Tài liệu Skkn ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp môn sinh học thpt

SÁNG KIẾN KINH NGHIỆM ĐỀ TÀI: "ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT TRONG NÔNG NGHIỆP MÔN SINH HỌC THPT " PHẦN A: ĐẶT VẤN ĐỀ I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thế kỉ XXI là thế kỉ của công nghệ sinh học, nó đang trở thành ngành khoa học mũi nhọn và then chốt của nhiều nước. Sự phát triển của công nghệ sinh học là một trong những tiêu chí hàng đầu để đánh giá trình độ phát triển của một nước nào đó. Chính vì vậy, các nước đã tập trung rất ngân sách của và nhân lực cho sự phát triển của ngành công nghệ sinh học (biotechnology). Với tầm quan trọng như vậy nên ở tất cả các Trường Đại học: Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Thủy Sản, Y học và Sự phạm đều có bộ môn hay khoa công nghệ sinh học. Trong chương trình môn Sinh học và Công nghệ Trung học phổ thông có khoảng từ 5 -10 bài học có liên quan đến công nghệ sinh học. Trong các đề thi tuyển sinh đại học có khoảng 2 - 5 câu hỏi trắc nghiệm có liên quan đến công nghệ sinh học. Điều này đòi hỏi các đồng chí giáo viên và các em học sinh phải có những hiểu biết sâu sắc và toàn diện về công nghệ sinh học. Tuy nhiên, do đây là nội dung mới nên các đồng chí giáo viên và các em học còn nhiều bỡ ngỡ. Xuất phát từ những lí do trên, nên khi tiến hành nghiên cứu viết sáng kiến kinh nghiệm, tôi đã mạnh dạn chọn đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” II. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1- Mục đích : Xây dựng và hoàn thiện chuyên đề “ Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” và trở thành nguồn tư liệu quý cho giáo viên và học sinh. 2- Yêu cầu : Trình bày được ứng dụng của công nghệ sinh học thực vật trong các lĩnh vực sau: - Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn - Chọn dòng tế bào thực vật - Lai tế bào thực vật - Chuyển gen thực vật - Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam III. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Sự hoàn thiện đề tài này sẽ trở thành nguồn tư liệu phong phú giúp cho mỗi giáo viên và học sinh có cái nhìn toàn diện và sâu sắc về tầm quan trọng của ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp. Từ nhận thức đến hành động, biến mỗi giáo viên và học sinh trở thành những kĩ thuật viên, tuyên truyền viên tích cực, cổ vũ cho sự phát triển của ngành công nghệ sinh học nước nhà. Ngoài ra, đề tài này còn giúp giáo viên và học sinh dạy - học tốt môn Sinh học nói chung và chuyên đề ứng dụng công nghệ sinh học nói riêng. Qua đó nâng cao tỉ lệ thi đỗ vào chuyên ngành khối B của các trường Đại học, Cao đẳng và Trung cấp chuyên nghiệp. IV. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Thực vật. Phạm vi nghiên cứu: Công nghệ sinh học là môn khoa học đa ngành và đa lĩnh vực. Tuy nhiên, với đề tài này tôi chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng của 5 lĩnh vực: nuôi cấy mô, tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn, chọn dòng tế bào, lai tế bào và kĩ thuật chuyển gen ở thực vật. Vì đây là những kiến thức có liên quan trực tiếp đến vần đề dạy học và ôn thi đại học và cao đẳng của học sinh Trung học phổ thông. V. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp nghiên cứu các tài liệu được lấy từ các nguồn thông tin như giáo trình đại học và cao học, các chuyên đề chuyên sâu dành cho bồi dưỡng giáo viên các trường chuyên, internet, .... Rồi tiến hành tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài. Phương pháp trao đổi kinh nghiệm, học hỏi các đồng nghiệp và các chuyên gia. Phương pháp tham gia các hội thảo về chuyên đề “ Công nghệ sinh học” Phương pháp tham quan các cơ sở Công nghệ sinh học : Viện rau quả trung ương, Viện công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học, ... Đặc biệt là trực tiếp làm thí nghiệm: trong thời gian học cao học, tôi đã trực tiếp tham gia đề tài cấp nhà nước “Chuyển gen sinh auxin và gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thụ bầu nhụy vào cây cam Vinh và quýt Đường canh“. Phương pháp đánh giá qua thực tiễn sư phạm. PHẦN B. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I. VI NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô hay còn gọi là vi nhân giống in vitro. Quá trình nhân giống này phải trải qua nhiều công đoạn: Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không những quyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình của D.Amato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về di truyền. Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt để nhân. Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi trường thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng (xitokinin và auxin). Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp có xitokinin. Sự phát triển nhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ. Chồi được nhân lên sau 3 đến 4 tuần. Các chồi hình thành lại được tách ra chuyển sang môi trường mới và qui trình cứ thế được lặp lại. Để tạo rễ thì chồi nhân phải chuyển sang môi trường có auxin. Đây là phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc phôi, nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền. Hiện nay nhờ phát triển những môi trường và hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân đã được tăng lên nhiều (5 8 – 515 chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong môi trường lỏng có lắc hoặc nhân trong các reactor. Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phương pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhưng thường kéo theo sự biến dị sôma nên trước khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ những thay đổi về di truyền. Vi nhân giống có những ưu việt sau: - Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất. - Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m 2 nền có thể để được tới 18.000 cây. - Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các cây giống sạch bệnh. - Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4 oC trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống đến 95%. Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây, ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng được yêu cầu thực tiễn. Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phương pháp vi nhân còn cao (300 - 8000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật quí hiếm và có giá trị kinh tế cao. Trên thực tế cây nhân bằng phương pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây giống từ hạt. Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây như lan, hoa cúc, hoa hồng, cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông.... Vi nhân giống ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây, còn có thể rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai. II. TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY HẠT PHẤN Có nhiều phương pháp tạo cây đơn bội, nhưng từ những năm 60, việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) hoặc môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong quá trình nuôi cấy, hạt phấn phân chia, tạo mô sẹo hoặc phôi và tiếp theo có thể tạo cây. 2.1. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo 2.1.1. Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng rất lớn đến hạt phấn nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng như nhiệt độ là những yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của Dunwell (1976) cho thấy tỉ lệ phôi cao nhận được khi sử dụng những nụ hoa hình thành sớm và cây phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ hạt phấn cao hơn. Ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở một số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu gen cũng rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấn của các cây khoai tây nhị bội tạo từ cây đơn bội sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ. Ngoài ra, xử lí bao phấn ở nhiệt độ thấp (3 - 10 oC) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ hạt phấn (Wenzel & cs, 1977). 2.1.2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro Thành phần cacbonhydrat trong môi trường hết sức quan trọng, đặc biệt là đường sucrose khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% - 4%. Đối với khoai tây và lúa cần đến 6%, thậm chí 12%. Trong các chất hữu cơ, các axit như glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi ở một số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc lá. Các dịch chiết tự nhiên như dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất khác như vitamin C, nước dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo và tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn. Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo nhưng lại ức chế tạo phôi. Vì thế trong trường hợp tạo phôi cần tránh sử dụng auxin. Nói chung auxin thường có tác dụng ở giai đoạn nuôi cấy ban đầu. Xytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy. Trong một số ít trường hợp etylen kích thích tạo mô sẹo. Wilson & cs (1978) cho biết nuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch. Bổ sung vào môi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm tăng hiệu quả nuôi cấy bao phấn. Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy. Đối với thuốc lá mật độ tối ưu là 105 hạt/ml môi trường. Đối với các cây khác mật độ dao động từ 104 - 105. Ánh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần 300-500 lux. Nhiệt độ bình thường từ 25-28 oC là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn và hạt phấn của hầu hết các giống cây. 2.2. Tái sinh cây Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ, thậm chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một số loài cây khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trường nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Một số trường hợp phải dùng zeatin và nước dừa mới có thể tái sinh cây. Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang môi trường có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thường hay dùng là BAP và kinetin. Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừa thường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc. Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc thường có hiện tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977) thấy rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao. Ngoài ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng LiPing, 1978). Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số loài cây có cả cây nhị bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhị bội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sự phân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy. 2.3. Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trước hết là làm nguyên liệu để tạo các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lưỡng bội hóa các cây đơn bội bằng xử lí consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Như đã nói trên, ở một số loại cây có thể nhận được cây nhị bội ngay trong quá trình nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn, nhưng trong trường hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ lưỡng. Các dòng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng. Chúng được sử dụng tạo các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) và rút ngắn thời gian tạo hạt lai. Các dòng đơn bội kép đã tạo được ứng dụng trong sản xuất lúa mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa... Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc lá cho năng suất cao và chất lượng tuyệt hảo đã được tạo ra bằng phương pháp cấy bao phấn (Hu han & cs, 1978). Nhiều giống lúa mới như Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976), những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã được tạo bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn. Ngoài ra các dòng đơn bội kép còn được sử dụng để phát triển quần thể cho việc lập bản đồ phân tử. Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các cặp NST, ngoài ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác định kiểu di truyền các tính trạng lặn. Các cây đơn bội còn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội lệch. Cây đơn bội cũng được dùng trong lai khác loài để rút ngắn thời gian ổn định về NST. Nuôi cấy bao phấn có thể ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến. Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn Bao phấn hoặc Giống mới hạt phấn Nuôi cấy bao phấn Cây đơn bội Lưỡng bội hóa Cây lưỡng bội Dòng thuần Dòng siêu chủng III. CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV) 3.1.Cơ sở khoa học. Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính toàn năng. Mỗi loài thực vật có khả năng tái sinh khác nhau. Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trưởng. Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển, những quần thể tế bào này là đối tượng hết sức lí tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa. Cũng như cây trồng, trong nuôi cấy mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một loại là kết quả của sự thay đổi gen, được gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại không liên quan đến thay đổi gen, được gọi là biến đổi ngoài gen. Những thay đổi ngoài gen không di truyền được. Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tượng phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào. Hiện tượng này gọi là hiện tượng phân dòng sôma. Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ tế bào nuôi cấy là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh từ protoplast là “protoclones” (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981) đưa ra một định nghĩa có tính chất khái quát hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cả những thay đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào. 3.2. Vật liệu và phương pháp chọn dòng Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng. Các vật liệu có thể là tế bào cho đến các mô phân hóa. Mỗi loại vật liệu có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Việc chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các phương pháp nuôi cấy đối với từng loại cây. Vật liệu thường dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus). Mô sẹo được dùng để chọn các dòng chống chịu như chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối (McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Nozue và cs, 1987; Hiraoka, 1986). Đối với mô sẹo có thể sử dụng các phương pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trên môi trường chọn lọc chứa một nồng độ nhất định của chất chọn lọc, các mô và tế bào đột biến có tính chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phương pháp chọn lọc từng bước tức là khi mô hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ nhất định của tác nhân chọn lọc thì lại chuyển sang nồng độ cao hơn. Ngoài ra cũng có thể sử dụng kết hợp cả hai phương pháp. Sự ổn định của mô chọn lọc là khả năng phát triển bình thường liên tục trên môi trường chọn lọc hoặc khi chuyển môi trường chọn lọc và sau một thời gian dài cấy trên môi trường không chọn lọc vẫn mất đi đặc điểm đã được chọn lọc. Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có ưu điểm là đơn giản nhưng nguyên liệu này có một số nhược điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mô chọn lọc còn có nhiều tế bào bình thường nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những cây mang đặc điểm chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trong một cây có thể có phần chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bình thường. Để khắc phục nhược điểm này có thể giảm kích thước của mô: mô càng nhỏ càng tốt. Trọng lượng mô thường dùng là 100-150 mg, nhưng có thể giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha & Widholin, 1987). Tế bào nuôi cấy dịch lỏng đã được nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV (Kishinami & Widholin, 1986; Watad và cs, 1985). Đối với loại tế bào này các phương pháp chọn lọc trực tiếp và chọn từng bước cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối tượng. Sử dụng tế bào dịch lỏng để CDTBTV có ưu điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế bào được tiếp xúc đồng đều với tác nhân chọn lọc, nhưng một nhược điểm quan trọng là sau khi chọn lọc khả năng tái sinh cây bị giảm đáng kể và trong nhiều trường hợp có thể mất hẳn. Hầu hết các dòng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dịch lỏng đều không nhận đuợc cây (Dix, 1990). Vì thế hệ thống tế bào dịch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòng có khả năng tổng hợp và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trường hợp này thì tế bào dịch lỏng đáp ứng được mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp. Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặt trong CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào được phát triển đồng đều trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh được hiện tượng khảm. Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs, 1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã được chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast. Trước đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất là tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bị hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy protoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng như khoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã được công bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu lý tưởng cho CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tượng quan trọng trong cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế bào và chuyển gen. Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng và protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên liệu CDTBTV. Một trong những mô phân hóa được sử dụng là phôi từ hạt (Kueh & Bright, 1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs (1985) đã chọn được dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs (1989) cũng nhận được dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá. Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo, tế bào dịch lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để làm tăng dần số đột biến và các kiểu đột biến. Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi tách bằng tia cực tím (UV) hoặc N -methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG). Phương pháp tương tự cũng được một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng. N -ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981). Ngoài ra có thể xử lí mẫu vật bằng các chất gây đột biến trước khi đưa vào nuôi cấy và chọn lọc. 3.3. Chọn dòng chịu bệnh Mặc dù phương pháp truyền thống có thể tạo được các dòng hoặc giống chịu bệnh nhưng trong một vài trường hợp không thể chọn được các dòng chịu bệnh bằng những phương pháp này hoặc chọn được nhưng tốn nhiều công sức và thời gian. Việc gây nhiễm bệnh nhân tạo cho một số lượng lớn cây để tạo chọn giống chịu bệnh là cả một vấn đề, ngoài ra gây nhiễm trong nhà kính nhiều khi cũng không thành công. Không những thế bằng phương pháp truyền thống việc chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng cùng một loại bệnh gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai là lai ngược mất rất nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển được các gen lặn hoặc nhiều gen một lúc. Đặc biệt đối với các loài cây chỉ nhân vô tính thì chuyển gen không thể thực hiện được bằng lai tạo. Đột biến thực nghiệm có thể tạo được giống cây chịu bệnh nhưng tần số xuất hiện các đột biến đơn gen rất thấp (10 -4 - 10-6), ngoài ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tương đối cao. Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc phục được nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh như: qui mô thí nghiệm, thời gian chọn lọc, khống chế được điều kiện gây nhiễm. Ngoài ra có thể nhận được các đột biến đơn gen và đột biến lặn. Nếu tần số đột biến đơn gen trong trường hợp đột biến thực nghiệm là 10-4 - 10-6 thì ở quần thể cây tái sinh (R o) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981). Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981). Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần nghiên cứu giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượng lây nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh). Để chọn dòng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc tố gây bệnh (ĐTGB). Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễm là protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và phân biệt được tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển trên cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975), Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau đó nuôi vấy và chọn lọc. Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng của tế bào sạch virus hoặc kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô từ tế bào sạch virus sinh trưởng nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh trưởng chậm hơn và có màu vàng. Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh như Phoma lingam, Plamidomonas brassicae (Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs, 1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs, 1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae (Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977), Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) cũng đã được sử dụng để chọn dòng chịu bệnh. Prasad và cs (1984) đã chọn được dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sương bằng phương pháp tái sinh cây từ hoa tự non đã bị nhiễm nấm. Sun & cs (1986) đã nuôi mô sẹo từ phôi lúa cùng với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae và đã chọn được các dòng kháng bệnh. Một số tác giả khác đã tiến hành gây nhiễm các cây tái sinh từ mô trong điều kiện in vitro và nhận được những kết quả đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass, 1986; Joung & cs, 1987). Ngoài ra có thể đưa các cây tái sinh từ mô hoặc tế bào trồng trên đất bị nhiễm nấm, nhưng hướng này chưa được tiến hành nhiều. Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ một số nấm và vi khuẩn đã được dùng nhiều trong chọn dòng chịu bệnh, sử dụng ĐTGB trong chọn dòng có ưu điểm là các tế bào có thể bị nhiễm đồng đều và nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), vì thế có thể sử dụng các nguyên liệu một cách đa dạng. Ngoài ra còn có sự tương quan thuận giữa kháng ĐTGB trong điều kiện in vitro và in vivo. Chọn các dòng kháng ĐTGB đã được tiến hành thành công đối với protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dịch lỏng (Connell & Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey, 1986), phôi thứ cấp (Sacristan, 1982) và đỉnh chồi (Gantotti & cs, 1985). Sử dụng ĐTGB đối với tế bào còn mở ra nhiều triển vọng chọn được các đột biến kháng bệnh hiếm (Carlson, 1973). Bên cạnh những ưu điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chịu bệnh cần lưu ý một số vấn đề như xác định cụ thể vai trò của độc tố trong quá trình gây bệnh vì trong nhiều trường hợp cây bị bệnh nhưng không phát hiện có độc tố hoặc xác định được trong cây có độc tố gây bệnh nhưng độc tố lại không có vai trò trong việc gây bệnh (Scheffer, 1983). Một vấn đề nữa là trong nhiều trường hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại không có khả năng kháng bệnh. Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc dù có những đặc điểm có thể không thể hiện ở cây tái sinh, nhưng nếu ta tái sinh được số lượng cây nhiều đến mức cần thiết thì cũng có thể có những cây mang những đặc điểm mong đợi. Điều này đã được khẳng định bằng công trình của Thanutong & cs (1983). Các tác giả đã nhận được 10-20% số cây tái sinh có khả năng kháng độc tố của Pseudomonas và độc tố của Alternaria. ĐTGB dùng trong chọn dòng chịu bệnh có thể là dạng thô hoặc tinh khiết. ĐTGB thô dưới dạng dịch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn được sử dụng nhiều để chọn dòng chịu bệnh. Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã được công bố khi sử dụng ĐTGB thô như khoai tây kháng P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke (1985) đã nhận được dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae khi sử dụng độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên. Ngoài phương pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế bào, mô hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB, ứng dụng khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thể chọn được dòng chịu bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980; Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng chịu bệnh theo phương pháp này. Giống mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) và giống lhoai lang “Sarlet” chịu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã được chọn và đưa vào sản xuất. Hiện nay khi việc tái sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng đối với hầu hết các giống cây thì chọn lọc theo hướng này có nhiều hứa hẹn và trên thực tế đã có các giống chịu bệnh đuợc đưa vào sản xuất nhưng có một số mặt hạn chế của phương pháp này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần thể lớn cây tái sinh trong điều kiện tự nhiên; thứ hai là phân dòng sôma làm thay đổi nhiều đặc điểm khác nên nhiều khi chọn được dòng chị bệnh nhưng lại ảnh hưởng đến đặc điểm kinh tế (Bidney & Shepard, 1981). Nhìn chung đã có nhiều công trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng nuôi cấy mô và tế bào để chọn dòng chịu bệnh ở cây trồng nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều vấn đề cần giải quyết như cơ chế tương hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gây bệnh, liên quan đến vấn đề này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Một vấn đề quan trọng nữa là xác định được vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọn lọc in vitro. Một số vấn đề liên quan về mặt kĩ thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rút ngắn thời gian nuôi cấy và tái sinh cây để tránh những thay đổi về hình thái và một số đặc điểm khác. Việc chọn lựa đối tượng để áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào vào chọn dòng chịu bệnh cũng rất quan trọng. Một số tác giả khác cho rằng nuôi cấy mô, tế bào có thể áp dụng để chọn dòng chịu bệnh ở các loài cây sinh sản vô tính thì phù hợp và có kết quả hơn (Daub, 1986; Jones, 1990). Ngoài ra nuôi cấy mô và tế bào có thể áp dụng để chọn các dòng chịu bệnh đơn gen hoặc chịu bệnh mang gen lặn (Jones, 1990). Việc sử dụng các ĐTGB không đặc hiệu để chọn các dòng chịu bệnh đặc biệt mà bằng các phương pháp thông thường không chọn được cũng đã được đề cập (Jones, 1990). 3.4. Chọn dòng chống chịu các stress của môi trường Các stress môi trường bao gồm những điều kiện bất lợi của môi trường như phèn, chua, mặn, khô, hạn, nóng, lạnh.... Việc chọn tạo những giống cây trồng chống chịu được các stress môi trường là rất cần thiết. Theo Nabors (1990) hiện nay có ít nhất 25% đất trồng bị mặn (chủ yếu do NaCl), 25% số đất chua (là do ion nhôm). 40-60% đất khô hạn. Ngoài ra do việc cải tạo môi trường như tưới tiêu, bón phân, sử dụng các chất diệt sâu bọ và diệt cỏ cũng dẫn đến việc cần thiết chọn tạo các giống cây trồng chống chịu với các tác nhân trên. Như đã trình bày ở các phần trên, nuôi cấy mô và tế bào có thể đóng góp một phần trong việc tạo chọn các dòng chống chịu các stress môi trường. Trước khi giới thiệu một số thành tựu trong lĩng vực này chúng tôi đề cập đến một số vấn đề liên quan đến cơ sở cũng như phương pháp chọn các dòng chống chịu stress môi trường. Ngoài một số vấn đề chung được đề cập ở các phần chọn dòng chịu bệnh và dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao, chọn dòng chống chịu stress môi trường còn có một số vấn đề liên quan đến cơ sở của tính chống chịu ở mức độ tế bào và ở cây hoàn chỉnh. Đặc biệt là cơ sở di truyền của tính chống chịu stress môi trường còn chưa được biết rõ.Nhiều tác giả cho rằng có thể có nhiều alen tham gia vào tính chống chịu stress môi trường, ngoài ra các alen này thường là lặn nên không thể hiện trong trường hợp dị hợp tử. Đây là những vấn đề làm cho việc chọn các dòng chống chịu stress môi trường chưa có được những thành tựu mong muốn. Ngoài ra một số vấn đề quan trọng nữa là tương quan giữa khả năng chống chịu các stress môi trường ở cây hoàn chỉnh và tế bào nuôi cấy rất phức tạp vì thế chọn dòng bằng nuôi cấy mô có thể không tạo được cây chống chịu những điều kiện đặc biệt trên đồng ruộng. Mặc dù có một số vấn đề hết sức quan trọng được nêu ở trên, thực tế vẫn có những cơ sở và số liệu đáng tin cậy về triển vọng ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào để chọn các dòng chống chịu với các stress môi trường: chúng ta đều biết nhiều đặc điểm đa gen có thể biến đổi bởi đột biến xảy ra ở một trong các gen tham gia vào đặc điểm này. Những kết quả nghiên cứu của Gorham và cs ( 1987 ) và Ashraf và cs ( 1986 ) đã cho thấy tính chống chịu với một số stress liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể và di truyền qua thế hệ sau. Ngoài ra đã có những số liệu về sự phân ly theo Mendel của các đặc điểm được chọn lọc (Comner & Meredits, 1985). Cho đến nay hầu hết các công trình chọn dòng chống chịu stress môi trường đều chọn theo phương pháp chọn lọc trực tiếp. Việc tiến hành xử lý các stress có thể tiến hành khi mô sẹo (callus) mới hình thành hoặc khi mô sẹo đã phát triển. Các stress có thể ở mức độ thấp hoặc ở mức độ gây chết, và có thể xử lý một nồng độ nhất định hoặc khi tế bào chịu được một nồng độ nào đó lại đưa lên nồng độ cao hơn. Việc tiến hành xử lý có thể liên tục hoặc gián đoạn, thời gian xử lý có thể ngắn hoặc dài. Cho đến nay chưa có những nghiên cứu so sánh cụ thể đối với từng trường hợp trên. Tốt nhất tùy từng đối tượng cụ thể mà kết hợp việc chọn lọc theo cách này hay cách khác. Đây là một vấn đề nghiên cứu về mặt phương pháp nhưng hết hết sức quan trọng, nó đóng góp vào sự thành công trong việc chọn các dòng chống chịu stress môi trường. Muốn nhận những đột biến mới hoặc đột biến lặn, chọn lọc có thể tiến hành ở mô đơn bội từ hạt phấn, nếu chọn lọc ở mô đơn bội từ hạt phấn lai F1 có thể nhận được các đột biến đơn gen và các tái tổ hợp của các alen sẵn có. Trong những năm gần đây đã có những bước tiến đáng kể trong việc chọn dòng chống chịu muối, hạn, chua và nhiệt độ. Nhiều dòng chịu muối (NaCl) đã được chọn lọc từ mô nuôi cấy của các loài Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium, Ipomoea babatas L. (Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985), Medicago sativa L. (McCoy 1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and Swartz, 1984). Tính chống chịu trong một vài trường hợp được thông báo là ổn định ở mức độ tế bào và cây hoàn chỉnh (Winnicov, 1991). Về cơ chế của tính chịu muối cũng đã có những kết quả đáng ghi nhận. ở Việt Nam việc tiến hành chọn các dòng thuốc lá địa phương chịu muối cũng được tiến hành và đã thu được những kết quả tiến bộ (Nguyễn Hoàng Lộc & cs, 1990). Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy abscisic axit (ABA) là chất có liên quan đến việc tổng hợp các protein mới (đặc biệt là protein với phân tử lượng 26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh & cs, 1987). Mối tương quan giữa ABA, tính chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt là vấn đề nghiên cứu hết sức lý thú trong những năm tới. Các dòng chịu hạn đã được thông báo (Bressan & cs, 1981, Hand & cs, 1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000 hoặc PEG 6000 đưa vào môi trường để chọn. Vấn đề tạo dòng kháng nhôm được Couner và cs nghiên cứu khá tỉ mỉ (Conner & Meredith, 1985). Các tác giả đã chọn được các dòng thuốc lá kháng nhôm ổn định, tính kháng nhôm là đặc điểm trội và di truyền qua thế hệ sau. Việc chọn các dòng chống chịu với nhiệt độ thấp hoặc cao cũng đã có tiến bộ: Preil và cs. (1983) đã nhận được các cây cúc chịu được nhiệt độ thấp. Nhìn chung phần lớn các nghiên cứu từ trước đến nay đều tập trung vào tìm cơ chế của tính chịu lạnh và chịu nóng. Những kết quả của Chen và Gusta (198) nhận được trên Triticum aetivum L, Secale cereale L, và Bromus inermis Leyss cho thấy ABA làm tăng khả năng chịu lạnh đáng kể. Các tác giả cho rằng ABA là chất cần thiết để tạo dòng chịu lạnh. Orr và cs cũng nhận được những kết quả tương tự về tác dụng của ABA. Cả tính chịu lạnh và tính chịu nhiệt đều liên quan đến việc tổng hợp hàng loạt các protein mới nhưng vai trò cụ thể của từng loại protein mới này như thế nào? Chúng có vai trò gì trong quá trình chịu lạnh và chịu nhiệt cao? Đây là những câu hỏi còn đang để ngỏ. Chọn dòng chống chịu stress môi trường là yêu cầu chiến lược trong công tác giống cây trồng nhưng cho đến nay phần lớn các công trình tập trung vào tìm kiếm các phương pháp chọn lọc và tìm ra cơ chế của loại chống chịu này. Những kết quả nhận được mới chỉ là những cơ sở hết sức ban đầu. Để có được những thành công trong tương lai và có được những áp dụng vào thực tiễn những nghiên cứu thuộc hai hướng trên vẫn là điều quan tâm hàng đầu. 3.5. Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao Các chất thứ cấp ở thực vật là những hợp chất trong cơ thể thực vật nhưng không có vai trò đối với các quá trình sống cơ bản, những hợp chất này giữ vai trò thứ cấp trong cây. Thực ra về mặt tiến hoá, các chất thứ cấp đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình đấu tranh sinh tồn vì đây là những chất độc đối với động vật và vi sinh vật, các chất có tác dụng quyến rũ côn trùng hoặc có mầu sắc và hương vị đặc biệt. Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào trong những năm gần đây đã mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôi sinh khối lớn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm đã ký với các hãng sản xuất để thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy trên quy mô công nghiệp. Một trong những yêu cầu của quá trình công nghiệp hoá tế bào nuôi cấy để thu nhận các chất thứ cấp là vấn đề tạo các dòng cho năng suất cao và ổn định. Vật liệu thường dùng để chọn dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao là mô hoặc tế bào nuôi cấy dịch lỏng. Đối với các chất thứ cấp có màu, có thể chọn bằng mắt. Đối với các chất thứ cấp không có màu trước khi cấy chuyển cần được phân tích. Đây là việc làm tốn khá nhiều công sức và thời gian. Để khắc phục, Ogino và cs (1978) đã đưa ra phương pháp ép tế bào. Theo phương pháp này, các cụm tế bào hoặc mô được ép giữa hai tờ giấy lọc, nhựa tế bào sẽ ngấm vào giấy lọc sau đó dùng phương pháp nhuộm để xác định. Đối với một số chất được tế bào tiết ra môi trường thì có thể xác định theo phương pháp dùng màng phủ than hoạt tính để hấp thụ các chất sau đó dùng tia cực tím (UV) để xác định (Knoop and Beiderback, 198). Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp xác định dựa vào tính chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn của các chất do tế bào tiết ra như berberine chẳng hạn (Suzuki & cs, 1987). Các phương pháp khác như phóng xạ hoặc phân biệt tế bào bằng huỳnh quang cũng đã được sử dụng. Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao thành công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào nuôi cấy là rất quan trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ.Tuy nhiên vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng và nồng độ đường đã được ghi nhận. Hàm lượng các chất thứ cấp trong tế bào còn phụ thuộc vào tăng trưởng về sinh khối, tốc độ tổng hợp và tiết ra môi trường của các chất này. Thường thường tế bào nuôi cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chu kỳ sinh trưởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào nuôi cấy có tốc độ sinh trưởng nhanh và không kèm theo sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp. Những tế bào nuôi cấy có tốc độ phân chia chậm thì có ưu thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp. Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề được nhiều tác giả quan tâm. Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có năng suất cao cho hàm lượng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suất thấp. Cũng trên đối tượng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ cây có năng suất cao không phải lúc nào cũng cho năng suất chất thứ cấp cao. Kết quả này cũng được công bố trên những loài cây khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979). Cho đến nay vẫn chưa có chứng minh chắc chắn về tương quan giữa năng suất của cây làm nguyên liệu và năng suất của tế bào nuôi cấy. Theo Wilson (1990) nên sử dụng những cây đa dạng về di truyền để tạo dòng tế bào khởi đầu. Một số tác giả thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây dùng để tạo ra các dòng tế bào không ảnh hưởng tới năng suất các chất thứ cấp (Speake & cs, 1964). Nhiều tác giả khác lại nhận được các kết quả cho thấy các dòng tế bào từ các bộ phận khác nhau của cây, thậm chí từ cùng một bộ phận cũng cho năng suất các chất thứ cấp khác nhau (Zenk & cs, 1975; Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982). Hall và Yeoman (1987) còn cho biết trong quần thể tế bào nuôi cấy khả năng tổng hợp các chất (đặc biệt là đối với các chất màu) cũng khác nhau giữa các tế bào. Những sự biến động về tích lũy các chất thứ cấp này là những cơ sở để tìm các phương pháp phù hợp cho việc chọn ra các dòng cho năng suất cao. Cho đến nay đã tồn tại ba hệ thống chọn lọc, hệ thống thứ nhất là sử dụng các tế bào nuôi cấy đồng đều và ổn định; hệ thống thứ hai là sử dụng hổn hợp tế bào, nhưng các tế bào riêng rẽ ổn định; và hệ thống thứ ba là sử dụng hỗn hợp tế bào mà tế bào riêng rẽ không ổn định. Hệ thống chọn lọc thứ nhất tạo ra các dòng cho năng suất ổn định còn hệ thống thứ hai và thứ ba tạo ra các dòng ổn định và không ổn định. Một vấn đề rất quan trọng mà cho đến nay vẫn chưa sáng tỏ là cơ sở của những thay đổi kiểu hình, quá trình điều khiển trao đổi các chất thứ cấp ở tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Để có được những phương pháp chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao những nghiên cứu về vấn đề này là rất quan trọng. Ngoài những phương pháp chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao đã nêu, ứng dụng công nghệ gen để tạo các dòng tế bào này là một hướng cần được tiến hành, tuy nhiên ở đây cũng còn nhiều vấn đề liên quan chưa được hiểu biết đặc biệt là những cơ sở sinh hoá và phân tử trong chu trình trao đổi chất thứ cấp. Mặc dù còn một số vấn đề cần giải quyết nhưng những thành tựu đạt được trong chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao đã mở ra triển vọng lớn trong việc đưa tế bào thực vật nuôi cấy vào sản xuất các chất thứ cấp có ý nghĩa trong nông nghiệp, công nghiệp và y học. Đặc biệt là sự phát triển hệ thống công nghiệp để sản xuất sắc tố đỏ và chất diệt khuẩn Shikonin ở Nhật (Curtin, 1983) đã mở ra triển vọng công nghiệp hoá việc thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy. Viện Công nghệ sinh học Canada và các phòng nghiên cứu của hãng Vipont đã hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công nghiệp sản xuất Sangninarine sử dụng trong sản xuất thuốc đánh răng (Agricell Report, 1989). Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các chất này rất khó tổng hợp và hiện nay nguồn cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng. Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng nguồn cung cấp hoặc thay thế việc trồng trọt các cây cho những chất này đang được quan tâm đặc biệt. Vấn đề tìm ra các phương pháp chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là khâu then chốt để đưa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mô công nghiệp. Những thành tích đạt được trong lĩnh vực này đặc biệt là việc công nghiệp hoá sản xuất Shikonin bằng tế bào nuôi cấy là những tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy để nhận các chất thứ cấp có giá trị kinh tế cao. Ở Việt Nam các nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận các chất thứ cấp đã được bắt đầu từ những năm 80 trên các đối tượng thuốc lá, tam thất, thanh hao, taxus. Năm 1988, Phan Huy Bảo và cs đã thông báo chọn được dòng tam thất cho hàm lượng saponin cao. Những thay đổi về hàm lượng nicotine liên quan đến quá trình phân hoá mô và cây tái sinh cũng đã được công bố (Nguyễn Đức Thành và cs, 1991 ). IV. LAI TẾ BÀO 4.1. Dung hợp protoplast và lai nhân. Do không có vách xellulô nên protoplast (tế bào trần) trở thành một đối tượng lý tưởng trong việc nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai loại protoplast có thể tạo đươc các cây lai sôma (lai nhân hoặc lai tế bào chất). Ngoài ra có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan như nhân, lục lạp, ty thể hoặc chuyển các vectơ mang các gen mã hoá cho một số đặc điểm biết trước. Protoplast có thể dung hợp tự nhiên. Hiện tượng này thường xảy ra sau khi tách protoplast từ một loại cây. Tần số dung hợp tự nhiên phụ thuộc vào các giống cây Schieder & Vasil, 1980), ở cà độc dược tần số này đạt tới 8% (Schieder, 1974). Để dung hợp hai loại protoplast khác nhau thường phải xử lý một số tác nhân. Một số tác giả dùng nước biển (Hofmeister, 1954; Binding, 1966, 1974), hoặc nitrat natri (Power & cs, 1970; Carlson, 1972), một số khác sùng các chất kích thích như lectin nhưng hiệu suất dung hợp rất thấp (Hartman & cs, 1973; Burges & Fleming, 1974; Glimelus & cs, 1974). Hiệu suất dung hợp khá cao có thể đạt được bằng cách xử lý protoplast bằng ion Ca2+ ở 37oC và môi trường kiềm (pH=10,5) (Keller & Melchers, 1973; Binding, 1974; Schieder, 1974). Hiện nay phương pháp có hiệu quả và được sử dụng rộng rãi là phương pháp dung hợp của Kao và đồng nghiệp (Kao & Michayluk, 1974; Constabel & Kao, 1974). Các tác giả đã dùng polyethylen glycol (PEG) có phân tử lượng cao (6000) để gắn các protoplast