Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế bacteriocin cnazu10 và ruazu12 từ clostridium ne...

Tài liệu Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế bacteriocin cnazu10 và ruazu12 từ clostridium nexile và ruminococcus sp.

.PDF
81
48
141

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ÂU THỊ HẠNH TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN CNAZU10 VÀ RUAZU12 TỪ CLOSTRIDIUM NEXILE VÀ RUMINOCOCCUS SP. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ÂU THỊ HẠNH TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH CHẾ BACTERIOCIN CNAZU10 VÀ RUAZU12 TỪ CLOSTRIDIUM NEXILE VÀ RUMINOCOCCUS SP. LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 67/QĐ – ĐHNT ngày 24/01/2017 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: 16/05/2018 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. NGUYỄN VĂN DUY 2. PGS.TS. PHAN THỊ PHƢỢNG TRANG Chủ tịch hội đồng: PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa Phòng đào tạo sau đại học: KHÁNH HÒA – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế bacteriocin Cnazu10 và Ruazu12 từ Clostridium nexile và Ruminococcus sp.” đƣợc trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều chính xác và đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Khánh Hòa, ngày 20 tháng 04 năm 2018 Tác giả luận văn Âu Thị Hạnh i LỜI CẢM ƠN Lời tri ân đầu tiên tôi xin gửi đến Quý Thầy Cô Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng và Khoa Sau đại học - Trƣờng Đại học Nha Trang đã truyền đạt, dạy bảo những kiến thức quý báu cũng nhƣ đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chƣơng trình đào tạo Thạc sĩ. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến PGS.TS. Nguyễn Văn Duy, Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang và PGS.TS. Phan Thị Phƣợng Trang, Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã luôn hƣớng dẫn, định hƣớng và truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm nghiên cứu vô cùng quý báu cũng nhƣ những kinh nghiệm cuộc sống hữu ích. Đồng thời, Thầy Cô luôn hỗ trợ tôi hết mình trong quá trình học tập, nghiên cứu, cũng nhƣ tạo mọi điều kiện cho tôi có thể phát huy tốt năng lực của mình. Tôi xin cảm ơn Thầy Cô vì tất cả những thành quả tôi đạt đƣợc ngày hôm nay. Tôi xin cảm ơn các em Trí, Phƣơng, Tƣơm, Duyên, Diệu làm việc tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh là những ngƣời luôn bên cạnh giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành tốt luận văn này. Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè đã đóng góp công sức, động viên tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 20 tháng 04 năm 2018 Tác giả luận văn Âu Thị Hạnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..............................................................vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .............................................................................................ix LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4 1.1. Tổng quan về bacteriocin .........................................................................................4 1.1.1. Khái niệm về bacteriocin .......................................................................................4 1.1.2. Phân loại bacteriocin ............................................................................................. 4 1.1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin..........................................................................6 1.2. Một số bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ ........................................................8 1.2.1. Azurin ....................................................................................................................8 1.2.2. Các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ khác..................................................9 1.3. Tình hình nghiên cứu tuyển chọn các bacteriocin có tiềm năng kháng ung thƣ ....10 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................................10 1.3.2. Tình hình nghiên cứu bacteriocin tại Việt Nam ..................................................11 1.4. Giới thiệu về các peptide kháng ung thƣ tiềm năng từ Clostridium nexile và Ruminococcus sp. ..........................................................................................................12 1.5. Kỹ thuật tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein....................................................14 1.5.1. Khái niệm về tạo dòng ......................................................................................... 14 1.5.2. Vector và chủng chủ ............................................................................................ 15 1.5.3. Một số enzyme dùng trong tạo dòng ...................................................................16 1.5.4. Kỹ thuật tạo dòng biểu hiện protein mục tiêu trong vi khuẩn Escherichia coli .......19 1.5.5. Tinh chế protein ....................................................................................................21 1.6. Hệ thống biểu hiện protein dung hợp đuôi Histidine .............................................21 1.6.1. Đuôi Histidine .....................................................................................................21 1.6.2. Hệ thống vector pET-42a(+) ...............................................................................22 iii 1.6.3. Hệ thống tế bào chủ E. coli BL21 .......................................................................23 1.7. Chất cảm ứng IPTG ..............................................................................................214 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 25 2.1. Vật liệu ...................................................................................................................25 2.1.1. Chủng vi sinh vật .................................................................................................25 2.1.2. Plasmid ................................................................................................................25 2.1.3. Enzyme ................................................................................................................26 2.1.4. Mồi.......................................................................................................................26 2.1.5. Thang DNA và protein chuẩn..............................................................................27 2.1.6. Hóa chất sinh học phân tử ...................................................................................27 2.1.7. Thiết bị chuyên dụng ........................................................................................... 28 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................29 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 29 2.3.1. PCR (Polymerase chain reaction) ........................................................................30 2.3.2. Điện di DNA trên gel agarose .............................................................................31 2.3.3. Tạo plasmid tái tổ hợp pCnazu10 và pRuazu12 biểu hiện trong E. coli .............32 2.3.3.1.Thu nhận gen p2seq08 và p3seq02 bằng phƣơng pháp PCR ............................ 32 2.3.3.2. Thực hiện phản ứng cắt plasmid pET-42a(+) và các gen p2seq08, p3seq02 ...33 2.3.3.3. Tạo 2 vector tái tổ hợp pET-42a(+) mang gen p2seq08 và p3seq02 ..............34 2.3.4. Tạo chủng E. coli chứa plasmid pCnazu10 và pRuazu12 ...................................34 2.3.5. Điện di protein bằng SDS-PAGE ........................................................................36 2.3.6. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp ............................................................................................................................. 37 2.3.6.1. Khảo sát nồng độ IPTG ....................................................................................37 2.3.6.2. Khảo sát nhiệt độ .............................................................................................. 37 2.3.7. Tinh chế protein Cnazu10 và Ruazu12 chứa đuôi His ........................................38 2.3.7.1. Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu .............................................38 2.3.7.2. Tinh chế protein mục tiêu bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực ............................. 39 2.3.8. Phƣơng pháp cắt protein dung hợp ......................................................................39 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 41 3.1. Tạo plasmid tái tổ hợp pCnazu10 và pRuazu12 biểu hiện trong E. coli ................41 iv 3.1.1. Thu nhận gene p2seq08, p3seq02 bằng phƣơng pháp PCR ................................ 41 3.1.2. Tạo plasmid tái tổ hợp pET-42a(+) mang gene p2seq08, p3seq02 và biến nạp vào E. coli OmniMax ....................................................................................................41 3.2.Tạo chủng E. coli mang plasmid tái tổ hợp và kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ........................................................................................................................ 50 3.2.1. Tạo chủng E. coli BL21 (DE3) mang plasmid pCnazu10 và pRuazu12.............50 3.2.2. Kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ...................................................51 3.2.2.1. Khảo sát nồng độ IPTG ....................................................................................51 3.2.2.2. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng ...............................................................................53 3.3. Tinh chế protein Ruazu12 dung hợp chứa đuôi His và thu nhận protein Ruazu12 .......55 3.3.1.Tinh chế protein Ruazu12 dung hợp chứa đuôi His .............................................55 3.3.2. Kết quả cắt loại đuôi dung hợp và thu nhận protein Ruazu12 ............................ 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................59 Kết luận.......................................................................................................................... 59 Kiến nghị .......................................................................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 60 PHỤ LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Stt Chữ viết tắt 1 bp 2 DNA Deoxyribonucleic Acid 3 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 4 L 5 PCR Ghi chú Cặp bazơ Base pair lít Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 6 6xHis HexaHistidine 7 dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate 8 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 9 KDa Kilo Dalton 10 Kan Kanamycin 11 LB Môi trƣờng Luria – Bertani 12 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 13 SDS - PAGE Sodium Dodecyl Sulphate – Điện di Polyacrylamide Gel Electrophoresis polyacrylamide với SDS 14 TEMED Tetramethylethylenediamine 15 TAE Tris – Acetate –EDTA 16 MCS Multiple Cloning site 17 EBW Equilibrate – Binding – Wash buffer 18 PMSF Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Trình tự gen, amino acid và kích thƣớc của Cnazu10 và Ruazu12 ..................14 Bảng 1.2 . Các trình tự nhận biết và vị trí cắt của các enzyme giới hạn đƣợc chọn lọc ........17 Bảng 2.1. Trình tự các mồi đƣợc sử dụng .............................................................................26 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR thu gen ......................................................................32 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn .............................................33 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nối ......................................................................................34 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc ..................................................................35 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt protein dung hợp Ruazu12 .........................................40 Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ của gen p2seq08 và p3seq02 .............................................42 Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ và mức độ tinh sạch của các plasmid tái tổ hợp ................47 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của nisin ..................................................................................................... 5 Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin............................................................................ 7 Hình 1.3. Bacteriocin Cnazu10 từ Clostridium nexile (A) và Ruazu12 từ Ruminococcus sp.(B) .......................................................................................................................13 Hình 1.4. Sơ đồ quy trình tạo dòng ........................................................................................20 Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc plasmid pET-42a(+) ......................................................................25 Hình 2.2. Thang DNA (A) và thang protein (B) ...................................................................27 Hình 2.3. Sơ đồ chƣơng trình chạy PCR ...............................................................................30 Hình 3.1. Kết quả PCR thu gen ............................................................................................. 41 Hình 3.2. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp pCnazu10 mang gen p2seq08 ....................................43 Hình 3.3. Sơ đồ plasmid tái tổ hợp pRuazu12 mang gen p3seq02 ......................................43 Hình 3.4. Kết quả biến nạp sản phẩm nối pCnazu10 vào E.coli OmniMAX.......................44 Hình 3.5. Kết quả biến nạp sản phẩm nối pRuazu12 vào E.coli OmniMAX.......................44 Hình 3.6. Kết quả PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pCnazu10 ..............................................45 Hình 3.7. Kết quả PCR khuẩn lạc sàng lọc vector pRuazu12 ..............................................46 Hình 3.8. Kết quả giải trình tự gen p2seq08 ..........................................................................48 Hình 3.9. Kết quả giải trình tự gen p3seq02 ..........................................................................49 Hình 3.10. Kết quả biến nạp plasmid pCnazu10 vào E. coli BL21 (DE3).......................... 50 Hình 3.11. Kết quả biến nạp plasmid pRuazu12 vào E. coli BL21 (DE3).......................... 50 Hình 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên sự biểu hiện của protein Cnazu10 trong chủng E.coli BL21 (DE3)............................................................. 51 Hình 3.13. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IPTG lên sự biểu hiện của protein Ruazu12 trong chủng E.coli BL21(DE3).............................................................. 52 Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên tính tan của protein Cnazu10...................................................................................................................53 Hình 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy lên mức độ biểu hiện Ruazu12...................................................................................................................54 Hình 3.16. Kết quả tinh chế protein dung hợp Ruazu12 ......................................................56 Hình 3.17. Kết quả cắt loại đuôi dung hợp và thu nhận protein Ruazu12 ................................ 57 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Hiện nay, cách tiếp cận điều trị ung thƣ sử dụng các vi khuẩn sống và sản phẩm tinh sạch từ chúng đang đƣợc quan tâm. Đặc biệt, bacteriocin – chất kháng khuẩn có bản chất protein và peptide – đang hứa hẹn là một trong những chất kháng ung thƣ hiệu quả và an toàn do có hoạt tính kháng ung thƣ mạnh và thấm chọn lọc với tế bào ung thƣ mà không gây độc đối với tế bào thƣờng. Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo dòng, biểu hiện và thu nhận các đoạn peptide Cnazu10 và Ruazu12 có nguồn gốc từ vi sinh vật đƣờng ruột ngƣời vào trong E. coli BL21 (DE3). Nghiên cứu này làm cơ sở cho việc tiếp tục thử hoạt tính kháng ung thƣ trên tế bào nuôi cấy nhằm phát triển thuốc điều trị ung thƣ thế hệ mới ở ngƣời. Trong thời gian thực hiện khóa luận này, đề tài tập trung thực hiện các nội dung chính sau: - Tạo vector tái tổ hợp pET-42a(+) mang gene p2seq08, p3seq02 mã hóa cho Cnazu10 và Ruazu12 dung hợp với đuôi GST-6His-TEV. - Biến nạp và khảo sát sự biểu hiện của protein dung hợp trên chủng E. coli BL21 (DE3). - Tinh chế protein mục tiêu đã đƣợc biểu hiện. Chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả phù hợp với mục tiêu đề ra nhƣ sau: - Tạo dòng thành công vector pET-42a(+) cho phép biểu hiện các protein mục tiêu (Cnazu10, Ruazu12) trong chủng E. coli BL21 (DE3). - Khảo sát đƣợc các điều kiện nuôi cấy và cảm ứng ảnh hƣởng đến sự biểu hiện protein mục tiêu: nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng ở 23oC protein Ruazu12 ở dạng tan, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,01 mM. - Protein biểu hiện tốt ở các điều kiện cảm ứng. - Đã tinh chế thành công protein dung hợp pRuazu12 trong đó có chứa protein mục tiêu Ruazu12, làm nền tảng cho các thí nghiệm tiếp theo để thu nhận protein mục tiêu. Từ khóa: Bacteriocin, Cnazu10, Ruazu12, protein tái tổ hợp, kháng ung thư ix LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ung thƣ là bệnh lý trong đó một số tế bào thoát ra khỏi sự kiểm soát phân bào, sự biệt hóa tế bào và tiếp tục nhân lên. Những tế bào này có khả năng xâm lấn và phá hủy các tổ chức xung quanh. Đồng thời, chúng di trú đến phát triển ở nhiều cơ quan khác nhau và hình thành nên di căn, cuối cùng ung thƣ gây ra tử vong. Điều trị ung thƣ rất phức tạp. Phẫu thuật sớm đƣợc xem là phƣơng pháp tốt nhất để loại bỏ khối u gây ung thƣ. Nhƣng bệnh ung thƣ vẫn có thể phát triển trở lại nếu có bất kỳ tế bào gây bệnh nào bị bỏ sót. Các tế bào ung thƣ là tế bào của cơ thể con ngƣời nên nhiều phƣơng pháp điều trị tiêu diệt tế bào ung thƣ có nguy cơ phá hủy cả những tế bào khỏe mạnh trong cơ thể sống. Phƣơng pháp xạ trị và hóa trị liệu có thể gây ra tác động phụ với các tế bào bình thƣờng và dẫn tới hiện tƣợng kháng thuốc (đối với hóa trị liệu) của tế bào ung thƣ. Vì vậy, việc tìm kiếm liệu pháp điều trị mới là cấp thiết. Các nghiên cứu hiện nay cũng đang tập trung vào việc tìm ra phƣơng pháp mới để điều trị có hiệu quả hơn căn bệnh ung thƣ nhƣng hạn chế tối đa các tác dụng phụ và tình trạng kháng thuốc. Gần đây các loại thuốc điều trị ung thƣ mới từ vi khuẩn sống và các sản phẩm tinh sạch của chúng đƣợc quan tâm trở lại. Trong đó, điển hình là việc nghiên cứu các bacteriocin từ hệ vi sinh vật đƣờng ruột của ngƣời tiết ra, có thể thấm chọn lọc các tế bào ung thƣ ở ngƣời, gây độc và cảm ứng quá trình chết tế bào theo chƣơng trình, nhƣng không tác động lên tế bào bình thƣờng. Ví dụ, Azurin từ Pseudomonas aeruginosa là bacteriocin có tiềm năng ứng dụng điều trị bệnh ung thƣ nhằm thay thế các phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật và xạ trị. Điều này có thể giúp cho ngƣời bệnh không phải chịu những tác dụng phụ do hóa chất gây ra. Azurin là bacteriocin đã đƣợc chứng minh hoạt tính kháng ung thƣ nhất là vùng chức năng chịu trách nhiệm đối với quá trình xâm nhập vào tế bào ung thƣ của Azurin từ vị trí acid amin 50 – 77, gọi là p28 – Azurin. Một thử nghiệm cận lâm sàng tiến hành trên linh trƣởng và chuột đã chứng minh peptide này không độc và không cảm ứng đáp ứng miễn dịch. Đồng thời, p28 – Azurin đã vƣợt qua 2 vòng thí nghiệm lâm sàng giai đoạn I trên ngƣời và và đƣợc FDA (Hoa Kỳ) chứng nhận làm thuốc kháng ung thƣ. 1 Gần đây, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Duy và cộng sự ở Trƣờng Đại học Nha Trang đã sàng lọc các bacteriocin khác có những đặc điểm tƣơng tự Azurin và p28 – Azurin nhất là về các vùng chức năng sinh học trong cấu trúc, tỉ lệ acid amin kỵ nƣớc và khả năng gắn kết với protein p53 của tế bào ung thƣ. Trong số này có 2 bacteriocin từ Clostridium nexile và Ruminococcus sp. Trong đề tài: “Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế bacteriocin Cnazu10 và Ruazu12 từ Clostridium nexile và Ruminococcus sp.”, Các gene p2seq08 và p3seq02 mã hóa cho Cnazu10 và Ruazu12 sẽ đƣợc dòng hóa và biểu hiện vào plasmid pET-42a(+) trên E. coli và sau đó tinh chế thu nhận bacteriocin tƣơng ứng làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về thử nghiệm hoạt tính kháng ung thƣ và ứng dụng của chúng. 2. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo dòng, biểu hiện và thu nhận đoạn peptide Cnazu10 và Ruazu12 trong E. coli BL21 (DE3). Nghiên cứu này làm cơ sở cho việc tiếp tục thử hoạt tính kháng ung thƣ trên tế bào nuôi cấy nhằm phát triển thuốc điều trị ung thƣ thế hệ mới ở ngƣời. 3. Nội dung chính của đề tài - Dòng hóa gene p2seq08, p3seq02 mã hóa cho Cnazu10 và Ruazu12 vào plasmid pET-42a(+). - Tạo chủng E. coli mang plasmid tái tổ hợp và kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp. - Tinh chế protein Cnazu10 và Ruazu12 chứa đuôi Histidine. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: - Xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tốt nhất để có thể tạo dòng gene mã hóa Cnazu10 và Ruazu12 biểu hiện đƣợc protein Cnazu10 và Ruazu12 từ các bacteriocin của vi khuẩn Clostridium nexile và Ruminococcus sp. tiết ra. - Nghiên cứu này cung cấp quy trình tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein từ vi khuẩn đƣờng ruột ngƣời trong E. coli. Đây là cơ sở khoa học cho công nghệ protein tái tổ hợp nhằm phát triển liệu pháp điều trị ung thƣ từ các protein và peptide của vi khuẩn. 2 Ý nghĩa thực tiễn: - Kết quả là tiền đề cho định hƣớng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong việc sản xuất thuốc điều trị ung thƣ thế hệ mới với hoạt tính kháng ung thƣ mạnh và hiệu quả phụ thấp. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bacteriocin 1.1.1. Khái niệm về bacteriocin Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là các peptite hoặc protein do gene mã hóa đƣợc sản sinh từ cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng để ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác. Bacteriocin có hoạt tính kháng các vi sinh vật cạnh tranh trong cùng ổ sinh thái, thƣờng kháng các loài có quan hệ tiến hóa gần nhau (phổ hẹp) nhƣng đôi khi kháng nhiều loài vi khuẩn khác thậm chí kháng các tế bào sinh vật nhân chuẩn nhƣ tế bào ung thƣ (phổ rộng). Vì vậy, chúng đƣợc mong đợi có tác động có lợi đến sức khỏe của ngƣời, động vật nuôi và một số thực vật (Riley, 2009). Bacteriocin hứa hẹn là một trong các chất kháng ung thƣ hiệu quả, các tính chất hóa sinh của chúng đã và đang đƣợc nghiên cứu. 1.1.2. Phân loại bacteriocin Bacteriocin đƣợc phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau nhƣ: họ vi khuẩn sản sinh, trọng lƣợng phân tử của chúng và trình tự chuỗi acid amin…Cho tới hiện nay bacteriocin đƣợc chia thành 4 lớp. a) Lớp I: là lớp lantibiotic, là polypeptite có trọng lƣợng phân tử < 5 kDa, bền nhiệt, hoạt động theo cơ chế tác động lên màng tế bào. Lantibiotic bacteriocin lớp I đƣợc chia thành hai lớp phụ. Lớp Ia: thƣờng là những protein nhỏ (2-5 kDa) có hình ốc vít, kéo dài và chứa những phân tử mang điện tích dƣơng. Nisin thuộc vào lớp này. Nisin là loại bacteriocin có bản chất là một peptide đa vòng, chứa 34 acid amin. Nisin đƣợc sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic. Nisin có phổ kháng khuẩn Gram (+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hƣởng bởi nisin khi màng ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin đƣợc cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dƣỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp. (Vesterlund et al, 2004). Chúng đƣợc sử dụng chủ yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt nhƣ Bacillus và Clostridium. 4 Hình 1.1. Cấu trúc của nisin ( Nguồn: Poeta et al, 2005) Lớp phụ Ib: là những peptite đặc trƣng hình cầu, không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu đối với những phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm. Đại diện cho nhóm này là Mersacidin. Lớp II: gồm các bacteriocin không phải là lantibiotic, là những peptide có trọng lƣợng phân tử biến thiên, nhƣng thông thƣờng nhỏ (< 10 kDa), bền nhiệt, chứa những amino acid thông thƣờng. Nhóm này đƣợc chia vào trong ba nhóm nhỏ: Lớp IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptide hoạt động chống Listeria, đại diện đặc trƣng cho nhóm này là pediocin PA-1, Leucocin A và Sakacin P. Các bacteriocin nhóm này hứa hẹn có nhiều ứng dụng trong công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng Listeria mạnh của chúng. Thậm chí chúng còn đƣợc chú ý hơn nhiều so với bacteriocin lớp I (nisin) vì chúng có phổ ức chế đặc hiệu với vi khuẩn đích. Lớp IIb: đƣợc hình thành bởi phức hợp của hai peptide riêng biệt, những peptide này ít hoặc không hoạt động. Bacteriocin đặc trƣng cho nhóm này là: Lactococcin G, Plantaricin EF và Plantaricin JK. Lớp IIc: là những peptide nhỏ, bền nhiệt. Trong phân lớp này chỉ tìm thấy các bacteriocin nhƣ Divergicin A và Acidocin B. b) Lớp III: lớp này bao gồm các peptide lớn có trọng lƣợng phân tử > 30 kDa, không tan, không bền nhiệt. Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào có hoạt tính kháng lại các vi khuẩn. Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ đƣợc phân lập từ chi Lactobacillus. Đại diện: Acidofilicin A và Lactacins A,B. 5 d) Lớp IV: là các bacteriocin phức hợp, ngoài thành phần chính là protein chúng còn chứa lipid và cacbonhydrat. Cấu trúc và chức năng của nhóm này chƣa đƣợc biết nhiều, ví dụ Leuconocin B. 1.1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin Các bacteriocin thƣờng có hiệu quả chống lại vi khuẩn Gram dƣơng nhƣ: Bactobaccilus, Listeria monocytogenes, Salmonella tiphymurium. Các bacteriocin của Lactacins A, B có thể không hiệu quả khi ức chế hoạt động của vi khuẩn Gram âm vì màng ngoài của chúng gây cản trở cho hoạt động của bacteriocin. Cơ chế tác động của bacteriocin rất đa dạng, có thể làm biến đổi các enzyme, ức chế sự sản sinh bào tử, hoặc xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy proton, làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào do đó tạo ra các lỗ thủng không thể khắc phục đƣợc dẫn đến tế bào bị phá vỡ. Nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào (Thomas et al, 1994). Lớp I (điển hình là nisin): tác động lên thành peptidoglycan hoặc màng nguyên sinh, hoặc kết hợp cả hai cơ chế. Ví dụ, nisin có cả hai cơ chế trong khi đó thì lacticin chỉ có khả năng tác động lên thành peptidoglycan. Đối với thành peptidoglycan, lipid II giữ vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các đơn vị tổng hợp nên thành peptidoglycan từ trong tế bào chất. Bacteriocin thuộc nhóm này có khả năng liên kết với lipid nằm trên màng nguyên sinh, sự liên kết này đƣợc giải thích rằng do phần lớn bacteriocin mang điện tích dƣơng và lipid màng mang điện tích âm, vì thế sự liên kết đƣợc dễ dàng tạo ra trên màng. Sau khi tạo liên kết, bacteriocin sẽ khóa lipid làm chúng mất khả năng vận chuyển các tiểu đơn vị cấu tạo nên thành peptidoglycan (Heschard et al, 2002). Đối với màng sinh chất, bacteriocin liên kết và sử dụng lipid trên màng nguyên sinh thực hiện quá trình oxi hóa khử, lúc này lipid có tác dụng nhƣ những con dao cắt tạo nên những lỗ hỏng trên màng nguyên sinh. Những lỗ hỏng này làm thất thoát nhiều các ion, các chất hòa tan trong nguyên sinh chất (muối khoáng, acid amin, acid nucleic…), làm thủy phân và thất thoát nhiều ATP dẫn đến tế bào chết nhanh hơn (Heschard et al, 2002). 6 Lớp II (điển hình là Sakacin): do có nhóm kỵ nƣớc nên sau khi tạo ra kênh dẫn trong màng, bacteriocin thuộc nhóm này sẽ liên kết với lipid trong thành phần phospholipid màng, và gắn trực tiếp vào màng nhƣ một thành phần của màng, sau đó thực hiện các phản ứng oxi hóa khử tạo nên những lỗ hỏng và tác động nhƣ nhóm I (Heschard et al, 2002). Lớp III (điển hình là lysostaphin): tác động trực tiếp lên thành tế bào, làm phân hủy thành tế bào và thay đổi tính thẩm thấu (Heschard et al, 2002). Lớp IV : Hiện vẫn chƣa có kết luận rõ ràng về cơ chế hoạt động của nhóm này. Tuy nhiên các nhà khoa học giả định rằng cơ chế hoạt động của nhóm này chủ yếu tác động lên DNA, RNA và sự tổng hợp protein. Các bacteriocin nhóm này có thể tạo phức hợp không tan với DNA, ngăn cản DNA tổng hợp nên RNA và protein hoặc liên kết với DNA làm cho quá trình dịch mã sinh ra các protein bất thƣờng (Heschard et al, 2002). Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin (Nguồn: Cotter et al, 2005) 7 1.2. Một số bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ 1.2.1. Azurin Azurin là một bacteriocin thuộc họ protein cupredoxin do Pseudomonas aeruginosa tiết ra, có thể thấm chọn lọc các tế bào ung thƣ ở ngƣời, gây độc và cảm ứng quá trình chết tế bào theo chƣơng trình, nhƣng không tác động đối với tế bào bình thƣờng. Azurin có thể tƣơng tác trực tiếp và làm ổn định cấu trúc protein p53 (Punj et al, 2003). Vùng chức năng chịu trách nhiệm đối với quá trình xâm nhập vào tế bào ung thƣ của azurin nằm từ vị trí axit amin từ 50–77 (đƣợc gọi là vùng p28). Vùng này có cấu trúc xoắn alpha và lƣỡng tính. Quá trình xâm nhập vào tế bào của azurin không kèm theo phá vỡ màng tế bào và dẫn tới làm tan bào. Một thử nghiệm cận lâm sàng nhằm đánh giá các thông số dƣợc động học, trao đổi chất và độc tính của azurin-p28 (đoạn peptite tổng hợp dài 28 aa có nguồn gốc azurin) tiến hành trên linh trƣởng và chuột đã chứng minh peptite này không độc và không cảm ứng đáp ứng miễn dịch (Jia et al, 2011). Hơn thế nữa, gần đây tƣơng tác protein-protein giữa azurin và p53 đã đƣợc phân tích bằng công cụ tin sinh học và kính hiển vi lực nguyên tử (Grandis et al, 2007; Taranta et al, 2009). Tƣơng tự Azurin, thông qua phƣơng pháp động học phân tử và sử dụng kính hiển vi lực nguyên tử, peptite p28 - Azurin đƣợc ghi nhận có khả năng liên kết với protein p53 cũng nhƣ ức chế sự hình thành mạch máu mới, và các đặc tính ức chế khối u khác. Vì vậy, peptite p28 – Azurin đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trên ngƣời bởi công ty CDG Therapeutics Inc, Mỹ. Thử nghiệm đƣợc tiến hành với mƣời lăm bệnh nhân ung thƣ di căn giai đoạn IV đã không còn đáp ứng với điều trị bằng các thuốc chống ung thƣ khác nhau và có tuổi thọ dự tính không quá 6 tháng thử nghiệm. Trong số này có 7 bệnh nhân ung thƣ da, 4 bệnh nhân ung thƣ trực tràng, 2 bệnh nhân ung thƣ mô mềm sarcoma, 1 bệnh nhân ung thƣ tuyến tụy và 1 bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt. Kết quả cho thấy độc tính và đáp ứng miễn dịch đã không đƣợc ghi nhận ở tất cả các bệnh nhân. Đặc biệt, ung thƣ đã suy giảm một phần ở hai bệnh nhân trong khi ở hai bệnh nhân khác ung thƣ hoàn toàn suy giảm, chứng tỏ cơ chế tác động hiệu quả của p28 – Azurin đối với các bệnh nhân này (Yamada et al, 2011). 8 1.2.2. Các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thƣ khác Azurin không phải là bacteriocin kháng ung thƣ duy nhất do các vi sinh vật của khu hệ vi sinh đƣờng ruột ngƣời tiết ra. Đặc tính kháng ung thƣ của dịch bacteriocin thô đã đƣợc phát hiện từ những năm 1970. Ngày nay, nhiều bacteriocin tinh sạch thể hiện hoạt tính ức chế đối với nhiều dòng tế bào ung thƣ khác nhau đã đƣợc phát hiện, bao gồm pyocin, colicin, pediocin và microcin. Nisin là đại diện điển hình lớp Ia của các bacteriocin, là một peptite kháng khuẩn đa vòng, đƣợc cấu tạo từ 34 gốc acid amin do vi khuẩn Lactococcus lactis trong quá trình lên men lactic tiết ra, là một tác nhân kháng khuẩn tự nhiên không thể tổng hợp nhân tạo, có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn Gram dƣơng, đã đƣợc sử dụng phổ biến trong bảo quản thực phẩm, không độc đối với các động vật và con ngƣời. Bacteriocin này đã đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cấp phép sử dụng năm 1969 và Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép năm 1988. Nisin còn là chất kháng ung thƣ đối với ung thƣ tế bào vảy ở đầu và cổ (HNSCC) bằng khả năng cảm ứng quá trình chết theo chƣơng trình, làm ngừng chu trình tế bào, ức chế quá trình tăng sinh tế bào chọn lọc ở tế bào HNSCC so với các tế bào sừng (keratinocyte) (Joo et al, 2012). Tƣơng tự, plantaricin A (PlnA) là một bacteriocin có điện tích dƣơng từ chủng Lactobacillus plantarum C11 có khả năng thấm qua màng và có hiệu quả kháng khuẩn. Điều thú vị là PlnA cũng có thể thấm qua màng các tế bào nhân chuẩn với hiệu quả tùy thuộc từng loại tế bào, bao gồm cả tế bào ung thƣ và các tế bào thƣờng khác. Kết quả nghiên cứu cơ chế thấm qua màng cho thấy, tƣơng tác tĩnh điện giữa PlnA và các glycoprotein màng đóng vai trò then chốt cho PlnA bắt đầu tƣơng tác với các phospholipit màng (Sand et al, 2013). Trong số các bacteriocin kháng ung thƣ nói trên, azurin đƣợc sản sinh từ vi khuẩn Gram âm, trong khi nisin và PlnA đƣợc sản sinh từ vi khuẩn Gram dƣơng. Điều này gợi ý rằng, cả vi khuẩn gram dƣơng và gram âm, cũng nhƣ các vi khuẩn gây bệnh và hội sinh ở ngƣời đều có thể sản xuất ra các bacteriocin, vừa có hoạt tính kháng vi sinh vật vừa có hoạt tính chống ung thƣ. Điều này mở ra kỷ nguyên mới trong việc phát triển thuốc chữa bệnh góp phần bảo vệ sức khỏe con ngƣời. Nếu các vi sinh vật gây bệnh và hội sinh cùng tồn tại lâu dài trong cơ thể ngƣời sản xuất ra các protein để bảo 9
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

Tài liệu vừa đăng

Tài liệu xem nhiều nhất