch
của một người khác. Trước đây, sử dụng máu toàn phần để truyền máu nhưng hiện
nay các thành phần của máu được truyền trong các trường hợp khác nhau, hồng cầu
được sử dụng để tăng khả năng vận chuyển oxy máu, tránh sự mệt mỏi và các biến
chứng khác. Truyền máu mất khoảng 1-4 giờ phụ thuộc vào thành phần và thể tích
máu được truyền. Hầu hết truyền máu được thực hiện tại bệnh viện nhưng nó cũng
được thực hiện ở bất cứ nơi nào khi cần thiết. Trong hầu hết trường hợp, máu có
nguồn gốc từ những tình nguyện viên đã sàng lọc bằng huyết thanh 5 bệnh nhiễm
trùng: HIV, HCV, HBV, giang mai, sốt rét [12].
Màng của mỗi tế bào hồng cầu chứa hàng triệu kháng nguyên tự thân, được
7
bỏ qua bởi hệ thống miễn dịch. Tuy nhiên, trong quá trình truyền máu, các kháng
thể nhóm máu có trong huyết tương của người nhận sẽ tấn công bất kỳ tế bào hồng
cầu cho nào mang kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân sau đó phá hủy
hồng cầu gây ra phản ứng tan máu cấp tính. Do đó, xác định sự tương thích nhóm
máu giữa người cho và người nhận cũng như sự tương tích nhóm máu giữa người
cho và người nhận là cần thiết để truyền máu an toàn [13].
Dựa vào sự có mặt của kháng nguyên bề mặt hồng cầu (A hoặc B) và kháng
thể trong huyết thanh (anti-A hoặc anti-B) quá trình truyền máu được thực hiện theo
nguyên tắc sau [15].
- Người nhóm máu A có kháng nguyên A trên hồng cầu mà không có kháng
nguyên B, có kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh, do đó có thể
truyền máu cho người có nhóm máu A hoặc AB.
- Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng thể
kháng A trong huyết thanh, do đó có thể truyền máu cho người có nhóm máu B
hoặc AB.
- Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu do
vậy không có kháng thể kháng A và kháng thể kháng B trong huyết thanh, do đó chỉ
có thể truyền máu cho người có nhóm máu AB.
Người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể kháng A và kháng B
do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B do đó có thể truyền máu cho
tất cả các nhóm máu.
Hình 1.3. Sơ đồ truyền máu
8
1.2.2. Phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO
Nhóm máu hệ ABO được xác định bằng phương pháp huyết thanh mẫu hoặc
phương pháp hồng cầu mẫu. Theo thông tư của Bộ Y tế (2013) để kết luận một
nhóm máu thuộc hệ ABO thì mẫu máu phải được định nhóm bằng cả hai phương
pháp: phương pháp huyết thanh mẫu và phương pháp hồng cầu mẫu.
Phương pháp huyết thanh mẫu dùng huyết thanh đã biết trước kháng thể cho
phản ứng với hồng cầu của bệnh nhận để xác định sự có mặt của kháng nguyên trên
bề mặt hồng cầu từ đó xác định được kiểu nhóm máu của bệnh nhân. Các mẫu
huyết thanh dùng để xác định nhóm máu hệ ABO bao gồm: huyết thanh mẫu antiA, anti-B và anti-AB. Cách xác định nhóm máu thông qua phương pháp huyết thanh
mẫu như sau (Bảng 1.2).
- Không bị ngưng kết với 3 mẫu huyết thanh mẫu thì mẫu là nhóm máu O.
- Ngưng kết với cả 3 mẫu huyết thanh mẫu thì mẫu thuộc nhóm máu AB.
- Ngưng kết ở mẫu anti-A và anti-AB thì mẫu là nhóm máu A.
- Ngưng kết ở vị trí Anti-B và Anti-AB thì mẫu kiểm tra là nhóm máu B
Bảng 1.2. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu
Anti-A
Anti-B
Anti-AB
Nhóm máu A
+
-
+
Nhóm máu B
-
+
+
Nhóm máu AB
+
+
+
Nhóm máu O
-
-
-
(+) tương ứng với trường hợp xảy ra phản ứng ngưng kết;
(-) Tương ứng với trường hợp không xảy ra phản ứng ngưng kết
Phương pháp hồng cầu mẫu sử dụng hồng cầu mẫu đã biết trước kháng
nguyên cho phản ứng với kháng thể của bệnh nhân để xác định kháng thể có mặt
trong huyết thanh từ đó xác định kiểu nhóm máu của bệnh nhân.
9
Bảng 1.3. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu
Hồng cầu mẫu A
Hồng cầu mẫu B
Hồng cầu mẫu O
Nhóm máu A
-
+
-
Nhóm máu B
+
-
-
Nhóm máu AB
-
-
-
Nhóm máu O
+
+
-
(+) tương ứng với trường hợp xảy ra phản ứng ngưng kết;
(-) Tương ứng với trường hợp không xảy ra phản ứng ngưng kết
1.3.
Kháng thể đơn dòng
1.3.1. Khái niệm
Kháng nguyên là bất kỳ cơ chất nào có khả năng cảm ứng sự hình thành
kháng thể và phản ứng đặc hiệu với kháng thể được tạo ra. Chúng phản ứng với cả
thụ thể của tế bào T. Trên mỗi phân tử kháng nguyên có các yếu tố quyết định
kháng nguyên gọi là epitope và mỗi epitope đặc hiệu với một kháng thể do đó một
kháng nguyên có thể liên kết với nhiều kháng thể tại các vị trí liên kết khác nhau.
Hai đặc tính quan trọng của kháng nguyên là: 1) tính kháng nguyên (có khả năng
kích thích hệ miễn dịch của cơ thể); 2) tính miễn dịch (có khả năng kết hợp với
kháng thể và các tế bào lympho). Kháng nguyên chia ra thành 2 loại kháng nguyên
phụ thuộc tuyến ức (yêu cầu sự tham gia của tế bào T) hoặc kháng nguyên không
phụ thuộc tuyến ức (không yêu cầu sự tham gia của tế bào T để sản xuất kháng thể
mà trực tiếp kích hoạt tế bào B đặc hiệu) [14].
Kháng thể là các phân tử glycoprotein sản xuất bởi tế bào B của hệ miễn
dịch. Mỗi phân tử kháng thể gồm 2 chuỗi polypeptide ngắn giống nhau được gọi là
chuỗi nhẹ và 2 chuỗi polypeptide dài giống nhau được gọi là chuỗi nặng. Bốn chuỗi
này được liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide hình thành phân tử dạng chữ Y.
- Mỗi chuỗi nhẹ gồm một vùng cố định (trình tự axit amin không thay đổi có
thể là kappa - κ hoặc lamda - λ) và một vùng biến đổi (có trình tự axit amin biến đổi
là vị trí liên kết với kháng nguyên).
10
- Mỗi chuỗi nặng gồm ba hoặc bốn vùng cố định (CH1, CH2, CH3) và một
vùng biến đổi (VH) đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ, có trình tự amino
acid rất khác nhau giữa các phân tử kháng thể. Hầu hết phần khác nhau này thuộc
khu vực siêu biến đổi và thường chỉ gồm 6-10 amino acid. Chuỗi nặng của kháng
thể có thể là γ (IgG), α (IgA), µ (IgM), ε (IgE) hoặc δ (IgD), IgG, IgA và IgD có 3
vùng hằng định và một vùng bản lề, IgM và IgE có 4 vùng hằng định nhưng không
có vùng bản lề [17].
Kháng thể đơn dòng là kháng thể được sản xuất bởi một dòng tế bào B và
nhận diện đặc hiệu một epitope trên kháng nguyên.
Hình 1.4. Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu
1.3.2. Vai trò và ứng dụng của kháng thể đơn dòng
Kháng thể đơn dòng là công cụ hữu ích trong nhiều nghiên cứu y sinh và có
giá trị kinh tế cũng như giá trị y học lớn. Một số lượng lớn kháng thể đơn dòng đã
được ứng dụng cho chẩn đoán, trị liệu và các xét nghiệm có độ nhạy cao [18].
Một số ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong lĩnh vực khoa học, công
nghệ, y tế [6]:
- Xác định hormon: Kháng thể đơn dòng được sử dụng để xác định mức
hormon trong máu, nước tiểu, nước bọt để chẩn đoán các bệnh liên quan đến tuyến
nội tiết như định lượng các hormon LH, FSH, progesteron, ostrogen.
- Trong phân loại vi sinh vật: Kháng thể đơn dòng giúp định loại vi khuẩn,
11
- Xem thêm -