Tài liệu Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã

Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam Lê Hồng Thu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: PGS. TS. Võ Thị Thương Lan Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tổng quan về G protein; họ tachykinin ở động vật có vú; thụ thể họ tachykinin và thụ thể neurokinin-1; ứng dụng của thụ thể neurokinin-1 trong điều trị bệnh; vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Trình bày nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: Tách RNA tổng số; phản ứng phiên mã ngược; phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction); Tinh sạch DAN bằng phương pháp thôi gel; nối ghép các đoạn DNA vào vector; kỹ thuật biến nạp; sàng lọc khuẩn lạc; tách plasmid kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn; ký thuật điện di; phân tích trình tự cDnA của cDNA-NK1. Đưa ra kết quả và thảo luận: Tách dòng gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ phổi người; thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Người Việt Nam; Thụ thể neurokinin-1; Cấu trúc protein Content MỞ ĐẦU Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein. Khi thụ thể này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về trung ương thần kinh, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt khác chúng cũng có tác dụng gây kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của cơ thể. Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh nhân ung thư, … Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam còn rất ít hoặc chưa được công bố. Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật để có thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam”. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein và Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 1.1 1.1.1. G protein G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cứu tác động của adrenaline đối với tế bào. Với công trình này, hai ông đã giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4]. G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào. 1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine, chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử. Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức năng [52]. 1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong cơ thể của tất cả các loài động vật. Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không xương và có xương sống [15, 45]. Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi Euler và Gaddum khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn. Dịch chiết này có tác dụng kích thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm huyết áp ở thỏ [21]. Tuy nhiên, rất nhiều thí nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công. Bốn mươi năm sau đó (năm 1970), Chang và Leeman mới tinh sạch được SP từ vùng dưới đồi của bò [14] và đến năm 1973, Studer và cộng sự đã phân lập, tinh sạch SP, đồng thời giải trình tự gene mã hóa cho SP từ ruột ngựa [50]. Năm 1983, Kangawa và Kimura đã phân lập được thêm hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP là neurokinin A (NKA) và neurokinin B (NKB) từ vùng thần kinh trung ương và ngoại vi [31, 33]. Hiện nay, tachykinin trong mô động vật có vú đã được xác định gồm có chất P (hay SP), neurokinin A (hay neuromedin L hoặc chất K) và neurokinin B (hay neuromedin K). Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng là neuropeptide K và neuropeptide γ 1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin Thụ thể của họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với G protein (Hình 1). Tương tự như thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 vùng xuyên màng đặc trưng được nối với nhau bởi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh chất (exoloop và cytoloop). Những vòng ở phía ngoài màng tế bào của thụ thể liên kết với G protein có chức năng lựa chọn cấu tử gắn đặc hiệu trong khi các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoạt tính của thụ thể. Người ta phân loại TACR dựa vào sự sai khác trong các trình tự này [45]. 1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH Từ những hiểu biết về chức năng của thụ thể neurokinin 1 hứa hẹn đây sẽ là đích tác động hiệu quả cho các phương pháp điều trị một số căn bệnh có liên quan. Do đó cũng không có gì ngạc nhiên khi nhiều hãng dược phẩm lớn tập trung nghiên cứu về thụ thể tachykinin nhằm tìm ra các chất đối vận của chúng để ứng dụng trong điều trị bệnh: làm thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm cảm, chữa các bệnh đường hô hấp,… Sự phát hiện ra các chất đối vận với thụ thể NK1 cũng là một mắt xích quan trọng trong việc thay đổi hướng điều trị trong việc ngăn ngừa chứng buồn nôn và sự nôn mửa do tác dụng của hóa trị liệu ung thư. Tuy đến nay các nghiên cứu về chất đối vận với thụ thể tachykinin vẫn chưa đạt được kết quả như mong đợi và gặp rất nhiều khó khăn, nhưng việc sử dụng thụ thể NK1 làm đích tác động của thuốc vẫn là một bài tóan hay và khó cho nhiều nhà nghiên cứu. Trong đó các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào những phân tử không có bản chất peptide có khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thần kinh. Trong tương lai, chất này hứa hẹn sẽ cho phép điều trị bệnh liên quan tới chứng nghiện rượu [13], … 1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein được dung hợp vào nhiều hệ vector và nhiều dòng tế bào khác nhau. Người ta đã thử biểu hiện chúng trên cả tế bào nhân sơ và cả trên tế bào nhân thực. Tuy nhiên, do thụ thể liên kết với G protein thường được biến đổi sau dịch mã bằng cách gắn thêm carbonhydrate hoặc lipid hóa… nên việc biểu hiện trên hệ thống tế bào nhân sơ thường không cho kết quả như mong muốn. Theo các nghiên cứu đã công bố, NK1 được biểu hiện trong vector pCDNA [24], pMAM-neo [24; 28], pVLl393 [32], pAHygCMV1 [49]… ở các chủng tế bào HEK293, COS-7, CHO, … đều cho kết quả khả quan. Một nghiên cứu gần đây năm 2006 của Farahdiba và cộng sự khi nghiên cứu truyền tin của thụ thể β-arrestin 1 đã tiến hành dung hợp gen mã hóa cho thụ thể này với gen mã hóa cho NK1 và biểu hiện chúng trong hai hệ vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1 cũng cho kết quả tốt. Đây là tiền đề cho chúng tôi lựa chọn và thiết kế vector biểu hiện pCDNA3 và pEGFP-N1 trong đề tài. pCDNA3 và pEGFP-N1 là vector biểu hiện ở tế bào động vật với các đặc điểm được trình bày trong phụ lục. Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU Mẫu phổi tươi của người bị ung thư phổi được cung cấp bởi Viện Quân Y 103 (kí hiệu H211 lấy ngày 25/1/2011). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu Mẫu phổi tươi Tách RNA tổng số Tổng hợp cDNA Khuếch đại đoạn 5’-NK1 Khuếch đại đoạn 3’-NK1 Tách dòng đoạn 5’-NK1 Tách dòng đoạn 3’-NK1 Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam. Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI 3.1.1. Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người RNA tổng số từ mẫu phổi tươi được tách chiết bằng kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit (Bioneer). Sau đó, cDNA được tổng hợp nhờ phản ứng phiên mã ngược sử dụng RNA tổng số và mồi hexamer. Thành phần và điều kiện của phản ứng tổng hợp cDNA được trình bày trong Bảng 9. Bảng 9: Thành phần và điều kiện phản ứng tổng hợp cDNA của gen neurokinin-1 Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần RNA tổng số 13.0 Mồi hexamer (100 µM) 1.5 dNTPs (10 mM) 2.5 Đệm 5x 5.0 Ủ 700 trong 5’ để biến tính - Gắn mồi: 250 trong 10 phút AMV RTase 3.0 Tổng 25.0 - Kéo dài: 370 trong 90 phút - Bất hoạt enzyme: 850 trong 5 phút Sản phẩm cDNA được bảo quản ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.2. Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Đoạn cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 sẽ được tách dòng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và đoạn 3’-NK1. Hai đoạn này sau đó sẽ được nối với nhau để tạo nên cDNA hoàn chỉnh như sơ đồ Hình 6. NK1 F NK1 R1 76 bp 94 bp NK1 F1 NK1 R Đoạn 5’–NK1 (788 bp) CCCGG 94 bp G 76 bp Đoạn 3’- NK1 (728 bp) CCCGG G Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mã hóa cho neurokinin-1 Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA được tổng hợp từ phản ứng phiên mã ngược để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 10. Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện 10.4 H2O Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 µM) 0.5 NK1 R1 (2 µM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0 - Thời gian biến tính đầu tiên: 94oC, 5 phút - Lặp lại 45 chu kì: +Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây - Thời gian tổng hợp sau cùng: 720C, 10 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose. Kết quả điện di cho một băng DNA có kích thước xấp xỉ 800 bp (Hình 7). Đây là kích thước đúng với tính toán cho đoạn 5’-NK1. Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Giếng ĐC: đối chứng âm không có cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để chuẩn bị cho phản ứng tách dòng đoạn 5’-NK1 của cDNA. 3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng cDNA làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Tuy nhiên, sản phẩm PCR gồm các băng DNA không đặc hiệu và không có băng DNA với kích thước 728 bp như mong đợi (Hình 8). Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500. Lặp lại phản ứng nhiều lần và thay đổi các điều kiện về nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,… chúng tôi vẫn không thu được băng mong muốn. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện phản ứng phiên mã ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số. Thành phần và điều kiện của phản ứng phiên mã ngược được thực hiện như trong Bảng 11, chỉ thay đổi mồi hexamer bằng mồi oligoT. Sau đó, cDNA này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 11. Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 10.4 Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 - Thời gian biến tính đầu tiên: 94oC, 5 phút dNTPs (2 mM) 1.0 - Lặp lại 45 chu kì: NK1 F1 (2 µM) 0.5 +Biến tính: 940C, 30 giây NK1 R (2 µM) 0.5 +Gắn mồi : 600C, 30 giây Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0 +Tổng hợp: 720C, 150 giây - Thời gian tổng hợp sau cùng: 720C, 10 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 9). Kết quả cho thấy bên cạnh băng DNA không đặc hiệu thì đã xuất hiện băng DNA có kích thước lớn hơn 700 bp phù hợp với kích thước đoạn 3’–NK1. Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sạch đoạn 3’-NK1. Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại đoạn 3’-NK1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn SY100. 3.1.4. Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Sau khi đã tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng phản ứng nối sử dụng kit Gene JET TM PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phần của phản ứng nối được trình bày trong Bảng 12. Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pJET1.2 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện Đoạn 5’-NK1 (hoặc đoạn 3’NK1) 8.0 Đệm 2x 10.0 pJET 1.2 (50 ng/µl) 1.0 T4 ligase (5 u/ µl) 1.0 Tổng 20.0 Hỗn hợp nối ủ ở 160Cqua đêm Sau đó, từng hỗn hợp nối được biến nạp vào dòng tế bào khả biến E.coli DH5α. Với mỗi đĩa môi trường thạch chứa kháng sinh để sàng lọc các khuẩn lạc nhận plasmid tái tổ hợp, chúng tôi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chèn bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Để kiểm tra đoạn chèn 5’-NK1, chúng tôi sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 13. Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 5’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần 10.0 H2O - Thời gian biến tính đầu tiên: Đệm 10x 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 µM) 0.5 NK1 R1 (2 µM) 0.5 Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5 Khuôn 1.0 +Tổng hợp: 720C, 150 giây Tổng 15.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: 94oC, 5 phút - Lặp lại 40 chu kì: +Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây 720C, 10 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 10). Kết quả cho thấy 7 trong 8 khuẩn lạc đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 5’-NK1. Như vậy, chúng tôi đã tách dòng được đoạn 5’ –NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Chúng tôi kí hiệu bảy khuẩn lạc này lần lượt từ 5’-NK1-1 đến 5’-NK1-7. 788 bp Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1. Giếng 1-8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có khuôn; M: thang chuẩn SY-500. Tương tự như sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chúng tôi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 14. Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần 10.0 H2O - Thời gian biến tính đầu tiên: Đệm 10x 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F1 (2 µM) 0.5 NK1 R (2 µM) 0.5 Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5 DNA khuôn 1.0 +Tổng hợp: 720C, 150 giây Tổng 15.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: 94oC, 5 phút - Lặp lại 40 chu kì: +Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây 720C, 10 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 11). Kết quả cho thấy 5 trong 8 khuẩn lạc (số 2, 4, 6, 7, 8) đều cho một băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 3’-NK1. Như vậy, chúng tôi đã tách dòng thành công đoạn 3’–NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Chúng tôi kí hiệu năm khuẩn lạc này là 3’-NK1-1 đến 3’-NK1-5. 728 bp Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Giếng 1-8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có khuôn; M: thang chuẩn SY-500. 3.1.5. Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 Quá trình tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được trình bày trong Hình 12. Hình 12. Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1. Đầu tiên chúng tôi chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tách chiết các plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1. Plasmid này được kí hiệu p5’-NK1-2 và p3’NK1-6. Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1.2. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 15. Bảng 15: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 trong vector tái tổ hợp p5’-NK1-2 bằng cặp mồi NK1 R1/ pJET R Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần H2O 10.4 - Thời gian biến tính đầu tiên: Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 94oC, 5 phút dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 R1 (2 µM) 0.5 pJET R (2 µM) 0.5 Pfu polymerase (1 u/µl) 0.1 p5’-NK1-2 1.0 +Tổng hợp: 720C, 120 giây Tổng 15.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: - Lặp lại 40 chu kì: +Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây 720C, 10 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose (Hình 13). Kết quả cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi NK1 R1/pJET R. Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1 R. Giếng 1: sản phẩm PCR bằng cặp mồi pJET R/NK1 R; ĐC: mẫu đối chứng âm không có DNA khuôn; M: thang chuẩn SY-100. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) và được cắt bởi hai enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghép nối với đoạn 3’-NK1. Tiếp theo, chúng tôi cũng tiến hành cắt vector tái tổ hợp p3’-NK1-6 với hai enzyme XbaI/ SmaI. Thành phần phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 16. Bảng 16: Thành phần cắt và điều kiện cho phản ứng cắt với hai enzyme XbaI/SmaI Thành phần Thể tích (µl) H2O 42.0 Đệm Tango 10x 6.0 p3’-NK1-2 (hoặc sản phẩm 8.0 PCR đoạn 5’-NK1) SmaI 2.0 XbaI 2.0 Điều kiện Ủ 370C trong 2 giờ Các sản phẩm cắt với hai enzyme được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14A). Kết quả cho thấy phản ứng cắt được thực hiện hoàn toàn; các băng DNA được cắt có kích thước theo đúng tính toán. Băng DNA có kích thước 700 bp của đoạn 5’-NK1 và băng DNA có kích thước 3341 bp gồm plasmid pJET và đoạn 3’-NK1 được tinh sạch bằng kit của QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) rồi điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% (Hình 14B). Kết quả cho thấy hai băng DNA đã tinh sạch đảm bảo cho phản ứng nối tiếp theo. 99 7 Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau khi tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN). A: sản phẩm cắt trước khi tinh sạch; B: sản phẩm cắt sau khi tinh sạch; 1: sản phẩm PCR chứa đoạn 5’-NK1 sau khi cắt; 2: sản phẩm vector p3’-NK1-6 cắt; M: thang chuẩn-100; M1: thang chuẩn 1 kb. Đoạn 5’-NK1 và vector có chứa đoạn 3’-NK1 được nối với nhau theo thành phần trình bày trong Bảng 17. Bảng 17:Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 vào vector pJET1.2-3’-NK1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện Đệm 2x 10.0 5’-NK1 5.0 p3’-NK1-6 4.0 T4 ligase 1.0 Tổng 20.0 Ủ 160C qua đêm Sau đó, hỗn hợp nối được biến nạp trực tiếp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5α theo phương pháp trình bày trong mục 2.2.2.6. Kết quả trên môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh có nhiều khuẩn lạc. Chúng tôi chọn 13 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn cDNA hoàn chỉnh bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/ NK1 R. Đây là hai mồi bắt cặp với trình tự ở đầu 5’ và đầu 3’ của cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 18. Bảng 18: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần 10.0 H2O - Thời gian biến tính đầu tiên: Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 µM) 0.5 NK1 R (2 µM) 0.5 Taq DNA polymerase (1u/ µl) 0.5 Khuôn 1.0 94oC, 5 phút - Lặp lại 40 chu kì: +Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây - Thời gian tổng hợp sau cùng: Tổng 15.0 720C, 10 phút Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hoàn chỉnh. Giếng1-13 là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có DNA; M: thang chuẩn 1 kb. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chúng tôi đã thu được 10 trong số 13 khuẩn lạc mang đoạn chèn có kích thước xấp xỉ 1338 bp như mong đợi. Các khuẩn lạc này được kí hiệu NK1-1 đến NK1-10. 3.1.6. Giải trình tự cDNA hòan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Chúng tôi chọn khuẩn lạc NK1-3 để tách plasmid tái tổ hợp. Plasmid này được kí hiệu pNK1-3. Plasmid pNK1-3 được giải trình tự hai chiều bằng mồi của vector pJET 1.2 F/ R. Kết quả được trình bày trong Phụ lục. Kết quả khi so sánh với trình tự nucleotide của cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 được tách dòng từ não người Việt Nam, chúng tôi không thấy bất kỳ sự sai khác nào. Cả hai trình tự này đều có 5 nucleotide khác với trình tự trong ngân hàng dữ liệu (Mã số trên NCBI: M81797.1). Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu là do tính đa hình của gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người. Như vậy, từ kết quả giải trình tự cho thấy chúng tôi đã tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi người Việt Nam. 3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 3.2.1. Thiết kế mồi Để biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người, chúng tôi sử dụng hai vector biểu hiện ở tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1. Bước đầu tiên cần chuyển đoạn cDNA đã tách dòng trong vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu hiện. Khi lựa chọn enzyme cắt giới hạn, chúng tôi không thấy enzyme nào trong vị trí đa điểm của vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa mãn điều kiện cắt văng ra đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1. Vì vậy, chúng tôi đã thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu hiện. Trình tự cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 được thiết kế dựa vào trình tự cDNA hoàn chỉnh tách dòng từ phổi người Việt Nam. Trong đó ở đầu 5’ của mồi NK1 F3 được thiết kế mang trình tự nhận biết cho enzyme cắt giới hạn HindIII và mồi NK1 F3 mang trình tự nhận biết cho enzyme BamHI như Hình 16. + NK1 F3: 5’- ATTT AAGCTT ACCATGG ATAACGTCCTCC - 3’ AAGCTT ACCATGG + NK1 R3: 5’- Hind III Trình tự Kozak - 3’ TAA GGATCC CTAGGAGAGCACATTG GGATCC Bam HI G TTAC AC GA GAGGA TC CCTAGG AAT ---5’-CTAGAAGATCGAAATGGATAACGTCCTCC----/-/-/--pNK1--/-/-/---CAATGTGCTCTCCTAGGGATCCTTA-3’------ATTT AAGCTT ACCA TGG ATAA CGTC C TCC Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK1-3. Mặt khác, chúng tôi sử dụng mã mở đầu trong trình tự cDNA của NK1 thay vì mã mở đầu được thiết kế sẵn trên vector biểu hiện nên trong quá trình thiết kế mồi chúng tôi phải chèn thêm trình tự Kozak (ACCATGG) vào để làm tăng khả năng được phiên mã và dịch mã của gen trong tế bào nhận. Với hai mồi được thiết kế mới, chúng tôi khuếch đại cDNA từ pNK1-3. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 19. Bảng 19: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA-NK1 từ pNK1-3 bằng cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 Thành phần H 2O Thể tích (µl) Điều kiện 10.4 Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 - Thời gian biến tính đầu tiên: 94oC, 5 phút - Lặp lại 4 chu kì: dNTPs (2 mM) 1.0 +Biến tính: 940C, 30 giây NK1 F3 (2 µM) 0.5 +Gắn mồi : 500C, 30 giây NK1 R3 (2 µM) 0.5 +Tổng hợp: 720C, 150 giây Pfu polymerase 0.1 - Lặp lại 35 chu kỳ pNK1-3 1.0 +Biến tính: 940C, 30 giây +Gắn mồi : 600C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây Tổng 15.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: 720C, 10 phút Trong phản ứng PCR, do trình tự mồi thiết kế có một đoạn nucleotide tương đối dài không bắt cặp được vào khuôn nên trong 4 chu kỳ đầu tiên, chúng tôi hạ thấp nhiệt độ gắn mồi để có thể nhân đoạn gen mong muốn. Ở các chu kỳ tiếp theo, chúng tôi tăng nhiệt độ gắn mồi để đảm bảo tính đặc hiệu của phản ứng. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chúng tôi đã thu được băng có kích thước xấp xỉ 1237 bp như trình bày trên Hình 17. Hình 17: Điê ̣n di sản phẩ m PCR với khuôn là vector tái tổ hợp pNK 1-3 và hai mồ i NK 1 F3/NK1 R3. Giếng 1: sản phẩm PCR khuếch đại cDNA NK1; M: thang chuẩn SY-500; ĐC: đố i chứng âm không có khuôn DNA . Như vậy cặp mồi mới thiết kế đã cho phép nhân đặc hiệu đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Đồng thời đoạn DNA mới được nhân bản có mang vị trí nhận biết của cặp enzyme HindIII/ BamHI ở hai đầu 5’ và 3’. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit High Pure Product purification kit (Roche) và được kí hiệu là eNK1 (expression NK1). 3.2.2. Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin -1 Chúng tôi tách chiết và tinh sạch hai loại plasmid pCDNA3 và pEGFP-N1. Hai plasmid này và đoạn eNK1 được cắt lần lượt với enzyme HindIII. Sản phẩm cắt được điện di và tinh sạch bằng kit High Pure Product purification kit (Roche). Sau đó, sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt với BamHI. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với từng enzyme được trình bày trong Bảng 20 và Bảng 21. Bảng 20: Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen NK1 bằng enzyme HindIII Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 60.0 Đệm R 10x 15.0 eNK1(hoặc plasmid) 70.0 Hind III 5.0 Tổng 150.0 Ủ 370Ctrong 2 giờ Bảng 21: Thành phần và điều kiện cho phản ứng với enzyme BamHI Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 33.0 Đệm 10x Bam HI 10.0 Sản phẩm đã cắt với HindIII 54.0 Bam HI 3.0 Tổng 100.0 Ủ 370Ctrong 2 giờ Qua mỗi bước cắt sản phẩm đều được tinh sạch bằng High Pure Product Purification kit (Roche) và được điện di kiểm tra. Kết quả cuố i cùng đư ợc thể hiện trong Hình 18. Hình 18: Điê ̣n di sản phẩ m cắ t vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK 1 với hai enzyme Hind III và Bam HI. Giếng 1, 2, 3 lầ n lượt là vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 không cắ t ; 1’, 2’, 3’: lầ n lượt là vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 sau khi cắ t ; M1: marker 1 kb; M2: thang chuẩn SY-500. Sau khi tinh sạch, eNK1 được đưa vào từng vector pCDNA 3 và pEGFP -N1 với thành phần được trình bày trong Bảng 22. Bảng 22: Thành phần và điều kiện của phản ứng nối cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pCDNA3 và pEGFP-N1 Thành phần Thể tích(µl) Thành phần Thể tích (µl) Đệm 10x 2.0 Đệm 10x 2.0 eNK1cắt 8.5 eNK1 cắt 10.0 Plasmid pCDNA3 cắt 8.5 Plasmid pEGFP-N1 cắt 7.0 T4 ligase 1.0 T4 ligase 1.0 Tổng 20.0 Tổng 20.0 Điều kiện: Ủ ở 16 0C qua đêm Hai hỗn hợp nố i được biế n na ̣p riêng bi ệt vào chủng vi khuẩ n E. coli DH5α theo phương pháp s ốc nhiệt (Mục 2.2.2.6). Khuẩn lạc nhận plasmid pCDNA3 sẽ mọc trên môi trường có kháng sinh ampicillin (50µg/ml). Khuẩn lạc nhận plasmid pEGFP-N1 sẽ mọc trên môi trường có kháng sinh Kanamycin (50µg/ml). Trên cả hai loại môi trường, chúng tôi thu được nhiều khuẩn lạc. Để sàng lọc khuẩn lạc mang cDNA hoàn ch ỉnh mã hóa cho NK1, chúng tôi chọn 14 khuẩn