Tài liệu TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THỰC TẬP: CÔNG NGHỆ ENZYME VÀ PROTEIN

VIỆN KHOA HỌC V CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI Tài liệu hướng dẫn thực tập CÔNG NGHỆ ENZYME VÀ PROTEIN ( Dùng cho học viên cao học) Phụ trách thực tập: CN. Đỗ Thị Tuyến ThS. Diệp Quỳnh Như ThS.Nguyễn thị Như Quỳnh Tp.HCM, 03/2010 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein 1. MỤC ĐÍCH - YÊU CẦU Nội dung bài thực tập này giúp sinh viên hiểu được: o Phương pháp trích ly và thu nhận enzyme bromelin từ thực vật o Phương pháp tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký lọc gel o Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease và xác định một số thông số tối ưu cho hoạt động của enzyme protease. o Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Lowry, từ đó xác định được hoạt tính riêng của enzyme. 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP [1] Thu nhận bromelin từ dứa: Trích ly, tủa enzyme và sấy phun thu nhận bromelin ở dạng bột [2] Tinh sach Enzyme bromelin bằng sắc ký lọc gel [3] Xác định hoạt tính thủy phân cơ chất casein của enzyme protease theo hãng Amano, pH 7,0. [4] Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease [5] Xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease [6] Xác định hàm lượng protein theo Lowry, từ đó xác định hoạt tính riêng của enzyme protease. 3. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC - Xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease. - Xác định được hoạt tính bromelin/gam nguyên liệu & hoạt tính riêng của enzyme bromelin. - Hiệu suất tinh sạch bromelin sau sắc ky KỸ THUẬT TRÍCH LY THU NHẬN ENZYME BROMELIN TỪ DỨA ( Ananas conosus L) NGUYÊN LIỆU: ngọn (đỉnh sinh trưởng), vỏ quả, thịt và lõi dứa Quy trình trích ly và thu nhận bromelin dạng thô Nguyên liệu được xay nhỏ, trích trong nước cất tỷ lệ 1:3 (w/w) , riêng đối với thịt quả dứa được ép lấy nước lọc qua vải màn thu dịch E thô, bỏ cặn ly tâm 2000rpm trong 5 phút- thu dịch lọc. Dịch lọc được tủa cồn 96% tỷ lệ 3V cồn:1 V dịch lọc hoặc tủa bằng (NH4)2SO4 70% bão hòa ( dịch E và dung môi tủa phải được để lạnh trước khi trộn và để tủa), thời gian để tủa khoảng 45 phút. Khi quan sát thấy cặn tủa- ly tâm 5000 rpm, 10 phút ở 50C. Thu cặn tủa- Sấy phun thu Bromelin dạng bột thô KỸ THUẬT SẤY PHUN Trang 1 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein Sấy phun là kỹ thuật làm chuyển từ một dung dịch, huyền phù hay nhủ hoá thành dạng bột. Nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: thự phẩm, dược, hoá học, vật liệu và công nghệ nano. 1. NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG Quá trình sấy phun trải qua 4 bước cơ bản sau: o o o o Mẫu dạng lỏng được phân phối thành dạng phun sương Các hạt phun sương tiếp xúc với khí nóng Làm khô các hạt phun sương Tách sản phẩm (ở dạng bột) khỏi luồng khí Hình 1: Sơ đồ cơ bản của một hệ thống sấy phun Mẫu được bơm từ một bình chứa mẫu qua 1 vòi phun – spray nozzle (2) bằng bơm lưu chất – fluid pump (1). Không khí từ máy nén khí được kiểm soát bởi một vale kim – needle vale (3) và chuyển qua vòi phun, hoà trộn với mẫu ở đầu vòi phun. Sau đó, quá trình sấy mẫu diễn ra trong buồng sấy – drying chamber (7). Lúc này, mẫu được chuyển thành dạng các hạt chất lỏng với đường kính 20 um và có diện tích bề mặt lên đến 3.000 cm2/ ml. Không khí được hút vào thiết bị bằng máy hút – aspirator (10) và được làm nóng đến nhiệt độ đã chọn (nhiệt độ set) bằng bộ gia nhiệt – heater (5). Luồng khí nóng này được hút vào buồng sấy mẫu và tiếp xúc với các hạt mẫu, làm khô nó ngay lập tức. Do diện tích bề mặt của mẫu quá lớn, hơn 90% hơi nước được làm bay hơi bằng luồng khí nóng liên tục trong buồng sấy. Trang 2 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein Hình 3: đầu phun của máy sấy phun Mẫu đã được làm khô, ở dạng bột mịn, tiếp tục được làm khô và chuyển qua một ống xoáy đặc biệt – cyclone (8), tất cả hơi nước được tách ra ở đó và được thu hồi vào bình chứa sản phẩm – product vessel (9). Quá trình làm khô này thường mất khoảng 0,5 giây hoặc ít hơn. Vì các hạt mẫu luôn được bao quanh bởi hơi nước, nên nhiệt độ xung quanh các hạt nhỏ này sẽ không thể tăng cao hơn nhiệt độ của hơi nước. Các mẫu nhạy với nhiệt, chẳng hạn enzyme, có thể được chuyển thành dạng bột mà chỉ mất một phần rất nhỏ hoạt tính, với một nhiệt độ tương đối cao (800C). Hỗn hợp hơi nước và không khí sẽ được hút ra ngoài qua máy hút. Chế độ nhiệt của quá trình vận hành sẽ được hiển thị trên khung điều khiển bằng cách kiểm soát nhiệt độ đầu vào – inlet và đầu ra – outlet, thông qua các sensor. Nếu mẫu dính vào đầu vòi phun, khí nén sẽ thổi vào đầu phun ở bộ phận phân phối – distributor (6) bằng cách mở và điện từ – electromagnetic vale (4) để loại bỏ mảng dính đó. Nếu cần thiết, không khí có thể được cho vào buồng sấy bằng cách tháo nắp – cap (11) ở bean hông ra. 2. CÁC BƯỚC VẬN HÀNH 1. Bật nút ON (CP) ở phía sau của máy 2. Bật công tắc ON (1) 3. Bật công tắc máy hút (2) 4. Điều chỉnh luồng khí vào buồng sấy mẫu bằng cách chỉnh núm số máy hút (3) Điều chỉnh nhiệt độ 5. Chọn chế độ kiểm soát INLET hoặc OUTLET (5). Nhiệt độ inlet tối đa là 230 0C. Nhiệt độ outlet tối đa là 1400C. 6. Chỉnh đèn set nhiệt độ (SV) (16) bằng cách ấn nut PV/SV (21). 7. Set giá trị nhiệt độ cần thiết bằng nút Up (23) hoặc Down (20). Khi đạt được giá trị cần set, ấn nút Enter (22). Bật ON của công tắc gia nhiệt (4). 8. Xem nhiệt độ hiện thời bằng nút PV/SV (21). 9. Khi đèn kiểm soát nhiệt (18) nhấp nháy và sự dao động nhiệt chậm lại chính là lúc nhiệt độ hiện tại PV đã được thiết lập. 10. Trong quá trình vận hành, muốn tăng nhiệt độ thì nhấn nút PV/SV (21), rồi tiếp tục theo các bước 6, 7 và 8 như trên. 11. Nếu nhiệt độ outlet hiển thị (7) vượt quá nhiệt độ cần thiết (nhiệt độ set), thì mở vale kim (14) để chỉnh áp suất vào vòi sấy. Trang 3 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein 12. Bật ON công tắc bơm (10) và (11). Sau đó, chuyển một lượng thích hợp dịch vào sấy. Nếu mẫu dùng nước làm dung môi, thì nên dùng nước tinh khiết (nước cất hay nước khử ion). 13. Khi nhiệt độ outlet đạt giá trị cần thiết, điều chỉnh tốc độ dòng khí, lượng mẫu và áp suất khí nén tương ứng sao cho phù hợp với các điều kiện yêu cầu. Chú ý: Nếu nhiệt độ inlet vẫn không thay đổi, thì theo các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ outlet như sau:    Tốc độ dòng chất lỏng mẫu Tốc độ dòng khí sấy Độ đặc (yếu tố nội tại) cao cao cao Nhiệt độ outlet Nhiệt độ outlet Nhiệt độ outlet thấp cao cao Nếu áp suất khí nén tăng, thì mẫu sẽ được sấy thành các hạt mịn hơn. 14. Khi các yếu tố biến động trên đã được set đến giá trị cần thiết (đã ổn định), thay nước cất bằng mẫu cần sấy. Lúc này nhiệt độ outlet có thể dao động nhẹ. Nếu cần, điều chỉnh tốc độ bưm mẫu và các yếu tố liên quan. 15. Khi lượng bột cần thiết đã được thu hồi trong bình sản phẩm, dừng cho mẫu vào và thay bằng nước cất trở lại. Lúc này, giảm nhẹ tốc độ bơm. 16. Tắt gia nhiệt (4). 17. Khi nhiệt độ inlet hạ xấp xỉ 1000C, tắt bơm (10) và (11). Đóng vale kim để ngừng phun. 18. Chỉnh nút của máy hút (3) về 0 một cach từ từ và tắt máy hút (2). 19. Tắt công tắt của máy chính (1). 20. Tháo bình sản phẩm ra. Đôi khi mẫu đã được sấy dính vào ống cyclone, vì vậy, cần lấy ra cẩn thận. 21. Tắt CP, khoá máy nén khí và rút day khỏi nguồn điện. 3. PHƯƠNG PHÁP VỆ SINH VÀ BẢO TRÌ MÁY 1. Tháo các bộ phận của buồng sấy mẫu và ống cyclone (đều làm bằng thuỷ tinh) cẩn thận và rửa dưới vòi nước máy. 2. Rửa tất cả các khu vực mà bột mẫu có thể bám vào như: bộ phận phân phối mẫu, sensor nhiệt outlet, ống hút khí,… 3. Loại bỏ các vết bẩn trong ống bơm mẫu bằng cách bật nút ON của công tắc bơm (10) và (11). Sau đó, bơm với nước cất. 4. Vòi phun mẫu nên được rửa bằng bể rửa siêu âm. Cần rửa bộ phận phun mẫu thật cẩn thận, vì máy sẽ không hoạt động được nếu còn bất kỳ vết dơ nào trong vòi phun. 5. Rửa màng lọc khí ở đầu khí vào của ống khí. Tháo nắp ở phía trên và kéo ống khí ra. Lấy màng lọc khí và rửa như sau: Đặt màng dưới vòi nước chảy, sau đó sấy khô Thổi bụi bằng khí nén Làm sạch bằng máy hút chân không Nếu không thể làm sạch màng thì có thể thay màng mới. 6. Làm sạch màng lọc của máy hút (khí xả) Trang 4 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein Loại các bụi bẩn dính vào đầu ra của máy hút Mở cửa sổ gắn với máy hút ở phía dưới máy chính Tháo nắp ở trên, tháo ốc gắn máy hút Tháo máy hút ra và gỡ ống gắn với máy hút Kéo máy hút sang một bên Tháo nắp ở trên máy hút. Lấy màng lọc ra Làm sạch màng lọc giống như bước 5 ở trên Lắp ráp trở lại theo trình tự ngược lại. Để lắp màng lọc, đặt bề mặt mềm ra phía người dùng. 4. CÁC CHÚ Ý KHI VẬN HÀNH 1. Các điều kiện sấy tối ưu thay đổi tuỳ thuộc vào mẫu cần sấy. 2. Một số nguyên nhân khiến lượng lớn mẫu dính vào thành của buồng sấy là: mẫu có nồng độ cao, nhiệt độ đầu vào thấp, áp suất khí nén quá cao hay quá thấp và tốc độ bơm mẫu quá cao. Do đó, cần chỉnh các điều kiện thật phù hợp. 3. Khi hướng phun mẫu thay đổi do mẫu dính vào đầu phun, cần bật ON nút pulse jet (12) để thổi sạch vết bám. Nếu điều này không làm sạch được thì tháo vòi phun ra và lau sạch bằng khăn giấy. 4. Nguyên nhân làm kết dính mẫu vào bình cyclone là do hơi nước quá bão hoà gây ra, hoặc có thể do tính chất của mẫu (độ tan chảy thấp, có khả năng kết bám,…). Để giảm lượng nước trong bột mẫu thì cần tăng nhiệt độ của mẫu. Tăng nhiệt độ đầu vào hoặc đầu ra hoặc tốc độ khí sấy hoặc giảm tốc độ bơm mẫu. Điều này làm giảm sự chênh lệch nhiệt độ đầu vào và đầu ra của ống cyclone. Nếu nguyên nhân do đặc tính của mẫu thì cần thêm vào một số chất phù hợp. 5. Khi bột mẫu có tính giữ ẩm cao, nó có thể trở nên ướt trong bình thu sản phẩm. Có thể khắc phục theo phương pháp đề cập ở mục 4, hoặc gia nhiệt bình đựng mẫu nếu cần. 6. Vòi phun chuẩn có kích thước đường kính là 406 um, nhưng nếu sấy mẫu với các hạt rắn lớn thì có thể dùng các vòi phun lớn hơn: 508 hoặc 711 um để tránh bị nghẽn đầu phun. Do sự khác nhau về kích thước của các đầu phun, nên các điều kiện sấy cũng khác nhau. Hình 5 cho thấy mối tương quan giữa áp suất và tốc độ dòng khí phun đối với vòi phun chuẩn 406 um (được hiệu chuẩn so với áp suất khí quyển). 7. Thỉnh thoảng, một số hạt mẫu rất mịn nên không thể được thu nhận bởi ống cyclone, do đó, nó bị hút ra ngoài cùng với hơi nước. Nếu bột mẫu quá mịn thì cần giảm tốc độ dòng khí sấy, hoặc giảm áp suất của dòng khí. Bột mẫu càng mịn nếu mẫu càng loãng. Do đó, cần điều chỉnh độ đặc cảu mẫu cho phù hợp. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH PROTEASE A.. Xác định hàm lượng protein theo Lowry A.1. Nguyên tắc Hầu hết các protein đều chứa hai amino acid là Tyrosin và Tryptophan, hàm lượng của những amino acid này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm lượng amino acid này như nhau. Trang 5 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu, màu này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan (Hàm lượng protein). Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu và xác định được hàm lượng protein. A.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị A.2.1.Hóa chất Na2CO3 Citrate Natri 1% NaOH 0,1M Albumin tinh khiết Thuốc thử Folin Dung dịch Albumin 0,1%: Cân chính xác 0,1 g Albumin, pha loãng với nước cất thành 100 ml dung dịch. Dung dịch A: Cân 2 g Na2CO3, hòa tan trong NaOH 0,1N thành 100 ml. Dung dịch B: Cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong Citrate Natri 1% thành 100 ml. Dung dịch C: Pha hỗn hợp dung dịch A và B theo tỷ lệ 49:1 (Chỉ pha để dùng ngay trong ngày). A.2.2. Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm Máy đo quang phổ UV-Vis Bình định mức 50 ml; 100 ml Pipet 1 ml; 5 ml; 10 ml; 25 ml A.3. Các bước tiến hành A.3.1. Dựng đường chuẩn Albumin Pha dung dịch Albumin để đạt các nồng độ: 0; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700 g/ml theo bảng sau: Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7 Hàm lượng protein g/ml 0 100 200 300 400 500 600 700 Dung dịch Albumin 0,1% (ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 Nước cất (ml) 10 9 8 7 6 5 4 3 Hút 0,5 ml dung dịch Albumin 0,1% có các nồng độ theo thứ tự 0; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700 g/ml cho vào các ống nghiệm sạch và sấy khô đã đánh số sẵn. Thêm vào đó 2 ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó thêm vào 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5 ml. Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm. Vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo hàm lượng protein chuẩn (g/ml) A.3.2. Xác định hàm lượng protein trong mẫu enzyme protease. Trang 6 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein Hút 0,5 ml dung dịch enzyme protease (đã pha sẵn ở Phần B), cho vào một ống nghiệm sạch và sấy khô. Thêm vào đó 2 ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó thêm vào 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5 ml. Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm. A.4. Tính toán Từ đường chuẩn, so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein, suy ra hàm lượng protein của 0,5 ml dung dịch enzyme protease đã pha loãng. Từ đó tính được: A.4.1. Hàm lượng protein có trong 1ml dung dịch enzyme đã pha loãng (mg protein/ml dung dịch enzyme protease đã pha loãng) A.4.2. Hàm lượng protein có trong 1g enzyme protease ban đầu (mg protein/ g enzyme protease ban đầu) B. Xác định hoạt tính enzyme protease (số tiết: 4) B.1. Nguyên tắc Dùng protein ‘casein’ làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. B.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị B.2.1.Hóa chất HCl 0,1M Na2CO3 0,4M Dung dịch Trichloracetic 0,4M Tyrosin tinh khiết NaOH 0,1M Thuốc thử Folin H3PO4 1/30M Đệm Phosphate (ph 7,0) 0,1M Dung dịch Casein 1,5%: Cân 1,5g casein từ sữa (Hãng Merck). Thêm 25 ml dung dịch NaOH 0,1 M, đun nóng trong bồn nước ở nhiệt độ 90 – 95 oC trong 10 phút. Sau khi làm lạnh, điều chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch acid phosphoric 1/30 M. Thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch đệm Phosphate (pH 7,0) 0,1M. Thêm nước cất vào dung dịch để đạt thể tích 100 ml. Enzyme Protease : Bromelin trích từ dứa ở dang thô được pha loãng trong đệm Phosphate (pH 7,0) 0,1M. B.2.2. Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm Giấy lọc Tủ ấm Bồn đun nước và giữ nhiệt Máy đo quang phổ UV-Vis Máy đo pH Bình định mức 50 ml; 100 ml; 1000 ml Pipet 1 ml; 5 ml; 10 ml; 25 ml B.3. Các bước tiến hành Trang 7 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein B.3.1. Dựng đường chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80 gTyrosin/1 ml HCl 0,1M. Thêm 5 ml dung dịch Na 2CO3 0,4 M vào 1 ml dung dịch Tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37  0,5oC trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả As10; As20; As30; As40; As50). Đối với đối chứng: dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho Tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này làm đối chứng As0). Dựng đường chuẩn theo hàm lượng g Tyrosin và độ hấp thụ. B.3.2. Xác định hoạt tính enzyme protease Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1,5% vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37  0,5oC trong 10 -15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1 ml dung dịch enzyme vào và lắc đều . Đem ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 37  0,5oC trong 60 phút. Sau đó, cho vào hỗn hợp này 2 ml dung dịch acid Trichloracetic 0,4M. Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sua đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp này. Trộn đều, để yên ở 37  0,5oC trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm (A60). Mẫu đối chứng: lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm (A0). B.4. Tính toán Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 g Tyrosin trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. B.4.1. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml dung dịch enzyme) = ({(A60 – A0) –b}/ a x 1/100 B.4.2. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = {(A60 – A0) –b}/ a x 1/100 x n Trong đó: A60: Độ hấp thụ của mẫu A0: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng a,b là các hệ số lấy từ phương trình đường chuẩn tyrosin ( y= ax+b). n: Hệ số pha loãng của enzyme 1/100: Hệ số chuyển đổi C. Tính toán hoạt tính riêng của enzyme protease Từ kết quả hàm lượng protein ở mục A.4 và kết quả hoạt tính enzyme protease của mục B.4. Tính hoạt tính riêng của enzyme: số ĐVHT/mg protein enzyme. Có 2 cách tính: B.4.1 A.4.1 B.4.2 C.2. Hoạt tính riêng (ĐVHT/ mg protein enzyme)  A.4.2 C.1. Hoạt tính riêng (ĐVHT/ mg protein enzyme)  Trang 8 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein D. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme protease. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme protease theo các giá trị pH như sau: pH 6.0; 7.0 và 9.0. Các bước thực hiện tương tự như Mục B, nhưng có một số khác biệt sau: Pha thêm dung dịch cơ chất casein 1,5% ở pH 6.0 và 9.0. Pha thêm dung dịch enzyme protease ở pH 6.0 và 9.0. E. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme protease. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme protease theo các giá trị nhiệt độ như sau: 27 oC; 37 oC; 47 oC. Các bước thực hiện tương tự như Mục B, nhưng có một số khác biệt sau: Đối với nhiệt độ 27oC: cho thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 27oC. Đối với nhiệt độ 47oC: cho thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 47oC. TINH SẠCH ENZYME PROTEASE BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL A. Tinh sạch và xác định thành phần của enzyme protease bằng sắc ký lọc gel (4 tiết) 1. Nguyên tắc Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. 2. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ 2.1. Dụng cu và thiết bị Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ. Phễu đổ gel Bình hút chân không Flow Adaptor 1,5 cm. Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm; thể tích: 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 () = 30 x (1,5/2)2 x 3,14). Bình đựng dung dịch đệm Ong nghiệm: 50 cái. Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch 2.2. Hóa chất Gel “Bio-Gel P-100”, hãng Bio-Rad có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 4590 m; khả năng ngậm nước: 12 ml/1 g gel khô; phạm vi phân tách: 5.000-100.000 daltons. Đệm phosphate 0,1M; pH 7.0: khử bọt khí trước khi dùng 3. Các bước tiến hành 3.1. Chuẩn bị gel Cân 5 g gel “Bio-Gel P-100” khô (chính xác cần dùng 4,4 g nhưng vì thể tích gel sẽ bị mất trong suốt quá trình thao tác nên cần cân dư), cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH 7.0 đựng trong cốc . Dùng dung dịch đệm phosphate pH 7.0 nhiều gấp 2 Trang 9 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 = 106 ml dung dịch đệm. Đối với các gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 giờ ở 20oC để hydrate hóa hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 100oC. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong suốt quá trình hydrate hóa. Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư gel. Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106ml) và lắc nhe. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để lọai các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại > 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel. Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 đến 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel (packed). Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị. 3.2. Chuẩn bị mẫu Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn); hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột. Nếu vì tính chất của mẫu mà không thể đem lọc được thì nên ly tâm mẫu. 3.3. Thu và xác định mẫu tách được. Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector trong hệ sắc ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP Data View trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml. B. Xác định hàm lượng protein và hoạt tính của enzyme protease sau tinh sạch (4 tiết). Thu các fraction chứa dịch enzyme protease đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Amano, pH 7.0 như Mục B Bài 1 và hàm lượng protein theo phương pháp Lowry như Mục A Bài 1. B.1. Hàm lượng protein sau tinh sạch tính bằng đơn vị mg protein/ ml dung dịch enzyme sau tinh sạch. B.2. Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch tính bằng đơn vị ĐVHT/ ml dung dịch enzyme sau tinh sạch. Trang 10 Thöïc taäp moân: Coâng ngheä enzyme vaø protein C. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. HTenzyme2 Hiệu suất về hoạt tính enzyme  HTenzyme1 x100 Trong đó: HTenzyme1: Hoạt tính enzyme protease trước tinh sạch (ĐVHT/ml dung dịch enzyme trước tinh sạch). HTenzyme2: Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (ĐVHT/ml dung dịch enzyme sau tinh sạch). HTenzyme2 Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch (mg/ml)  HLproteinsautinhsach Hoattinhriengenzyme2 Độ tinh sạch của enzyme protease sau sắc ký  Hoattinhriengenzyme1 Trong đó: Hoattinhriengenzyme1: Hoạt tính riêng của enzyme protease trước tinh sạch. Hoattinhriengenzyme2: Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amano (2002). Protease N “Amano” – Assay method for Protease activity (Amano method, pH 7.0). 2. Bio-Rad (2000). Bio-Gel P Polyacrylamide Gel- Instrution Manual. 3. Bollag, D.M., Rozycki, M.D., Edelstein, S.J. (1996). Protein Methods. A John Wiley & Sons, Inc, Publication. 4. Boyer, R.F. (1993). Modern experimental Biochemistry. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 5. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chín (2000). Thực tập lớn Sinh hóa. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM. 6. Nguyễn Tiến Thắng (2003). Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm Sinh học. Viện Sinh học Nhiệt đới. Trang 11