Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã
hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam
Lê Hồng Thu
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: PGS. TS. Võ Thị Thương Lan
Năm bảo vệ: 2012
Abstract: Tổng quan về G protein; họ tachykinin ở động vật có vú; thụ thể họ tachykinin
và thụ thể neurokinin-1; ứng dụng của thụ thể neurokinin-1 trong điều trị bệnh; vector
biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Trình bày nguyên liệu và phương pháp
nghiên cứu: Tách RNA tổng số; phản ứng phiên mã ngược; phản ứng PCR (Polymerase
Chain Reaction); Tinh sạch DAN bằng phương pháp thôi gel; nối ghép các đoạn DNA
vào vector; kỹ thuật biến nạp; sàng lọc khuẩn lạc; tách plasmid kĩ thuật cắt sử dụng
enzyme giới hạn; ký thuật điện di; phân tích trình tự cDnA của cDNA-NK1. Đưa ra kết
quả và thảo luận: Tách dòng gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ phổi người; thiết kế
vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.
Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Người Việt Nam; Thụ thể
neurokinin-1; Cấu trúc protein
Content
MỞ ĐẦU
Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein. Khi thụ thể
này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh
ngoại vi về trung ương thần kinh, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt
khác chúng cũng có tác dụng gây kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của
cơ thể.
Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược
phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau
cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh
nhân ung thư, … Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam còn rất
ít hoặc chưa được công bố. Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hoàn chỉnh
mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật để có
thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam,
chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam”. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh
học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein và
Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống,Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN
1.1
1.1.1. G protein
G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cứu tác
động của adrenaline đối với tế bào. Với công trình này, hai ông đã giành giải Nobel lý sinh – y
học năm 1994 [4].
G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein
(GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào.
1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein
Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine)
[45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine,
chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử. Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể
liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức
năng [52].
1.2
HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ
Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong cơ thể của tất cả
các loài động vật. Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không
xương và có xương sống [15, 45].
Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi Euler và Gaddum
khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn. Dịch chiết này có tác dụng kích
thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm huyết áp ở thỏ [21]. Tuy nhiên, rất nhiều thí
nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công.
Bốn mươi năm sau đó (năm 1970), Chang và Leeman mới tinh sạch được SP từ vùng dưới đồi
của bò [14] và đến năm 1973, Studer và cộng sự đã phân lập, tinh sạch SP, đồng thời giải trình tự
gene mã hóa cho SP từ ruột ngựa [50]. Năm 1983, Kangawa và Kimura đã phân lập được thêm
hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP là neurokinin A (NKA) và neurokinin B
(NKB) từ vùng thần kinh trung ương và ngoại vi [31, 33]. Hiện nay, tachykinin trong mô động
vật có vú đã được xác định gồm có chất P (hay SP), neurokinin A (hay neuromedin L hoặc chất
K) và neurokinin B (hay neuromedin K). Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng là neuropeptide
K và neuropeptide γ
1.3
THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1
1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin
Thụ thể của họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với G protein (Hình 1).
Tương tự như thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 vùng xuyên màng đặc trưng được nối
với nhau bởi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh chất (exoloop và cytoloop). Những
vòng ở phía ngoài màng tế bào của thụ thể liên kết với G protein có chức năng lựa chọn cấu tử
gắn đặc hiệu trong khi các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoạt tính của thụ thể.
Người ta phân loại TACR dựa vào sự sai khác trong các trình tự này [45].
1.4
ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH
Từ những hiểu biết về chức năng của thụ thể neurokinin 1 hứa hẹn đây sẽ là đích tác động hiệu
quả cho các phương pháp điều trị một số căn bệnh có liên quan. Do đó cũng không có gì ngạc
nhiên khi nhiều hãng dược phẩm lớn tập trung nghiên cứu về thụ thể tachykinin nhằm tìm ra các
chất đối vận của chúng để ứng dụng trong điều trị bệnh: làm thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm
cảm, chữa các bệnh đường hô hấp,… Sự phát hiện ra các chất đối vận với thụ thể NK1 cũng là
một mắt xích quan trọng trong việc thay đổi hướng điều trị trong việc ngăn ngừa chứng buồn nôn
và sự nôn mửa do tác dụng của hóa trị liệu ung thư. Tuy đến nay các nghiên cứu về chất đối vận
với thụ thể tachykinin vẫn chưa đạt được kết quả như mong đợi và gặp rất nhiều khó khăn,
nhưng việc sử dụng thụ thể NK1 làm đích tác động của thuốc vẫn là một bài tóan hay và khó cho
nhiều nhà nghiên cứu. Trong đó các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào những phân tử không có
bản chất peptide có khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thần kinh. Trong tương lai, chất này
hứa hẹn sẽ cho phép điều trị bệnh liên quan tới chứng nghiện rượu [13], …
1.5
VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1
Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein được dung hợp vào nhiều hệ vector và
nhiều dòng tế bào khác nhau. Người ta đã thử biểu hiện chúng trên cả tế bào nhân sơ và cả trên tế
bào nhân thực. Tuy nhiên, do thụ thể liên kết với G protein thường được biến đổi sau dịch mã
bằng cách gắn thêm carbonhydrate hoặc lipid hóa… nên việc biểu hiện trên hệ thống tế bào nhân
sơ thường không cho kết quả như mong muốn.
Theo các nghiên cứu đã công bố, NK1 được biểu hiện trong vector pCDNA [24],
pMAM-neo [24; 28], pVLl393 [32], pAHygCMV1 [49]… ở các chủng tế bào HEK293, COS-7,
CHO, … đều cho kết quả khả quan. Một nghiên cứu gần đây năm 2006 của Farahdiba và cộng sự
khi nghiên cứu truyền tin của thụ thể β-arrestin 1 đã tiến hành dung hợp gen mã hóa cho thụ thể
này với gen mã hóa cho NK1 và biểu hiện chúng trong hai hệ vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1
cũng cho kết quả tốt. Đây là tiền đề cho chúng tôi lựa chọn và thiết kế vector biểu hiện pCDNA3
và pEGFP-N1 trong đề tài.
pCDNA3 và pEGFP-N1 là vector biểu hiện ở tế bào động vật với các đặc điểm được trình bày
trong phụ lục.
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
Mẫu phổi tươi của người bị ung thư phổi được cung cấp bởi Viện Quân Y 103 (kí hiệu H211 lấy
ngày 25/1/2011).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Mẫu phổi tươi
Tách RNA tổng số
Tổng hợp cDNA
Khuếch đại đoạn 5’-NK1
Khuếch đại đoạn 3’-NK1
Tách dòng đoạn 5’-NK1
Tách dòng đoạn 3’-NK1
Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã hóa cho
thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI
3.1.1. Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người
RNA tổng số từ mẫu phổi tươi được tách chiết bằng kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit
(Bioneer). Sau đó, cDNA được tổng hợp nhờ phản ứng phiên mã ngược sử dụng RNA tổng số và
mồi hexamer. Thành phần và điều kiện của phản ứng tổng hợp cDNA được trình bày trong Bảng
9.
Bảng 9: Thành phần và điều kiện phản ứng tổng hợp cDNA của gen neurokinin-1
Thể tích (µl) Điều kiện
Thành phần
RNA tổng số
13.0
Mồi hexamer (100 µM)
1.5
dNTPs (10 mM)
2.5
Đệm 5x
5.0
Ủ 700 trong 5’ để biến tính
- Gắn mồi: 250 trong 10 phút
AMV RTase
3.0
Tổng
25.0
- Kéo dài: 370 trong 90 phút
- Bất hoạt enzyme: 850 trong 5 phút
Sản phẩm cDNA được bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Đoạn cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 sẽ được tách dòng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và
đoạn 3’-NK1. Hai đoạn này sau đó sẽ được nối với nhau để tạo nên cDNA hoàn chỉnh như sơ đồ
Hình 6.
NK1 F
NK1 R1
76 bp
94 bp
NK1 F1
NK1 R
Đoạn 5’–NK1 (788 bp)
CCCGG 94 bp
G
76 bp
Đoạn 3’- NK1 (728 bp)
CCCGG
G
Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1
Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA được tổng hợp từ phản ứng phiên
mã ngược để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1. Thành phần
và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 10.
Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa
cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl) Điều kiện
10.4
H2O
Đệm 10x (MgCl2 20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R1 (2 µM)
0.5
Pfu polymerase
0.1
cDNA
1.0
Tổng
15.0
- Thời gian biến tính đầu tiên:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 45 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây
+Gắn mồi : 600C, 30 giây
+Tổng hợp: 720C, 150 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose. Kết quả điện di cho một băng DNA có kích thước
xấp xỉ 800 bp (Hình 7). Đây là kích thước đúng với tính toán cho đoạn 5’-NK1.
Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1. Giếng ĐC: đối chứng âm không có cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại
đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để
chuẩn bị cho phản ứng tách dòng đoạn 5’-NK1 của cDNA.
3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA làm khuôn cho phản ứng
PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1. Tuy nhiên, sản phẩm PCR gồm các băng DNA không đặc hiệu và không có băng
DNA với kích thước 728 bp như mong đợi (Hình 8).
Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.
Lặp lại phản ứng nhiều lần và thay đổi các điều kiện về nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,…
chúng tôi vẫn không thu được băng mong muốn. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện phản
ứng phiên mã ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số. Thành phần và điều
kiện của phản ứng phiên mã ngược được thực hiện như trong Bảng 11, chỉ thay đổi mồi hexamer
bằng mồi oligoT. Sau đó, cDNA này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại
đoạn 3’-NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng
được trình bày trong Bảng 11.
Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa
cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần
Thể tích (µl) Điều kiện
H2O
10.4
Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5
- Thời gian biến tính đầu tiên:
94oC, 5 phút
dNTPs (2 mM)
1.0
- Lặp lại 45 chu kì:
NK1 F1 (2 µM)
0.5
+Biến tính: 940C, 30 giây
NK1 R (2 µM)
0.5
+Gắn mồi : 600C, 30 giây
Pfu polymerase
0.1
cDNA
1.0
Tổng
15.0
+Tổng hợp: 720C, 150 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 9). Kết quả cho thấy bên cạnh băng DNA
không đặc hiệu thì đã xuất hiện băng DNA có kích thước lớn hơn 700 bp phù hợp với kích thước
đoạn 3’–NK1. Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sạch
đoạn 3’-NK1.
Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại
đoạn 3’-NK1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn SY100.
3.1.4. Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Sau khi đã tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng
phản ứng nối sử dụng kit Gene JET TM PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phần của phản ứng
nối được trình bày trong Bảng 12.
Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1 vào vector pJET1.2
Thành phần
Thể tích (µl) Điều kiện
Đoạn 5’-NK1
(hoặc đoạn 3’NK1)
8.0
Đệm 2x
10.0
pJET 1.2 (50 ng/µl) 1.0
T4 ligase (5 u/ µl)
1.0
Tổng
20.0
Hỗn hợp nối ủ ở 160Cqua đêm
Sau đó, từng hỗn hợp nối được biến nạp vào dòng tế bào khả biến E.coli DH5α. Với mỗi đĩa môi
trường thạch chứa kháng sinh để sàng lọc các khuẩn lạc nhận plasmid tái tổ hợp, chúng tôi chọn
8 khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chèn bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Để kiểm tra đoạn chèn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng
PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR được trình bày trong
Bảng 13.
Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 5’-NK1
của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Thể tích (µl) Điều kiện
Thành phần
10.0
H2O
- Thời gian biến tính đầu tiên:
Đệm 10x
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R1 (2 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1 u/µl)
0.5
Khuôn
1.0
+Tổng hợp: 720C, 150 giây
Tổng
15.0
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 40 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây
+Gắn mồi : 600C, 30 giây
720C, 10 phút
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 10). Kết quả cho thấy 7 trong 8 khuẩn
lạc đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 5’-NK1. Như vậy, chúng tôi đã tách
dòng được đoạn 5’ –NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Chúng tôi kí hiệu bảy
khuẩn lạc này lần lượt từ 5’-NK1-1 đến 5’-NK1-7.
788 bp
Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1. Giếng 1-8
lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có khuôn; M: thang
chuẩn SY-500.
Tương tự như sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chúng tôi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm
tra sự có mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Thành phần
và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 14.
Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1
của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Thể tích (µl) Điều kiện
Thành phần
10.0
H2O
- Thời gian biến tính đầu tiên:
Đệm 10x
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F1 (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1 u/µl)
0.5
DNA khuôn
1.0
+Tổng hợp: 720C, 150 giây
Tổng
15.0
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
94oC, 5 phút
- Lặp lại 40 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây
+Gắn mồi : 600C, 30 giây
720C, 10 phút
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 11). Kết quả cho thấy 5 trong 8 khuẩn lạc (số
2, 4, 6, 7, 8) đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 3’-NK1. Như vậy, chúng
tôi đã tách dòng thành công đoạn 3’–NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Chúng
tôi kí hiệu năm khuẩn lạc này là 3’-NK1-1 đến 3’-NK1-5.
728 bp
Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp mồi
NK1 F1/ NK1 R. Giếng 1-8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng
âm không có khuôn; M: thang chuẩn SY-500.
3.1.5. Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1
Quá trình tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được trình bày trong
Hình 12.
Hình 12. Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1.
Đầu tiên chúng tôi chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tách chiết các plasmid tái tổ hợp
mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1. Plasmid này được kí hiệu p5’-NK1-2 và p3’NK1-6. Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi
NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1.2. Thành phần và điều kiện của
phản ứng được trình bày trong Bảng 15.
Bảng 15: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 trong vector tái tổ hợp
p5’-NK1-2 bằng cặp mồi NK1 R1/ pJET R
Thể tích (µl) Điều kiện
Thành phần
H2O
10.4
- Thời gian biến tính đầu tiên:
Đệm 10x (MgCl2 20 mM)
1.5
94oC, 5 phút
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 R1 (2 µM)
0.5
pJET R (2 µM)
0.5
Pfu polymerase (1 u/µl)
0.1
p5’-NK1-2
1.0
+Tổng hợp: 720C, 120 giây
Tổng
15.0
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
- Lặp lại 40 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây
+Gắn mồi : 600C, 30 giây
720C, 10 phút
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 13). Kết quả cho thấy chúng tôi đã khuếch
đại thành công đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi NK1 R1/pJET R.
Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1 R. Giếng
1: sản phẩm PCR bằng cặp mồi pJET R/NK1 R; ĐC: mẫu đối chứng âm không có DNA khuôn;
M: thang chuẩn SY-100.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) và được cắt bởi hai
enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghép nối với đoạn 3’-NK1. Tiếp theo, chúng tôi cũng
tiến hành cắt vector tái tổ hợp p3’-NK1-6 với hai enzyme XbaI/ SmaI. Thành phần phản ứng cắt
được trình bày trong Bảng 16.
Bảng 16: Thành phần cắt và điều kiện cho phản ứng cắt với hai enzyme XbaI/SmaI
Thành phần
Thể tích (µl)
H2O
42.0
Đệm Tango 10x
6.0
p3’-NK1-2 (hoặc sản phẩm
8.0
PCR đoạn 5’-NK1)
SmaI
2.0
XbaI
2.0
Điều kiện
Ủ 370C trong 2 giờ
Các sản phẩm cắt với hai enzyme được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14A).
Kết quả cho thấy phản ứng cắt được thực hiện hoàn toàn; các băng DNA được cắt có kích thước
theo đúng tính toán. Băng DNA có kích thước 700 bp của đoạn 5’-NK1 và băng DNA có kích
thước 3341 bp gồm plasmid pJET và đoạn 3’-NK1 được tinh sạch bằng kit của QIAquick Gel
Extraction (QIAGEN) rồi điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14B). Kết quả cho
thấy hai băng DNA đã tinh sạch đảm bảo cho phản ứng nối tiếp theo.
99
7
Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau khi tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction
(QIAGEN). A: sản phẩm cắt trước khi tinh sạch; B: sản phẩm cắt sau khi tinh sạch; 1: sản phẩm
PCR chứa đoạn 5’-NK1 sau khi cắt; 2: sản phẩm vector p3’-NK1-6 cắt; M: thang chuẩn-100;
M1: thang chuẩn 1 kb.
Đoạn 5’-NK1 và vector có chứa đoạn 3’-NK1 được nối với nhau theo thành phần trình bày trong
Bảng 17.
Bảng 17:Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 vào vector pJET1.2-3’-NK1
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
Đệm 2x
10.0
5’-NK1
5.0
p3’-NK1-6
4.0
T4 ligase
1.0
Tổng
20.0
Ủ 160C qua đêm
Sau đó, hỗn hợp nối được biến nạp trực tiếp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5α theo phương pháp
trình bày trong mục 2.2.2.6. Kết quả trên môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh có nhiều
khuẩn lạc. Chúng tôi chọn 13 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn cDNA hoàn chỉnh bằng
phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/ NK1 R. Đây là hai mồi bắt cặp với trình tự ở đầu 5’ và đầu
3’ của cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1. Thành phần và điều kiện của phản ứng
PCR được trình bày trong Bảng 18.
Bảng 18: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa đoạn cDNA hoàn
chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Thể tích (µl) Điều kiện
Thành phần
10.0
H2O
- Thời gian biến tính đầu tiên:
Đệm 10x (MgCl2 20 mM)
1.5
dNTPs (2 mM)
1.0
NK1 F (2 µM)
0.5
NK1 R (2 µM)
0.5
Taq DNA polymerase (1u/ µl)
0.5
Khuôn
1.0
94oC, 5 phút
- Lặp lại 40 chu kì:
+Biến tính: 940C, 30 giây
+Gắn mồi : 600C, 30 giây
+Tổng hợp: 720C, 150 giây
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
Tổng
15.0
720C, 10 phút
Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hoàn chỉnh.
Giếng1-13 là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có DNA; M:
thang chuẩn 1 kb.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chúng tôi đã thu được 10 trong số 13 khuẩn lạc mang
đoạn chèn có kích thước xấp xỉ 1338 bp như mong đợi. Các khuẩn lạc này được kí hiệu NK1-1
đến NK1-10.
3.1.6. Giải trình tự cDNA hòan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1
Chúng tôi chọn khuẩn lạc NK1-3 để tách plasmid tái tổ hợp. Plasmid này được kí hiệu pNK1-3.
Plasmid pNK1-3 được giải trình tự hai chiều bằng mồi của vector pJET 1.2 F/ R. Kết quả được
trình bày trong Phụ lục.
Kết quả khi so sánh với trình tự nucleotide của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được
tách dòng từ não người Việt Nam, chúng tôi không thấy bất kỳ sự sai khác nào. Cả hai trình tự
này đều có 5 nucleotide khác với trình tự trong ngân hàng dữ liệu (Mã số trên NCBI: M81797.1).
Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho thụ thể
neurokinin-1 của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu là do tính đa
hình của gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người.
Như vậy, từ kết quả giải trình tự cho thấy chúng tôi đã tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh
mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi người Việt Nam.
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1
3.2.1. Thiết kế mồi
Để biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người, chúng tôi sử dụng hai vector biểu
hiện ở tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1. Bước đầu tiên cần chuyển đoạn cDNA đã tách
dòng trong vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu hiện. Khi lựa chọn enzyme cắt giới hạn,
chúng tôi không thấy enzyme nào trong vị trí đa điểm của vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa
mãn điều kiện cắt văng ra đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1. Vì vậy,
chúng tôi đã thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu
hiện. Trình tự cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 được thiết kế dựa vào trình tự cDNA hoàn chỉnh tách
dòng từ phổi người Việt Nam. Trong đó ở đầu 5’ của mồi NK1 F3 được thiết kế mang trình tự
nhận biết cho enzyme cắt giới hạn HindIII và mồi NK1 F3 mang trình tự nhận biết cho enzyme
BamHI như Hình 16.
+ NK1 F3: 5’-
ATTT AAGCTT ACCATGG ATAACGTCCTCC
- 3’
AAGCTT
ACCATGG
+ NK1 R3: 5’-
Hind III
Trình tự Kozak
- 3’
TAA GGATCC CTAGGAGAGCACATTG
GGATCC
Bam HI
G TTAC AC GA GAGGA TC CCTAGG AAT
---5’-CTAGAAGATCGAAATGGATAACGTCCTCC----/-/-/--pNK1--/-/-/---CAATGTGCTCTCCTAGGGATCCTTA-3’------ATTT AAGCTT ACCA TGG ATAA CGTC C TCC
Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK1-3.
Mặt khác, chúng tôi sử dụng mã mở đầu trong trình tự cDNA của NK1 thay vì mã mở đầu được
thiết kế sẵn trên vector biểu hiện nên trong quá trình thiết kế mồi chúng tôi phải chèn thêm trình
tự Kozak (ACCATGG) vào để làm tăng khả năng được phiên mã và dịch mã của gen trong tế
bào nhận.
Với hai mồi được thiết kế mới, chúng tôi khuếch đại cDNA từ pNK1-3. Thành phần và điều kiện
của phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 19.
Bảng 19: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA-NK1 từ pNK1-3 bằng cặp
mồi NK1 F3/ NK1 R3
Thành phần
H 2O
Thể tích (µl) Điều kiện
10.4
Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5
- Thời gian biến tính đầu tiên: 94oC, 5 phút
- Lặp lại 4 chu kì:
dNTPs (2 mM)
1.0
+Biến tính: 940C, 30 giây
NK1 F3 (2 µM)
0.5
+Gắn mồi : 500C, 30 giây
NK1 R3 (2 µM)
0.5
+Tổng hợp: 720C, 150 giây
Pfu polymerase
0.1
- Lặp lại 35 chu kỳ
pNK1-3
1.0
+Biến tính: 940C, 30 giây
+Gắn mồi : 600C, 30 giây
+Tổng hợp: 720C, 150 giây
Tổng
15.0
- Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 10 phút
Trong phản ứng PCR, do trình tự mồi thiết kế có một đoạn nucleotide tương đối dài không bắt
cặp được vào khuôn nên trong 4 chu kỳ đầu tiên, chúng tôi hạ thấp nhiệt độ gắn mồi để có thể
nhân đoạn gen mong muốn. Ở các chu kỳ tiếp theo, chúng tôi tăng nhiệt độ gắn mồi để đảm bảo
tính đặc hiệu của phản ứng. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chúng tôi đã thu được băng
có kích thước xấp xỉ 1237 bp như trình bày trên Hình 17.
Hình 17: Điê ̣n di sản phẩ m PCR với khuôn là vector tái tổ hợp pNK 1-3 và hai mồ i NK 1
F3/NK1 R3. Giếng 1: sản phẩm PCR khuếch đại cDNA NK1; M: thang chuẩn SY-500; ĐC: đố i
chứng âm không có khuôn DNA .
Như vậy cặp mồi mới thiết kế đã cho phép nhân đặc hiệu đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ
thể neurokinin-1. Đồng thời đoạn DNA mới được nhân bản có mang vị trí nhận biết của cặp
enzyme HindIII/ BamHI ở hai đầu 5’ và 3’. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit High Pure
Product purification kit (Roche) và được kí hiệu là eNK1 (expression NK1).
3.2.2. Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin
-1
Chúng tôi tách chiết và tinh sạch hai loại plasmid pCDNA3 và pEGFP-N1. Hai plasmid
này và đoạn eNK1 được cắt lần lượt với enzyme HindIII. Sản phẩm cắt được điện di và tinh sạch
bằng kit High Pure Product purification kit (Roche). Sau đó, sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt
với BamHI. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với từng enzyme được trình bày trong Bảng
20 và Bảng 21.
Bảng 20: Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen NK1 bằng enzyme
HindIII
Thành phần
Thể tích (µl) Điều kiện
H2O
60.0
Đệm R 10x
15.0
eNK1(hoặc plasmid) 70.0
Hind III
5.0
Tổng
150.0
Ủ 370Ctrong 2 giờ
Bảng 21: Thành phần và điều kiện cho phản ứng với enzyme BamHI
Thành phần
Thể tích (µl) Điều kiện
H2O
33.0
Đệm 10x Bam HI
10.0
Sản phẩm đã cắt với HindIII 54.0
Bam HI
3.0
Tổng
100.0
Ủ 370Ctrong 2 giờ
Qua mỗi bước cắt sản phẩm đều được tinh sạch bằng High Pure Product Purification kit
(Roche) và được điện di kiểm tra. Kết quả cuố i cùng đư ợc thể hiện trong Hình 18.
Hình 18: Điê ̣n di sản phẩ m cắ t vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK 1 với hai enzyme Hind III
và Bam HI. Giếng 1, 2, 3 lầ n lượt là vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 không cắ t ; 1’, 2’, 3’:
lầ n lượt là vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 sau khi cắ t ; M1: marker 1 kb; M2: thang chuẩn
SY-500.
Sau khi tinh sạch, eNK1 được đưa vào từng vector pCDNA 3 và pEGFP -N1 với thành
phần được trình bày trong Bảng 22.
Bảng 22: Thành phần và điều kiện của phản ứng nối cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào
vector pCDNA3 và pEGFP-N1
Thành phần
Thể tích(µl)
Thành phần
Thể tích (µl)
Đệm 10x
2.0
Đệm 10x
2.0
eNK1cắt
8.5
eNK1 cắt
10.0
Plasmid pCDNA3 cắt
8.5
Plasmid pEGFP-N1 cắt
7.0
T4 ligase
1.0
T4 ligase
1.0
Tổng
20.0
Tổng
20.0
Điều kiện: Ủ ở 16 0C qua đêm
Hai hỗn hợp nố i được biế n na ̣p riêng bi ệt vào chủng vi khuẩ n E. coli DH5α theo phương
pháp s ốc nhiệt (Mục 2.2.2.6). Khuẩn lạc nhận plasmid pCDNA3 sẽ mọc trên môi trường có
kháng sinh ampicillin (50µg/ml). Khuẩn lạc nhận plasmid pEGFP-N1 sẽ mọc trên môi trường có
kháng sinh Kanamycin (50µg/ml). Trên cả hai loại môi trường, chúng tôi thu được nhiều khuẩn
lạc. Để sàng lọc khuẩn lạc mang cDNA hoàn ch ỉnh mã hóa cho NK1, chúng tôi chọn 14 khuẩn
- Xem thêm -