Tài liệu Tách dòng và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn atyucca6 từ cây arabidopsis thaliana

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MA THỊ THU LỆ TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE CHỊU HẠN AtYUCCA6 TỪ CÂY Arabidopsis thaliana LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MA THỊ THU LỆ TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE CHỊU HẠN AtYUCCA6 TỪ CÂY Arabidopsis thaliana Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Tiến Dũng 2. GS TS. Ngô Xuân Bình Thái Nguyên - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công bố trước đây. Thái Nguyên, ngày 2 tháng 8 năm 2019 Tác giả Ma Thị Thu Lệ ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Tiến Dũng và GS TS. Ngô Xuân Bình đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến các cán bộ, giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ........................................... v DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................... vi DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................ vii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2 3. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Ảnh hưởng của hạn đối với thực vật ...................................................... 3 1.2. Đáp ứng hạn của thực vật ....................................................................... 6 1.3. Nhóm gene chịu hạn AtYUCCA và đặc điểm của gene chịu hạn AtYUCCA6 .............................................................................................................. 11 1.4. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn ........................... 13 1.4.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gene chịu hạn ................................. 13 1.4.2. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6.... 15 1.5. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium .................. 16 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 18 2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu .............................................. 18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................... 18 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 18 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 18 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 18 2.2.2. Thời gian nghiên cứu ..................................................................... 18 2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu.................................................. 18 2.3.1. Vật liêu nghiên cứu ........................................................................ 18 2.3.2. Hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu ............................................ 19 iv 2.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 21 2.4.1. Nội dung 1: Sàng lọc gen chịu hạn AtYUCCA6........................... 21 2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng gen AtYUCCA6 ...................................... 21 2.4.3. Nội dung 3: Thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6 .................. 22 2.4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana....... 22 2.5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 22 2.5.1. Sàng lọc gene chịu hạn AtYUCCA6 ............................................. 22 2.5.2. Tách dòng gene AtYUCCA6 ......................................................... 22 2.5.3. Phương pháp thiết kế vector chuyển gene AtYUCCA6 ................ 28 2.5.4. Phương pháp chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana............... 29 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 33 3.1. Phân tích gene AtYUCCA6 trên cơ sở dữ liệu database ..................... 33 3.2. Tách dòng gene AtYUCCA6 ............................................................... 34 3.3. Gắn vào vector chuyển gene ................................................................ 39 3.4. Tạo cây Arabidopsis chuyển gene AtYUCCA6................................... 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 45 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 50 v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ABA : Axit abxixic BR : Brassinosteroid DREB : Dehydration - responsive element binding ERF : Ethylene - responsive factor FMOs : Monooxygenease flavin GPCRs : G-protein-couple receptor IAA : Indole-3-acetic acid PBS : pBluescript) RAV : Related to ABI3/VP1 RLKs : Eceptor-like kinase ROS : Reactive oxygene species T6P : Trehalose - 6 - phosphate Trp : Tryptophan vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn .................................. 8 Hình 1.2. Sơ đồ chuyển đổi Trp thành IAA có sự tham gia của YUCs ............. 11 Hình 2.1. Sơ đồ tạo cây A. thaliana chuyển gen ................................................ 30 Hình 3.1. Vị trí của gen AtYUCCA6 (At5g25620) trên nhiễm sắc thể số 5 ..... 33 Hình 3.2 . Cấu trúc gen AtYUCCA6................................................................... 33 Hình 3.3. Biểu hiện của gene AtYUCCA6 ở cây Arabidopsis thaliana ............. 34 Hình 3.4 . Trình tự vùng mã hóa của gen AtYUCCA6 và trình tự protein tương ứng. .......................................................................................... 35 Hình 3.5. Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng và vector chuyển gene AtYUCCA6. ...................................................................................... 37 Hình 3.6. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gene AtYUCCA6 bằng PCR và enzyme giới hạn. ........................................................................... 38 Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gene tách dòng AtYUCCA6 với cặp mổi ngược M13. ........................................................................................ 38 Hình 3.8. Kết quả giải trình kiểm tra kết quả thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6 ....................................................................................... 40 Hình 3.9. Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR sử dụng cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R. ................................................................ 42 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 19 Bảng 2.2. Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ...................... 19 Bảng 2.3. Trang thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu ................................... 21 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ............................................... 23 Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................... 24 Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ......................................................... 24 Bảng 2.7. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid ............................................. 26 Bảng 3.1. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen AtYUCCA6 trên môi trường kháng sinh kanamycin ......................................................................... 41 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hạn hán là một trong những yếu tố thách thức nền an ninh lương thực thế giới vào thế kỉ 21. Trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, ở Việt Nam, hạn hán xảy ra ngày càng thường xuyên hơn, ở nhiều vùng rộng lớn, với mức độ và thời gian khác nhau gây thiệt hại to lớn đối với kinh tế xã hội, đặc biệt là sản xuất nông nghiệp. Vấn đề càng trở nên cấp thiết khi hầu hết đất canh tác bị hạn lại tập trung ở vùng sâu vùng xa - nơi mà cuộc sống của người dân còn nhiều thiếu thốn, chủ yếu dựa vào sản phẩm nông nghiệp. Vì vậy, việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gene có tính chịu hạn cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc giữ vững và nâng cao năng suất cây trồng, góp phần xóa đói giảm nghèo, ổn định xã hội. Trong cơ thể thực vật, hạn hán gây ra nhiều phản ứng, từ việc thay đổi biểu hiện gene, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến mức sinh trưởng và năng suất cây trồng. Ở mức độ phân tử, yếu tố môi trường bất lợi làm gia tăng mức độ biểu hiện và tích lũy của hàng loạt các gene đáp ứng điều kiện hạn, bao gồm các gene liên quan đến tổng hợp chất điều hòa thẩm thấu, các gene mã hóa cho các protein, các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã [37]. Trong đó, các yếu tố phiên mã được nghiên cứu nhiều bởi hoạt động của chúng gây tác động đến sự biểu hiện của hàng loạt các đáp ứng với điều kiện bất lợi của môi trường. AtYUCCA6 là một gene thuộc họ gene YUCCA mã hóa cho protein nhóm flavin monooxyenases có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp auxin - hormone sinh trưởng có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của tế bào và cơ thể thực vật. Auxin kích thích sự phát triển của rễ, thúc đẩy sự hấp thụ và vận chuyển nước trong cây, giúp cây vượt qua điều kiện hạn hán, bất lợi [30]. Nhiều bài báo Quốc tế đã chỉ rằng sự có mặt và tăng cường biểu hiện của gene AtYUCCA6 làm tăng khả năng chịu hạn của cây do thúc đẩy tổng hợp auxin trong cơ thể thực vật [45, 32]. Tuy nhiên, cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có một công trình nào nghiên cứu phân lập có hệ thống gene AtYUCCA6. 2 Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6. - Nghiên cứu chuyển gene và đánh giá biểu hiện của gene trên cây Arabidopsis thaliana. 3. Đối tượng nghiên cứu - Gen chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài * Về mặt khoa học - Việc tách dòng và phát triển thành công vector chuyển gene thực vật mang cấu trúc gene AtYUCCA6 góp phần khẳng định cơ sở khoa học của kỹ thuật chuyển gene trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây. - Toàn bộ nghiên cứu là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy. * Về mặt thực tiễn - Kết quả thiết kế vector chuyển gene thực vật mang gene AtYUCCA6 liên quan đến tính chịu hạn của cây là vật liệu quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gene trong cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Ảnh hưởng của hạn đối với thực vật Hạn đối với thực vật là khái niệm đựợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Môi trường khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển [4].. Hạ 4].ối với thực ác yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và năng suất cây trồng. Hạn làm thay đổi nhiều quá trình sinh lý và có thể làm bi 4].ối với thực ác yếu tố môi tH 4].ối với thực ác yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và năng suất câng mưa, giảm lượng ẩm trong không khí, suy kiệt dòng chảy sông suối, hạ thấp mực nước ao hồ, mực nước trong các tầng chứa nước dưới đất, … Xét trên mối quan hệ giữa hạn với thực vật, hạn của môi trường được chia làm hai kiểu: Hạn đất và hạn không khí [3]. - Hạn đất: Hạn đất xuất hiện khi không có mưa trong thời gian dài, khi cây không thể hút đủ nước bù đắp lại lượng nước mất đi qua con đường thoát hơi nước, dẫn tới sự mất cân bằng nước trong cây và cây có dấu hiệu bị khô héo. - Hạn không khí: Hạn không khí xuất hiện khi độ ẩm tương đối của không khí giảm xuống quá thấp, gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên trong lá dưới khí khổng và không gian ngay bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh, gây nên sự mất cân bằng nước trong mô cây và cây bị héo a. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của thực vật trước các điều kiện phi sinh học. Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối cao là những yếu tố gây hại lớn nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thực vật. Nhiệt độ cao ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc protein, màng sinh chất và làm ngừng các quá trình 4 quang hợp, hô hấp nội bào và thậm chí có thể gây chết tế bào hàng loạt. Trong khi đó, hạn và mặn làm giảm thế nước của thực vật, làm tế bào không thể phát triển, phá vỡ các protein trong tế bào, gây mất cân bằng ion dẫn đến các hoạt động trao đổi chất bị đình trệ, quang hợp bị ức chế và có thể gây chết tế bào [2]. b. Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là ngừng sinh trưởng. Sự hạn chế sinh trưởng của chồi trong điều kiện hạn làm giảm nhu cầu trao đổi chất của thực vật và kích thích các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất bảo vệ, điều chỉnh thẩm thấu. Sự ngưng sinh trưởng ở rễ cho phép mô phân sinh của rễ vẫn thực hiện chức năng và phát triển nhanh chóng khi điều kiện bất lợi giảm. Hạn chế sự phát triển rễ bên cũng là một cách thức đáp ứng hạn, điều này thúc đẩy sự sinh trưởng của rễ chính, giúp tăng cường khả năng hấp thu nước từ các tầng đất sâu hơn. Nước sẵn có trong tế bào bị giảm do thiếu hụt nước từ rễ lên lá, gây ra bởi sự đóng khí khổng. Quá trình dẫn truyền nước trong cây giảm làm giảm nhu cầu dinh dưỡng của chồi, nó cũng cản trở sự dẫn truyền trong mạch gỗ và có thể hình thành một đáp ứng thích nghi. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một cách đối phó với hạn của thực vật. Sự tổng hợp các chất tan như polyol và proline trong điều kiện bất lợi giúp thực vật ngăn chặn sự mất nước và các chất này đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sức trương của tế bào [3]. Sự thay đổi trong sinh trưởng cùng với việc giảm hoạt động của cơ quan quang hợp do sự tiếp xúc với điều kiện bất lợi trước đó dẫn đến sự biến đổi trong sự phân chia nguồn carbon giữa các tế bào/mô sản xuất và tế bào/mô tích trữ. Vì vậy, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh trưởng trong điều kiện bình thường bây giờ được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu [1]. c. Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA khiến cho khí khổng đóng lại. Điều này làm giảm hàm lượng CO2 trong mô lá và cản trở quá trình 5 quang hợp. Sự cản trở quá trình quang hợp sẽ mất đi và quang hợp sẽ phục hồi nếu khí khổng mở ra khi điều kiện trở lại bình thường. Một vài loài thực vật đã sử dụng sản phẩm của quang hợp để điều chỉnh thẩm thấu, điều này giúp ngăn cản sự mất sức trương của tế bào. Sự hạn chế CO2 do kéo dài thời gian đóng khí khổng trong điều kiện bất lợi dẫn đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả năng vận chuyển electron, điều này có thể làm giảm các phân tử oxy và tăng cường các dạng ROS (reactive oxygene species). ROS là các phân tử hóa học chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng như superoxide, hydropeoxide, hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gây tác động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA và RNA), protein và lipid. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào [3]. d. Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào Sinh trưg của hạn đến hô hấp nội bàoc chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp 2 đưh trưg của hạn đến hô hấp nội bào2 thh trưg của hạn đến hô hấp nội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp - ATP, nưg của hạn đến hô hấp nội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gt triển của thực vật). Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng và dẫn đến sự tăng cường hô hấp. Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là do sự kích hoạt các quá trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu và chống oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [1]. e. Ảnh hưởng của hạn đến hormone Hormone thcủa hạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gt triển của tàm khí khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng của thực vật, vì vậy nó cho phép thực vật thích ứng với điều kiện hạn [1]. Ở 6 lúa mne thcủa hạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyhống chịu hạn. Kết quả theo dõi 9cis- epoxycarotenoid dioxygenease (NCED3), mhạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các A. thaliana trong điana, mhạn đến hormonenội bệ số hô hấp được hiong[34]. Bên c điana, mhạn đến hormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chống chịu với hạn. Ở lúa mì, khả năng chống chịu hạn đã được hỗ trợ bởi sự giảm hàm lượng indole-3-acetic acid (IAA) ormo. Tuy nhiên, có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai đoạn đầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chống chịu với hạn ở giai đoạn sau [2]. S2]. nhiên, có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai đoạn đầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chcytokinin cũng gihiên, có m(IAA) ormonenộ1]. gihiên, có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai đoạn đầu tiếp Cytokinin đư có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai có sự tăng cường biểu hiện của gene ipt liên quan đm(IAA) ormonenội bệ số hôn dẫn đến những đáp ứng hạn. Cytokinin cũng gây ng hạnnenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai có sự tăng cường biểu hiện của đó giúp thực vật tậchịu hạn của A.thaliana đưhalianan cũ.. Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vật chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học. BR làm tăng cường khả năng hấp thu nước và ổn định màng cũng như làm giảm sự rò rỉ ion khỏi màng ở lúa mì khi chống chịu với hạn. 1.2. Đáp ứng hạn của thực vật Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền, thể hiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý. Một số giảm thiểu sự thoát hơi nước nhờ có lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, thân mọng nước, lá có thể tiêu giảm, sử dụng nước hiệu quả bằng cách tiến hành quang hợp theo con đường CAM. Một số ngừng sinh trưởng cho đến khi điều kiện trở lại bình thường. Một số có chu kỳ sinh dưỡng 7 ngắn, chỉ trong vài tuần. Khi có mưa, đất ẩm, hạt giống của chúng nảy mầm. Chúng sinh trưởng và phát triển thật nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khô hạn đến [3]. Thực vật có những cơ chế đáp ứng giúp chúng tăng cường tính chống chịu đối với các điều kiện bất lợi trên. Hệ thống mô hình xử lý hạn cho cây mô hình A. thaliana đã được Amal Harb và cs thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của cây khi bị hạn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua ba giai đoạn: giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đáp ứng tập chống chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [25]. Thực vật đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA. Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi trường được tế bào tiếp nhận và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường hoặc thông qua ABA hoặc không thông qua ABA. Các yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gene liên quan đến tính chống chịu. Các đáp ứng này sẽ bị mất dần khi điều kiện bất lợi mất đi [6]. Thực vật cảm nhận các yếu tố bất lợi, hay các tác nhân từ môi trường nói chung thông qua hàng loạt các thụ thể bề mặt tế bào như các serine/threonine-like receptor kinase, được gọi chung là các receptor-like kinase (RLKs), các thụ thể liên kết với kênh ion (ion chanel-linked receptor), các G-protein-couple receptor (GPCRs) và các thụ thể histidine kinase. Các kênh Ca2+ cho phép Ca2+ được chuyển vào tế bào chất khi được kích hoạt bởi các yếu tố bất lợi. Vì vậy các kênh này hoạt động như các các thụ thể liên kết với kênh ion của yếu tố bất lợi. GPCRs là một nhóm thụ thể màng khác. Trong điều kiện bất lợi, chúng kích hoạt các enzyme phospholipase C hoặc D và chuyển hóa thành các tín hiệu [9]. Các thụ thể nội bào ABA, PYR/RCAR, là các tín hiệu của yếu tố bất lợi gây ra bởi hạn, thông qua kích hoạt serine/threonine kinase SnRK2 trong đáp ứng với ABA [73]. Do sự tổng hợp ABA dẫn đến tăng cường đáp ứng với điều kiện bất lợi, thụ thể ABA có thể được coi là một thiết bị cảm biến yếu tố bất lợi. 8 Hình 1.1. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn [1] 9 Trong quá trình tiếp nhận tín hiệu bất lợi từ môi trường không thông qua ABA, đường là một hợp chất quan trọng. Các hexokinase là thiết bị cảm biến đường ở thực vật, chúng đóng vai trò ngăn chặn sự biểu hiện các gene liên quan đến quá trình quang hợp khi hàm lượng hexose trong tế bào lá cao [4]. Trehalose - 6 phosphate (T6P) là một phân tử đường tín hiệu, có chức năng điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển và làm tăng hàm lượng sucrose trong thời kỳ ra hoa. Sự tăng cường biểu hiện của T6P ở ngô trong thời kỳ ra hoa giúp cải thiện năng suất trong điều kiện hạn. ROS là sản phẩm của các quá trình trao đổi chất trong điều kiện bất lợi, cũng là những phân tử tín hiệu quan trọng [1]. Các tín hiệu oxi hóa được chuyển qua tín hiệu trung gian thứ hai như Ca2+ hoặc phosphatidic acid (PA) - kích hoạt protein kinase serine/threonine và mitogene - activated protein kinase (MAP) dẫn đến sự phiên mã của các gene đóng vai trò quan trọng trong tập chống chịu. • Cơ chế truyền tín hiệu Các tín hiệu được các thụ thể tiếp nhận sau đó truyền lại cho các phân tử tín hiệu thứ hai như các protein kinase, các phosphatase (serine/threonine phosphatases), các phospholipid như phosphoinositides. ROS, Ca2+, nitric oxide, cAMP và các phân tử đường đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu [1]. Trong điều kiện bất lợi gây ra bởi những yếu tố khác nhau có nhiều phân tử tín hiệu giống nhau. Điều này chỉ ra rằng các con đường đáp ứng các điều kiện bất lợi khác nhau có thể xảy ra nhờ những chất truyền tín hiệu chung. Các phân tử protein kinase kích hoạt phân chia tế bào thông qua quá trình phosphoryl hóa các protein và là một trong các cơ chế chính của quá trình truyền tín hiệu. Hàm lượng canxi trong tế bào chất tăng trong điều kiện bất lợi. Ca2+ trong tế bào chất tăng lên chủ yếu từ ngoài vào tế bào qua màng hoặc được huy động từ nguồn dự trữ trong tế bào, cụ thể là từ không bào. Một vài kênh cảm ứng Ca2+ như calmodulin (CaM) hay CaM - binding protein đã được tìm thấy trong tế bào tham gia truyền tín hiệu đến nhân thông qua các tín hiệu như phospholipase hay Ca2+ dependent kinase [4]. 10 • Điều khiển phiên mã trong biểu hiện gene Một số lượng lớn các gene được tìm ra liên quan đến các đáp ứng với điều kiện bất lợi [34]. Microarray DNA cung cấp thông tin có ý nghĩa lớn trong việc phân tích biểu hiện của toàn bộ hệ gene và đã được sử dụng để nghiên cứu các mô hình biểu hiện gene ở các đáp ứng với hạn hoặc mặn ở một số loài thực vật. [37, 29, 26, 23]. Các gene tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn bao gồm các gene liên quan đến tổng hợp các chất điều hòa thẩm thấu, các gene mã hóa cho các protein LEA, aquaporin, các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã. Trong đó, các gene mã hóa cho các yếu tố phiên mã được quan tâm nhiều bởi các yếu tố phiên mã hoạt động như những công tắc tác động đến hàng loạt các gene đáp ứng với điều kiện bất lợi [11]. Có hơn 100 yếu tố phiên mã mà sự biểu hiện của chúng được tăng cường khi tiếp xúc với điều kiện hạn, chúng đã được tìm ra bằng phân tích toàn bộ hệ phiên mã ở cây A.thaliana tiếp xúc với hạn [35]. Hạn làm tăng cường mức độ biểu hiện của các gene, được điều khiển bởi các yếu tố phiên mã thuộc họ bZIP, AP2/ERF, HD-ZIP, MYB, Bhlh, NAC, NFY, EAR và ZPT2 [44]. Những yếu tố phiên mã này được kích hoạt bởi các tín hiệu hạn. Do hạn xảy ra cùng với sự tăng lên về hàm lượng ABA, một vài yếu tố phiên mã được kích hoạt bởi ABA. Những các yếu tố phiên mã đáp ứng ABA (ABFs) chủ yếu thuộc họ bZIP và kết hợp với các yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) trong các promoter của các gene đáp ứng hạn [44, 26]. Trong khi đó, sự hoạt động của một số gene mã hóa yếu tố phiên mã họ CBF/DRE, NAC và ZF-HD lại không phụ thuộc ABA. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động của các gene mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ AP2/ERF được điều khiển qua cả 2 con đường phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA. APETALA2/ethylene response element - binding protein (AP2/EREBP) là họ yếu tố phiên mã chính trong các họ yếu tố phiên mã ở A.thaliana, gồm 147 gene, chiếm 9% các yếu tố phiên mã [17]. Ở thực vật bậc cao, có gần 200 gene yếu tố phiên mã AP2 đã được báo cáo. Dựa vào sự có mặt của một hoặc hai AP2 - DNA, họ gene này được chia thành 4 phân họ: AP2, DREB, ERF, RAV. Phân họ AP2 mã hóa cho các protein có hai AP2 domain và các protein này liên quan đến các quá trình sinh 11 trưởng như phát triển các mô phân sinh, các bào quan và sự phát triển hoa. Các phân họ DREB (dehydration - responsive element binding), ERF (ethylene responsive factor) và RAV (related to ABI3/VP1) mã hóa cho các protein chứa một AP2 domain và các thành viên trong phân họ gene này liên quan đến hệ thống truyền tín hiệu [38, 20]. 1.3. Nhóm gene chịu hạn AtYUCCA và đặc điểm của gene chịu hạn AtYUCCA6 AtYUCCA6 là một gene thuộc họ YUCCA trên NST số 5 của các cây thuộc họ Arabidopsis thaliana, mã hóa protein monooxygenease flavin (FMOs). FMOs tham gia xúc tác cho một giai đoạn quan trọng trong việc tổng hợp axit lndole-3acetic (IAA) - một loại auxin chính trong cơ thể thực vật, từ tiền chất tryptophan (Trp) . Gần đây, một con đường hai bước chuyển đổi Trp thành IAA đã được đề xuất là con đường sinh tổng hợp IAA chính trong thực vật (Hình 1.2). Hình 1.2. Sơ đồ chuyển đổi Trp thành IAA có sự tham gia của YUCs [32] Trp đầu tiên được loại bỏ nhóm amin chuyển thành indole-3-pyruvate (IPA) bởi họ aminotransferases TAA1. Sau đó, các monooxygeneases có chứa flavin trong họ YUC xúc tác cho việc sản xuất IAA bằng cách sử dụng IPA làm chất nền [44]. Phản ứng xúc tác YUC là bước giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp auxin. Gene YUC đã được xác định trong tất cả các bộ gene thực vật đã được giải trình tự, cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp auxin qua trung gian YUC phổ biến và cần thiết đối với sự phát triển của thực vật. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức gene YUC trong cây dạ yến thảo, thuốc lá, và cây lúa dẫn đến sự sản sinh quá mức auxin [32, 31, 27, 16].