Tài liệu Sàng lọc, định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng giảm nhiễm mặn

Đồ Án Tốt Nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG HẤP THU MUỐI VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG GIẢM NHIỄM MẶN Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS. Hoàng Quốc Khánh HVCH. Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện: Châu Thị Thùy Linh MSSV: 1411100757 Lớp: 14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2018 Đồ Án Tốt Nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Quốc Khánh và HVCH. Ngô Đức Duy, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới. Những số liệu và kết quả phân tích trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kì nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong đồ án này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Viện Khoa học ứng dụng Hutech và trước Ban Giám Hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Ngày … tháng … năm 2018 Sinh viên thực hiện Châu Thị Thùy Linh Đồ Án Tốt Nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................. i DANH MỤC HÌNH ẢNH ...............................................................................................ii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... iii MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu............................................................................................ 2 2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 2 2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................... 4 3. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................ 6 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................... 6 5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 6 6. Các kết quả đạt được ............................................................................................ 6 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp ....................................................................................... 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 8 1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam và các hướng giải quyết hiện nay ................. 8 1.1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam ............................................................... 8 1.1.2 Nguyên nhân gây ra xâm nhập mặn .................................................................. 9 1.1.3 Các cách khắc phục xâm nhập mặn hiện nay .................................................. 10 1.2 Các cơ chế khử muối ............................................................................................... 12 1.2.1 Cơ chế khử muối trong tự nhiên ...................................................................... 12 1.2.2 Cơ chế khử muối của thực vật ......................................................................... 12 1.2.3 Cơ chế khử muối của động vật......................................................................... 13 1.2.4 Cơ chế khử muối của vi sinh vật ...................................................................... 14 1.3 Giới thiệu về nhóm vi khuẩn quang hợp ................................................................. 15 1.4 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử ...................................................... 17 1.4.1 Nguyên tắc ....................................................................................................... 17 Đồ Án Tốt Nghiệp 1.4.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật............................................................. 17 1.4.3 PCR trong định danh vi sinh vật ...................................................................... 18 1.4.4 Xây dựng cây phát sinh loài ............................................................................. 21 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................ 22 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................. 22 2.2.1 Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................... 22 2.2.2 Giống vi khuẩn ................................................................................................. 22 2.2.3 Hóa chất ........................................................................................................... 22 2.2.4 Các phần mềm sử dụng .................................................................................... 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 24 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................. 24 2.3.2 Thu mẫu ........................................................................................................... 25 2.3.3 Tăng sinh .......................................................................................................... 27 2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn quang hợp .......................................................................... 27 2.3.5 Bảo quản........................................................................................................... 28 2.3.6 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn ....................................... 28 2.3.7 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng hấp thu mặn .................................. 28 2.3.8 Định danh các chủng vi khuẩn ......................................................................... 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .................................................................. 32 3.1 Kết quả tăng sinh của vi khuẩn................................................................................ 32 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn ....................................................................................... 33 3.3 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn ........................................................................ 36 3.4 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn ....................................................................... 39 3.5 Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ mặn .................................................................. 42 3.6 Định danh ................................................................................................................ 45 3.6.1 Ly trích, thu nhận DNA ................................................................................... 44 Đồ Án Tốt Nghiệp 3.6.2 Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR .......................................................... 45 3.6.3 Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI ............... 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 51 4.1 Kết luận.................................................................................................................... 51 4.2 Kiến nghị ................................................................................................................. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 52 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................. 53 Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BIM Basic Isolation Media FO Forward Osmosis GM Glutamate – Malate IC Ion Exchange NSSW Nutrient Supplemented Seawater RO Reverse Osmosis SSI Rhodobacter Sphaeroides i Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơ chế dung nạp muối trong thực vật: sự hình thành tinh thể trên lá của Avicennia germinans (A) và lá Atriplex (B) ...................................................................... 13 Hình 1.2. Giải thích nguyên nhân sự hấp thu Na+ thông qua hệ thống bơm ion màng (Halorhodopsin) do tác động của ánh sáng là đặc trưng của Cl-. ...................................... 14 Hình 2.1. Mô phỏng vệ tinh khu vực lấy mẫu, xã Hựu Thạnh thuộc huyện Đức Hòa nằm ở vị trì 10o90’23” vĩ độ Bắc, 106o41’85” Kinh độ Đông ..................................................... 25 Hình 2.2. Một góc bản đồ Liên tiểu khu 104 – xã Viên An Đông, rừng phòng hộ Nhưng Miên và vị trí lấy mẫu. ...................................................................................................... 26 Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA ................................................................. 30 Hình 3.1. Kết quả mẫu RL19 và mẫu RL6 tăng sinh thành công. .................................... 32 Hình 3.2. Kết quả phân lập sau 7 ngày trên môi trường thạch BIM của chủng CM24 (hình trái) và kết quả làm thuần của chủng CM24 đang chuyển dần sang đỏ sau 5 – 7 ngày (hình phải). .................................................................................................................................. 35 Hình 3.3. Kết quả phân lập trên môi trường thạch BIM của một số chủng vi khuẩn....... 35 Hình 3.4. Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn quang hợp phân lập được dưới vật kính 100X. .................................................................................................. 37 Hình 3.5. Chủng RL1 có thể phát triển ở mọi nồng độ muối. Nhưng ở nồng độ muối 20‰ thì sự phát triển vượt trội hơn ở các nồng độ muối khác, giá trị OD660 đạt 0,504 sau 7 ngày khảo sát. ................................................................................................................. 39 Hình 3.6. Chủng RL8.1 phát tốt ở mọi nồng độ nhưng ở nồng độ muối 10, 15, 20‰ có sự phát triển cao hơn hẳn, giá trị OD660 ở nồng độ 10‰ đạt 0,824 sau 7 ngày khảo sát. ...... 39 Hình 3.7. Chủng 34.3 phát triển tốt ở mọi nồng độ, chúng phát triển tốt nhất ở nồng độ muối 5‰, giá trị OD660 đạt 0,666 sau 4 ngày và ở nồng độ muối 20%, giá trị OD660 đạt 0,658 sau 7 ngày khảo sát. ................................................................................................. 40 ii Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.8. Chủng 24.1 phát triển tốt ở mọi nồng đồ muối, chúng phát triển ổn định và tốt nhất, ờ nồng độ 5‰ giá trị OD660 đạt 0,868, nồng độ 20% giá trị OD660 đạt 0,585 sau 7 ngày khảo sát. .................................................................................................................... 40 Hình 3.9. Nồng độ muối của các chủng vi khuẩn (‰) sau khi kiểm tra. ........................ 43 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn. .............. 44 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gene DNA trên gel agarose 1% ........... 45 Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gene DNA trên gel agarose 1% sau khi tinh sạch. ............................................................................................................................ 45 iii Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các tính chất của vi khuẩn quang hợp ........................................................... 16 Bảng 1.2 Các trình tự gene đoạn mồi 16S rRNA.......................................................... 20 Bảng 3.1. Giá trị pH của các mẫu tăng sinh thành công ở tỉnh Long An và tỉnh Cà Mau ....................................................................................................................................... 31 Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn đã phân lập được. ......................................................... 33 Bảng 3.3 Kết quả nhuộm Gram của các chủng. ............................................................ 36 Bảng 3.4 Giá trị OD660nm của các chủng ở độ mặn 20‰ sau 7 ngày. .......................... 41 Bảng 3.5. Giá trị OD660 và mật độ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn sau 48 giờ ....................................................................................................................................... 42 iv Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo báo cáo của Tổ chức Phát triển Nước Thế giới của Liên Hiệp Quốc (The United Nations World Water Development) có khoảng 22% nước dùng cho công nghiệp, 8% nước dùng cho sinh hoạt của con người và 70% nước dùng cho nông nghiệp. Nhưng có tới trên 90% nước dùng cho nông nghiệp phần lớn ở các nước kém phát triển nhất (FAO, 2011a) mà không có các biện pháp sử dụng hiệu quả hay tiết kiệm, bên cạnh đó dự kiến tiêu thụ nước cho nông nghiệp sẽ tăng khoảng 20% toàn cầu vào năm 2050 (WWAP, 2012). Rất nhiều nguyên nhân gây ra sự ô nhiễm nước nông nghiệp ngày càng gia tăng, trong đó ô nhiễm trầm trọng nhất hiện nay là sự xâm nhiễm mặn do biến đổi khí hậu và nước biển dâng. Với số liệu thống kê hiện nay cho thấy rằng, có ba phần tư bề mặt Trái đất được bao phủ bởi nước, hơn 97% lượng nước ở dạng nước mặn không thể sử dụng trực tiếp cho ăn uống hoặc nông nghiệp. Trong 3% nước ngọt còn lại thì chỉ có khoảng 0,5% là có sẵn dưới dạng nước ngọt nhưng không phân bố đều trên toàn thế giới. Thêm vào đó là dân số tăng nhanh, sản xuất nông nghiệp, công nghiệp phát triển ồ ạt và biến đổi khí hậu đã gây ra nhiều vấn đề về môi trường. Một trong những vấn đề môi trường phổ biến nhất xảy ra là xâm nhập mặn vào vùng đất sản xuất nông nghiệp (Freeze và Cherry 1979; Fang 1997; Todd and Mays 2005). Sự xâm nhập từ nước biển là một mối quan tâm toàn cầu nghiêm trọng gặp phải hiện nay tại các vùng lãnh thổ ven biển như Bắc Phi, Trung Đông, Bờ biển Địa Trung Hải, Trung Quốc, Mexico, Đại Tây Dương, Hoa Kỳ và Việt Nam. Trong hàng triệu năm qua, các vi sinh vật – bậc thầy thích ứng, đã sống sót trên trái đất mà không phải sử dụng quá nhiều năng lượng và tài nguyên cũng như không ảnh hưởng đến môi trường sống. Cụ thể, khử muối bằng năng lượng mặt trời thông qua các vi khuẩn quang hợp là một cơ hội có tiềm năng để khai thác mục đích này. Các vi khuẩn 1 Đồ Án Tốt Nghiệp quang hợp đặc biệt có thể sinh ra một lượng sinh khối lớn trong nước lợ, nước biển và được sử dụng như một bộ trao đổi ion thông qua các kênh protein màng. Để giải quyết bài toán làm sao giảm mặn trong đất và nước nông nghiệp là rất quan trọng và cần thiết. Do vậy, việc đầu tiên là phải có bộ sưu tập chủng vi sinh nói chung và chủng vi khuẩn quang hợp nói riêng. Cho nên đồ án này sẽ bước đầu “Sàng lọc, định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng giảm nhiễm mặn”. 2. Tình hình nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Khác với các chất gây ô nhiễm hữu cơ khác, các kim loại nặng nguy hại đa số không thể phá hủy, vì chúng không thể bị suy thoái hóa học hoặc sinh học. Thậm chí tệ hơn là một số kim loại nặng có thể tích tụ dọc theo chuỗi thức ăn và cuối cùng tích lũy trong cơ thể con người D.E. Crowley và cs (1991), M.M. Lasat và cs (1996). Do đó, các nghiên cứu tập trung nhiều vào những năm qua để khắc phục các loại đất bị ô nhiễm, trong đó việc sử dụng thực vật và vi khuẩn để loại bỏ các ion kim loại độc hại đặc biệt có kích thước lớn N.S. Pence và cs (2000), R.K. Mehra và ca (1991) và D.R. Winge và cs (1985). Thông thường nếu một cây có thể tích lũy hơn 1000 mg/kg (hoặc 1000 ppm) Cu, Co, Cr, Ni hoặc Pb, hoặc hơn 10.000 mg/kg (hoặc 10.000 ppm) của Mn hoặc Zn, nó được xem là nhiễm kim loại nặng quá cao S. Loeffler và cs (1989). Vi khuẩn có diện tích bề mặt riêng lớn hơn và hiệu quả hơn để kích hoạt và loại bỏ kim loại nặng. Tuy nhiên, hiện nay hiện tượng nhiễm mặn hay stress muối là một trong những yếu tố nghiêm trọng nhất làm hạn chế năng suất lúa vì nó ảnh hưởng xấu đến số lượng và chất lượng của cây trồng (Sahi et al. 2006). Muối ảnh hưởng đến hầu như tất cả các phần của sinh lý học thực vật ở cả cấp độ thực vật và tế bào thông qua áp suất thẩm thấu và ion (Khalid et al. 2010). Do đó, độ mặn có hại cho tất cả các giai đoạn của cây trồng từ nảy mầm hạt giống, tăng trưởng cây con, phát triển, ra hoa và hoa quả và cuối cùng nó làm giảm sản lượng kinh tế và chất lượng của sản phẩm (Nakhoda et al. 2012). 2 Đồ Án Tốt Nghiệp Chính vì thế, mà những năm gần đây đã và đang có những nghiên cứu tập trung về nhóm vi khuẩn quang dưỡng có khả năng loại bỏ muối như nghiên cứu mới nhất và hiệu quả nhất là công bố của Kei Sasaki và cs (2017), việc ứng dụng vi sinh hấp thu độ mặn, kết quả đạt được từ nghiên cứu này là việc loại bỏ Na từ nước biển bằng cách sử dụng hai chủng vi khuẩn quang hợp Rhodobacter sphaeroides SSI và Rhodovulum sp đều phát triển tốt trong môi trường GM (Glutamate-Malate ) có 3% NaCl. Trong đó chủng Rhodobacter sphaeroides SSI được chứng minh là tăng trưởng tốt, khả năng loại bỏ Na tối đa là 39,3% trong điều kiện có ánh sáng và 36,7% trong điều kiện tối. Còn chủng Rhodovulum sp. được chứng minh là phát triển tốt có tỷ lệ loại bỏ Na tối đa là 64,9% bởi Rhodovulum sp cả hai điều kiện sáng và tối sau hai ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, vấn đề lớn xảy ra là sau khoảng 2 đến 3 ngày nuôi cấy tiếp theo thì hiện tượng Na quay trở lại môi trường do quá trinh chuyển điện tử và trao đổi chất. Còn trong môi trường bổ sung dinh dưỡng khác là môi trường NSSW (Nutrient Supplemented SeaWater) có 5.0g/l Glucose và 2.0g/l Peptone thí nghiệm trong 8 ngày cho thấy rằng. Giai đoạn 4 ngày đầu thì cho thấy chủng Rhodobacter sphaeroides SSI loại bỏ tới 30,3% Na sau 4 ngày nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng và Rhodovulum sp. lên tới 48,9%, trong cả hai trường hợp này hầu như Na được hấp thụ hoàn toàn mà không có trường hợp trả lại môi trường và kết quả tương tự đã được quan sát dưới các điều kiện tối. Giai đoạn 4 ngày tiếp theo thì dịch nuôi cấy được li tâm và tách Rhodovulum sp. tách ra khỏi dịch nuôi, sau đó cấy chủng Rhodobacter sphaeroides SSI vào dịch trên nuôi tiếp trong điều kiện tối thì lượng Na cũng sẽ hấp thu thêm.[13] Nghiên cứu của Panwichian và cs (2010) về tỷ lệ loại bỏ các kim loại nặng và natri từ những chủng vi khuẩn quang dưỡng được phân lập mới từ những ao nuôi tôm nhiễm kim loại nặng ở 3 tỉnh phía Nam của Thailand như tỉnh Nakhon Si Thammarat, Patthalung và Songkhla xung quanh khu vực hồ Basin (Songkhla Lake Basin). Kết quả đa số cho thấy từ 120 chủng được phân lập ở 31 ao nuôi tôm cho thấy việc loại bỏ kim loại nặng như Pb, Cu, Cd, Zn không cao lắm. Tuy nhiên, có được hai chủng NW16 và KMS24 có khả năng làm giảm nhóm kim loại nặng và Na như sau: 39% Pb, 20% Cu, 7% Cd, 5% Zn và 31% 3 Đồ Án Tốt Nghiệp Na từ nước có nồng độ kim loại nặng cao và khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường 3% NaCl có ánh sáng và trong tối. Tuy nhiên, chủng NW16 loại bỏ kim loại nặng tốt hơn chủng KMS24, nhưng ngược lại chủng KMS24 sinh trưởng tốt trong cả hai điều kiện môi trường.[26] Theo khảo sát ứng dụng chủng Rhodopseudomonas palustris TK103, Rhodopseudomonas palustris PP803 và Rhodopseudomonas palustris P1 của Thanawan Kantha và cs (2015), kết quả họ đề xuất sử dụng và phối trộn với rơm và than trấu để làm phân bón cho ruộng lúa với nồng độ gây stress muối khoảng 0,25 % NaCl và làm giảm khí gây hiệu ứng nhà kính như CH4 và CO2 sinh ra từ ruộng lúa. Kết quả cho thấy chủng Rhodopseudomonas palustris PP803 làm cho hạt gạo nẩy mần phát triển tốt như sinh khối và độ dài của rể trong môi trường đất bị stress muối so với mẫu đối chúng là chỉ có nước. Ngoài ra trong mô hình nghiên cứu đồng ruộng dưới điều kiện ánh sáng 10 ngày ước lượng nồng độ tế bào chủng Rhodopseudomonas palustris PP803 dao động từ 6,7 – 6,8 CFU/ ml và làm giảm 100% CH4 và 47% CO2.[25] 2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Việt Nam và khu vực ĐBSCL được thế giới đánh giá là một trong những nơi bị ảnh hưởng của biến đổi khí hậu dẫn tới xâm nhiễm mặn vào trong vùng đất sản xuất nông nghiệp và sẽ ảnh hưởng to lớn trong tương lai vùng lúa gạo của thế giới. Điều này dẫn đến ảnh hưởng không nhỏ tới an ninh lương thực trong nước và toàn cầu. Tuy nhiên, hiện nay đa số những nghiên cứu thích ứng tới hiện tượng nhiễm mặn là chủ động chọn lọc giống cây trồng, chuyển đổi vật nuôi và thay đổi mục đích sử dụng đất. Trong đó đã có một số kết quả nghiên cứu về lúa và giống cây trồng chịu mặn như nghiên cứu chọn tạo được các giống lúa mới đạt tiêu chuẩn chịu mặn và phẩm chất tốt sau như giống lúa OM5464, OM5166 được công nhận sản xuất thử nghiệm (Trần Thị Cúc Hòa và cs (2000)) Một nghiên cứu khác cũng được tiến hành để kiểm tra khả năng chịu mặn theo phương pháp của IRRI, 1997. Kết quả đánh giá cấp chống chịu mặn của 5 giống lúa sau 16 ngày thử mặn, giống Đốc Phụng, Lúa Sỏi, Nàng Quớt Biển có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, giống Một Bụi Hồng có khả năng chịu 4 Đồ Án Tốt Nghiệp mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 10‰ khi giống chuẩn nhiễm IR28 ở cấp 9 (rất nhiễm). Giống CTUS1 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, hàm lượng amylose là 20,43%, hàm lượng protein 7,33%. Giống CTUS17 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, hàm lượng amylose là 26,20%, hàm lượng protein là 7,3%. CTUS4 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 10‰, hàm lượng amylose 18,00%, hàm lượng protein là 9,05%. (Quan Thị Ái Liên 2012). Kết quả công bố của Điêu Thị Mai Hoa và cs Giống lúa OM6976- Saltol có khả năng chịu mặn NaCl 150mM ở mức khá (điểm 3) trong khi giống gốc OM6976 mẫn cảm mặn (điểm 7). Giống lúa OM6976-Saltol có khả năng sinh trưởng ở cả giai đoạn nảy mầm và cây con trong điều kiện mặn tốt hơn hẳn so với giống OM6979. Ở nồng độ muối cao (NaCl 150 mM), dòng lúa mang gen chịu mặn OM6976-Saltol có khả năng sinh trưởng mầm, sinh trưởng cây con tốt hơn hẳn so với giống gốc OM6976 không mang gen Saltol. Theo tiêu chuẩn của IRIR1997, dòng OM6976-Saltol thể hiện khả năng chịu mặn mức khá ở nồng độ NaCl 150 mM. Tuy có nhiều nghiên cứu về giống lúa chịu mặn để thích ứng kịp thời trong sản xuất lúa gạo phù hợp với sự biến đổi khí hậu dẫn đến xâm nhiễm mặn trong vùng đất sản xuất nông nghiệp. Nhưng hiện nay chưa có một công bố khoa học nào liên quan tới quá trình loại muối từ nhóm vi sinh vật nói chung và nhóm vi khuẩn quang dưỡng nói riêng được phân lập và nghiên cứu tại Việt Nam nhằm hướng tới úng dụng trong việc giảm mặn cho những vùng đất và nước bị xâm nhiễm mặn. Chính vì thế, trước tiên, nhóm nghiên cứu bước đầu mong muốn phân lập, sàn lọc để tìm ra những chủng vi khuẩn quang dưỡng phù hợp với điều kiện nhiệt đới của nước ta, cho nên định hướng Đề tài KHCN “Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng xử lý giảm mặn” nhằm góp phần vào định hướng phát triển nông nghiệp bền vững và chủ động ứng phó giải quyết được một phần nào bài toán xâm nhiễm mặn do biến đổi khi hậu ngày càng khóc liệt ở ĐBSCL nói riêng và Việt Nam nói chung. 5 Đồ Án Tốt Nghiệp 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập, sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng xử lý giảm mặn 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập một số vi khuẩn quang hợp tại Long An và Cà Mau. Định danh vi khuẩn quang hợp dựa theo hình thái học và sinh học phân tử. Khảo sát khả năng chịu mặn và hấp thu mặn của vi khuẩn quang hợp. 4. Phương pháp nghiên cứu - Thu mẫu nước tại xã Nhị Thành, huyện Thủ Thừa, Long An, huyện Đức Hòa - Long An và rừng ngập mặn Nhưng Miên, huyện Ngọc Hiển, Cà Mau. - Phân lập vi khuẩn trên môi trường BIM thông qua việc quan sát hình thái tế bào, khuẩn lạc. - Khảo sát khả năng chịu mặn bằng phương pháp đo OD660nm. - Khảo sát khả năng khử mặn bằng phương pháp màng sinh học. - Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB). - Phương pháp PCR dựa trên cặp mồi 27F và 1492R. - Gửi mẫu giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa. - Đề tài sử dụng các phần mềm như ChromasPro 1.5.0.0, Mega5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0. - Ngân hàng gen https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ - Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet. 5. Các kết quả đạt được Từ 63 mẫu thu được từ Long An và Cà Mau phân lập được 44 chủng vi khuẩn. Chọn ra 3 chủng hấp thu mặn cao nhất để gửi định danh. 6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đề tài gồm 4 chương Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 6 Đồ Án Tốt Nghiệp Chương 3: Kết quả và biện luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 7 Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam và các hướng giải quyết hiện nay 1.1.1 Tình hình xâm nhập ở Việt Nam Theo dữ liệu đánh giá trong năm 2015 so với 2016 của Viện Khoa học Thủy lợi Miền Nam (VKHTLMN/2017) cho thấy rằng hiện trạng xâm nhập mặn vùng cửa sông Cửu Long như sau: Khu vực sông Vàm Cỏ: Độ mặn năm 2016 lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 4,7 - 7,4 g/l, xâm nhập mặn sâu vào đất liền khoảng 90 - 93 km. Khu vực các cửa sông thuộc sông Tiền: Năm 2016 có độ mặn lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 1,5 - 8,2 g/l, sự xâm mặn vào khoảng 45 - 65km. Khu vực các cửa sông thuộc sông Hậu: Độ mặn lớn nhất nhất so với cùng kỳ năm 2015, cao hơn từ 2,8 - 6,4 g/l, dộ nhiễm mặn sâu vào khoảng 55 - 60 km. Khu vực trên sông Cái Lớn: Độ mặn lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 4,8 - 7,6 g/l, chiều sâu xâm nhập mặn lớn nhất khoảng 60-65 km. Trong năm 2017 tại một số trạm điển hình vùng cửa sông Cửu Long như dưới đây: Tại Vàm Kênh, Vàm Giồng và Xuân Hòa trên sông Cửa Tiểu có độ mặn 23,5g/l, 3,6g/l và 0,6g/l thất hơn một chút so với cùng kỳ năm 2016 từ 0,1- 3,9g/L. Tại Bình Đại, Lộc Thuận và Giao Hòa trên sông Cửa Đại có độ mặn 25,6g/l, 14,2g/l và 3,2 g/l thấp hơn so với năm 2016 từ 1,4 - 2,6g/l. Tại Bến Trại, Trà Vinh trên sông Cổ Chiên có độ mặn 25,2g/l, 9,6g/l. Tại An Thuận, Sơn Đốc trên sông Hàm Luông có độ mặn là 29,0g/l, 13,1g/l. Tại Trần Đề, Đại Ngãi trên sông Hậu có độ mặn 20,3g/l và so với cùng kỳ năm 2016 thấp hơn 7,0g/l, 7,2g/l. Đa số độ mặn so với cùng kỳ 2016 điều có giảm chút ít, cũng do một phần năm 2017 lượng mưa trong năm nhiều so với năm 2016 (VKHTLNM 2017). Cho nên dư lượng độ mặn đã để lại trong vùng đất sản xuất nông nghiệp và ăn sâu vào trong đất liền từ các sông như: Sông Vàm Cỏ, sông Tiền, sông Cửa Tiểu, sông Cửa Đại, sông Hàm Luông, sông Cổ Chiên, sông Hậu và sông Cái Lớn đã ảnh hưởng cực kỳ to lớn tới đời sống sinh hoạt của người dân và đặc biệt là vùng sản xuất cây ăn trái và lúa gạo của Việt Nam là rất nghiêm trọng. Bên cạnh đó những kết quả đã công bố cũng như dự báo cho thấy tỷ lệ dân số nông thôn bị ảnh hưởng bởi xâm nhập mặn tăng từ 39.5% tại 8 Đồ Án Tốt Nghiệp thời điểm 2012 lên 41.4, 45.3 và 47.6% vào các năm 2020, 2030 và 2050 ( Đoàn Như Hà, 2014). 1.1.2 Nguyên nhân gây ra xâm nhập mặn Trước tiên, xem sơ lược tiêu chuẩn gọi là nước mặn và một số giải pháp xử lý khử nước mặn thành nước ngọt hiện nay trên thế giới. Nước biển chứa khoảng 35g muối trong một lít (tức 35‰) và theo tiêu chuẩn độ mặn trong nước uống là < 0,25‰. Trong đó nước có độ mặn 0,14‰ thì không ảnh hưởng xấu tới hoa màu. Có vài loại hoa màu chịu đựng được nước có độ mặn 0,36‰. Trên mức này, thực vật thông thường có dấu hiệu suy thoái hay bị chết. Tuy nhiên, có khoảng 3.500 loài thực vật chịu đựng được nước mặn - gọi là nhóm họ halophytes, trong số này thực vật trong rừng ngập mặn, đứng đầu chịu mặn là cây Mấm (Avicennia alba). Lúa thông thường không thể canh tác khi nước có độ mặn quá 4‰. Việc Trái Đất ngày càng nóng lên bởi hàng loạt các khí gây hiệu ứng nhà kính phát sinh từ các hoạt động công nghiệp, giao thông và sinh hoạt của con người (trong đó nguyên nhân đến từ hoạt động của tự nhiên chiếm phần nhỏ (bao gồm hoạt động của núi lửa, cháy rừng...) đã khiến băng ở hai cực và nhiều khu vực khác trên thế giới tan chảy mạnh, gây nên đại nạn nước biển dâng. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học đăng tải trên Tạp chí Scientific Reports, biến đổi khí hậu đang khiến mực nước biển dâng trung bình 4mm mỗi năm. Việc nước biển dâng cao tác động trực tiếp đến các quốc gia ven biển. Không chỉ khiến các quốc gia này hứng chịu nhiều cơn bão mạnh, nước biển xâm lấn còn khiến đất ngập mặn trên quy mô lớn. Theo các chuyên gia đánh giá, Việt Nam là quốc gia có mực nước dâng cao hơn mức trung bình toàn cầu. Điều này đồng nghĩa với việc mức độ phì nhiêu của vùng châu thổ lớn nhất nước (ĐBSCL) sẽ giảm dần diện tích. Theo số liệu thống kê của Viện Quy hoạch Thủy lợi miền Nam, hiện tượng sạt lở đã và đang xảy ra ngày một nghiêm trọng ở hai bên bờ sông Tiền và sông Hậu (vùng thượng và hạ châu thổ), nhất là vào khoảng thời gian đầu và cuối mùa mưa lũ, tác động đến đời sống và sản xuất của khoảng 19 triệu dân tại đây. 9 Đồ Án Tốt Nghiệp Cà Mau được xem là một trong những tỉnh chịu tác động nặng nề nhất do biến đổi khí hậu và nước biển dâng. (Có nơi, nước biển cách con lộ ở Cà Mau chỉ vài chục mét). Mỗi năm, biển lấn sâu vào Cà Mau 15m, có khu vực lên đến 50m. Bên cạnh nguyên nhân nước biển dâng cao, thì các hoạt động khai thác tự nhiên (như khai thác cát ở sông và khai thác nước ngầm) một cách tràn lan của con người cũng là những nguyên nhân khiến cho những thách thức mà ĐBSCL đang đối mặt thêm nặng nề. 1.1.3 Các cách khắc phục xâm nhập mặn hiện nay Quyết định số 1397/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ về Quy hoạch phát triển thủy lợi ĐBSCL giai đoạn 2012 - 2020 và định hướng đến 2050 trong điều kiện biến đổi khí hậu, nước biển dâng đã đặt mục tiêu đến năm 2050 cần đảm bảo an toàn dân sinh, sản xuất, cơ sở hạ tầng cho khoảng 32 triệu dân và chủ động ứng phó với các tác động của biến đổi khí hậu như nước biển dâng, xâm nhập mặn. Để làm rõ thực trạng xâm nhập mặn và những giải pháp phát triển bền vững nhằm hạn chế xâm nhập mặn tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là những nơi chịu ảnh hưởng lớn nhất của hiện tượng này. Từ đó có nhiều đề xuất giải pháp để ứng phó với xâm nhập mặn ở ĐBSCL như sau: Thứ 1: Tăng cường quan trắc, giám sát, nâng cao năng lực dự báo mặn. Thứ 2: Tăng cường hợp tác quốc tế với các nước trong hội Mekong và Trung Quốc; phải hợp tác chặt chẽ với các nước trong lưu vực sông Mekong. Thứ 3: Điều chỉnh quy hoạch tổng thể và sản xuất nông nghiệp cho khu vực. Thứ 4: Lựa chọn cây trồng vật nuôi thích nghi với điều kiện khô hạn và môi trường nước mặn, nước lợ. Thứ 5: Kiện toàn hệ thống đê và thành lập nhiều khu tứ giác trước hết cần nhân rộng mô hình thành công ở Tứ giác Long Xuyên và ngọt hoá Gò Công. Thứ 6: Xây dựng và hoàn thiện hệ thống công trình giữ nước ngọt trong đồng bằng đòi hỏi phải xây dựng và hoàn thiện một hệ thống công trình giữ nước ngọt cho toàn đồng bằng. Thứ 7: Xây dựng đập ngầm như đập Ba Lai, trên tất cả các cửa sông ở ĐBSCL có các hạn chế. Thứ 8: Xây dựng hệ thống đê biển, đê sông Đây là một dự án lâu dài, bền vững dọc theo biển Đông và biển Tây để ứng phó với mực nước biển dâng cao. Thứ 9: Quản lý tổng hợp tài nguyên nước khu vực ĐBSCL và lưu vực sông Mekong. 10 Đồ Án Tốt Nghiệp Từ những giải pháp trên đã ít nhiều đem lại hiệu quả ngăn chặn sự nhiễm mặn trong thời gian qua. Tuy nhiên, đa số điều bị động và phục thuộc vào nhiều về yếu tố tự nhiên và điều kiện từ các nước láng giềng như là tích trữ nước, chờ mưa rửa trôi độ mặn và chờ sự kết hợp điều tiết từ Biển Hồ của Campuchia, các đập thủy lợi trên sông Mekong và cả nguồn nước từ thượng nguồn từ Trung Quốc (BKHCN 2016). Nhờ tiến bộ công nghệ trong ngành khử mặn nước biển trong những thập kỷ qua đã đưa ra nhiều giải pháp cho vấn đề này và những nước phát triển mạnh hàng đầu như Israel, Singapo và Mỹ các phương pháp được ứng dụng cho khử mặn từ nước biển như: chưng cất nhanh nhiều tầng (MSF/multistage flash distillation), chưng cất nén hơi (VCD/vapor compression distillation), thẩm thấu ngược (RO/reverse osmosis), thẩm thấu tới (FO/forward osmosis), trao đổi ion (IC/Ion exchange) và điện thẩm tách (ED/electrodialysis) [19]. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm của mình, nhưng hiện nay phương pháp thẩm thấu ngược (RO) được sử dụng nhiều nhất, vì trang thiết bị dễ thực hiện và ít tiêu hao năng lượng nhất. Nhà máy khử mặn Sorek của Israel ở phía bắc Palmachim được dự đoán sẽ cung cấp tới khoảng 228 triệu m³/ năm, nhà máy Hadera (SWRO) là nhà máy khử muối lớn nhất trên thế giới. Chỉ riêng trong năm 2015, hơn 50% lượng nước cho các hộ gia đình, nông nghiệp và công nghiệp của Israel được sản xuất nhân tạo. Dự kiến trong tương lại không xa thì chương trình khử muối của Israel cung cấp khoảng 35% lượng nước uống của Israel và 70% vào năm 2050 [27]. Còn ở Singapore có kế hoạch để đáp ứng 30% nhu cầu nước trong tương lai vào năm 2060, còn hiện tại thì đáp ứng được 25% nhu cầu nước 2017 của Singapore theo thống kế. Các nhà máy như SingSpring, Tuas (2005) cung cấp 13.000m3/ngày, nhà máy Marina East (2020) 130.000 m3/ngày và Jurong (2020) 130.000 m3/ngày [26]. Tuy nhiên, đa số các phương pháp và ứng dụng trong việc sử lý nước mặn thành nước ngọt điều nhằm mục đích phục vụ cho sinh hoạt ăn uống của con người.Vì giá thành xử lý nước rất cao, đó cũng là một vấn đề khó khăn trong việc ứng dụng cho trồng trọt và nông nghiệp. Do vậy, những nghiên cứu về khả năng loại bỏ Na ra khỏi nước mặn từ các nhóm vi sinh vật rất cần được ưu tiên nhiều hơn cho các nghiên cứu hiện nay. Điều này đã mở 11