Tài liệu Sàng lọc các hợp chất có khả năng ức chế histon deacetylase 2 (hdac2) từ các thuốc và hợp chất giống thuốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC SÀNG LỌC CÁC HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE 2 (HDAC2) TỪ CÁC THUỐC VÀ HỢP CHẤT GIỐNG THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC SÀNG LỌC CÁC HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE 2 (HDAC2) TỪ CÁC THUỐC VÀ HỢP CHẤT GIỐNG THUỐC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ-DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 60720405 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Phạm Thế Hải 2. TS. Bùi Thanh Tùng HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Phạm Thế Hải – giảng viên bộ môn Hóa dược – trường Đại học Dược Hà Nội và TS.Bùi Thanh Tùng – giảng viên bộ môn Dược lý – khoa Y Dược Đại học quốc gia Hà Nội là những người thầy tận tình chỉ bảo, động viên, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS. Đỗ Thị Thảo- trưởng phòng Công nghệ sinh học, viện công nghệ sinh học - viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam tạo điều kiện và hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn thầy cô khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Dược lý, bộ môn Hóa dược – trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tôi trong quá tình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 29 tháng 03 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Ngọc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này thuộc đề tài nghiên cứu có tên: “Sàng lọc in silico, thiết kế phân tử và tổng hợp các hợp chất hóa học có tác dụng ức chế enzym histon deacetylase (HDAC). Mã số QG.16.24”. Kết quả đề tài này là thành quả cứu của tập thể mà tôi là một thành viên. Tôi đã được chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận văn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tác giả NGUYỄN THỊ NGỌC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 3 1. 1. Tổng quan histon deacetylase. ...................................................................... 3 1.1.1. Khái niệm histon deacetylase. ................................................................... 3 1.1.2. Phân loại các histon deacetylase. ................................................................ 4 1.1.3. HDAC2 và vai trò trong ung thư................................................................. 6 1.1.4. Các chất ức chế histon deacetylase. ........................................................... 8 1.2. Tổng quan mô hình in silico trong sàng lọc hợp chất ức chế HDAC. ......... 11 1.2.1. Mô hình tương quan định lượng tính chất – tác dụng (QSAR) ................ 11 1.2.2. Kỹ thuật protein docking ........................................................................... 17 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 19 2.1. Cơ sở dữ liệu hóa học dùng để sàng lọc hoạt tính. ...................................... 19 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu ........................................................ 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu. ............................................................................. 20 2.3.1. Phương pháp sàng lọc các hợp chất ức chế HDAC2 bằng mô hình in silico ............................................................................................................................. 20 2.3.2. Thử hoạt tính một số chất ức chế HDAC2 sàng lọc được bằng mô hình in vitro. ............................................................................................................... 23 2.3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC2................................................................. 23 2.3.2.2. Thử tác dụng ức chế HDAC trên dòng tế bào MCF-7. .......................... 28 2.3.2.3. Thử độc tính trên tế bào. ........................................................................ 31 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 34 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................ 35 3.1. Kết quả sàng lọc các hợp chất ức chế HDAC2 bằng mô hình in silico ....... 35 3.2. Kết quả thử hoạt tính một số chất ức chế HDAC2 sàng lọc được bằng mô hình in vitro. ........................................................................................................ 45 3.2.1. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC2 ....................................................... 45 3.2.2. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC trên dòng tế bào MCF-7. ................ 49 3.2.3. Kết quả thử độc tính tế bào. ...................................................................... 54 Chương 4: BÀN LUẬN ...................................................................................... 58 4.1. Về kết quả sàng lọc các hợp chất ức chế HDAC2 bằng mô hình in silico. . 58 4.1.1. Về quy trình sàng lọc in silico................................................................... 58 4.1.2. Về các hợp chất đã được lựa chọn để tiến hành thử invitro...................... 60 4.1.2.1. Về ibandronic acid ................................................................................. 60 4.1.2.2. Về 3-hydroxymyristic acid ..................................................................... 61 4.1.2.3. Về sulfasalazine...................................................................................... 63 4.2. Về kết quả thử hoạt tính một số chất ức chế HDAC2 sàng lọc được bằng mô hình in vitro. ........................................................................................................ 64 4.2.1. Về thử tác dụng ức chế HDAC2: .............................................................. 65 4.2.2. Về thử tác dụng ức chế HDAC trên dòng tế bào MCF-7. ........................ 66 4.2.3. Về thử độc tính tế bào: .............................................................................. 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng anh HDAC Enzyme histon deacetylase HDAC2 Tên tiếng việt Enzyme histon deacetylase 2 Chất ức chế histon UHDAC deacetylase Tế bào lympho T da CTCL Cutaneous T-cell lymphoma HAT Enzyme histon acetyltransferase PLZF Promyelocytic leukemia zinc finger AML Acute myeloid leukemia. Ung thư bạch cầu tủy cấp mới IC50 Inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử. Nhiễm sắc thể NST NSCLC Non-small-cell lung carcinoma Ung thư phổi không tế bào nhỏ MDS Myelodysplastic syndromes Hội chứng rối loạn sinh tủy. CLL Chronic lymphocytic leukemia Bệnh bạch cầu lympho mạn tính. DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic Acid SRB Sulforhodamine B PRB Retinoblastoma protein WHO World Health Organization Acid deoxyribonucleic Tổ chức y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1. Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng ............................ 9 Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu in silico dự đoán tác dụng ức chế HDAC2.11 Bảng 2.1: Thành phần bộ kit định lượng HDAC2. ............................................ 23 Bảng 2.2: Bảng tóm tắt hỗn hợp phản ứng thử tác dụng ức chế HDAC2 .......... 26 Bảng 3.1: Kết quả sàng lọc các chất ức chế HDAC2 bằng mô hình in silico. ... 35 Bảng 3.2: Kết quả tác dụng ức chế HDAC2 của chứng dương Trichostatin A theo nồng độ khác nhau....................................................................................... 45 Bảng 3.3. Kết quả tác dụng ức chế HDAC2 của 3 hợp chất lựa chọn ở nồng độ khác nhau ............................................................................................................. 46 Bảng 3.4. Kết quả tác dụng ức chế HDAC trên dòng MCF-7 của chất dương Trichostatin A theo nồng độ khác nhau. ............................................................. 50 Bảng 3.5. Kết quả tác dụng ức chế HDAC trên dòng MCF-7 của 3 hợp chất lựa chọn ở nồng độ khác nhau................................................................................... 51 Bảng 3.6. Kết quả độc tính trên 3 dòng tế bào ung thư của chứng dương ellipticine ở nồng độ khác nhau. ......................................................................... 54 Bảng 3.7. Kết quả độc tính tế bào của 3 chất trên 3 dòng tế bào ở nồng độ khác nhau ..................................................................................................................... 55 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động phiên mã. ......................... 3 Hình 1.2. Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV. ................... 5 Hình 2.1. Tóm tắt quy trình sàng lọc in silico chất ức chế HDAC2 từ các thuốc và hợp chất giống thuốc. ..................................................................................... 21 Hình 2.2: Nguyên tắc của phương pháp đo huỳnh quang trong thử hoạt tính chất ức chế HDAC2 .................................................................................................... 24 Hình 2.3: Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm thử tác dụng ức chế HDAC2 in vitro ............................................................................................................................. 27 Hình 2.4.Tóm tắt các bước thử tác dụng ức chế HDAC trên dòng tế bào MCF-7. ............................................................................................................................. 30 Hình 2.5. Tóm tắt các bước thử độc tính tế bào in vitro .................................... 33 Hình 3.1. Đồ thị sigmoid biểu diễn khả năng ức chế enzym HDAC2 của Trichostatin A theo nồng độ ................................................................................ 46 Hình 3.2. Đồ thị sigmoid biểu diễn khả năng ức chế enzym HDAC2 của acid ibandronic theo nồng độ. ..................................................................................... 48 Hình 3.3: Đồ thị sigmoid biểu diễn khả năng ức chế enzym HDAC2 của acid 3hydroxymyristic theo nồng độ. .......................................................................... 48 Hình 3.4. Đồ thị sigmoid biểu diễn khả năng ức chế enzym HDAC2 của sulfasalazin theo nồng độ. ................................................................................... 49 Hình 3.5. Đồ thị sigmoid biểu diễn khả năng ức chế enzym HDAC trên dòng MCF-7 của Trichostatin A theo nồng độ. ........................................................... 50 Hình 3.6. Đồ thị sigmoid biểu diễn khả năng ức chế enzym HDAC trên dòng MCF-7 của acid ibandronic theo nồng độ. .......................................................... 52 Hình 3.7. Đồ thị sigmoid biểu diễn khả năng ức chế enzym HDAC trên dòng MCF-7 của acid 3-hydroxymyristic theo nồng độ. ............................................. 53 Hình 3.8. Đồ thị sigmoid biểu diễn khả năng ức chế enzym HDAC trên dòng MCF-7 của sulfasalazin theo nồng độ................................................................. 53 Hình 3.9: Đồ thị sigmoid biểu diễn độc tính của ellipticine theo nồng độ. ...... 55 Hình 4.1. Cấu dạng của acid ibandronic trong trung tâm hoạt động của HDAC2.. .............................................................................................................. 61 Hình 4.2. Cấu dạng của acid 3-hydroxymyristic trong trung tâm hoạt động của HDAC2. ............................................................................................................... 63 Hình 4.3. Cấu dạng của sulfasalazin trong trung tâm hoạt động của HDAC2.. 64 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đang có xu hướng gia tăng nhanh và là nguyên nhân dẫn tới tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) trong năm 2012 trên thế giới có khoảng 8,2 triệu người tử vong do ung thư và 32,6 triệu người phải sống chung với nó [21]. So với thế giới thì Việt Nam thuộc nhóm nước có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với nhiều loại ung thư, ước tính Việt Nam có khoảng 150.000 -200.000 người mắc bệnh ung thư mới và khoảng 75.000 - 100.000 người tử vong vì căn bệnh này,với xu hướng ngày càng gia tăng [2]. Trước tình hình đó, việc nghiên cứu và phát triển các thuốc mới hiệu quả trong điều trị ung thư luôn là mối quan tâm hàng đầu của ngành công nghiệp dược phẩm thế giới và Việt Nam. Tuy nhiên, quá trình nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư hiện nay vẫn chủ yếu dựa trên các phương pháp kinh điển hay phương pháp “thử và lỗi” với nhược điểm là tốn kém thời gian cũng như chi phí cao [24]. Ngoài ra, các thuốc điều trị ung thư hiện đang gặp rất nhiều vấn đề liên quan đến độc tính và tỷ lệ kháng thuốc cao. Do đó yêu cầu cấp bách đặt ra là phải nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thư mới, có tác dụng chọn lọc trên đích phân tử nhằm phát huy tối đa hiệu quả, lâu bị kháng và ít độc hơn. Histon deacetylase (HDAC) là một trong những đích phân tử được chú ý hiện nay, enzym này xúc tác cho quá trình deacetyl hoá nhóm -N acetyl lysine amino acid ở phần đuôi của histon. Trong nhiều tế bào ung thư có sự huy động quá mức các enzym HDAC, gây nên hiện tượng giảm sự acetyl hoá của histon. Các chất ức chế HDAC có thể ngăn chặn quá trình này thông qua việc làm thay đổi biểu hiện gen gây ung thư hay các gen ức chế khối u do gây cường acetyl hóa các protein histone [47]. Hiện nay đã biết đến 18 loại HDAC khác nhau, chia thành 4 nhóm, trong đó HDAC2 thuộc HDAC nhóm I được đánh giá là một 1 đích phân tử quan trọng do có vai trò trong quá trình deacetyl hoá của các histon H3K56 và H4K16 xảy ra trong hầu hết các dòng tế bào ung thư người [7], [10]. Quá trình nghiên cứu tìm kiếm chất ức chế HDAC nhằm phát triển thành thuốc chống ung thư đã kéo dài hơn một thập kỷ [64]. Trong những năm gần đây, nghiên cứu sàng lọc hợp chất ức chế HDAC dựa trên các phương pháp trợ giúp bởi máy tính, hay còn gọi là phương pháp in silico đã trở thành một hướng đi mới, đầy tiềm năng và đang được triển khai tại nhiều trung tâm nghiên cứu, trường đại học và công ty dược phẩm hàng đầu trên thế giới [9]. Hiện nay, các mô hình in silico được ứng dụng chủ yếu trong dự đoán hoạt tính và cơ chế tác dụng, trong sàng lọc (virtual screening) các hợp chất ức chế HDAC từ các cơ sở dữ liệu hợp chất tự nhiên và tổng hợp. Các phương pháp in silico nhìn chung nhanh, có tính kinh tế và hỗ trợ rất tốt cho các nghiên cứu thực nghiệm, giúp năng cao tỷ lệ thành công của nghiên cứu. Qua khảo sát tình hình sàng lọc hợp chất ức chế HDAC2 sử dụng mô hình in silico trên thế giới và trong nước, chúng tôi nhận thấy nhóm các thuốc và hợp chất giống thuốc hiện đang lưu hành chưa được khai thác nhiều trong khi đây là một đề tài thú vị, có triển vọng lớn do các hợp chất này đã được đánh giá dược động học và độc tính, một yêu cầu không thể thiếu trong nghiên cứu thuốc mới. Theo hướng này, nhằm tìm kiếm các chất ức chế HDAC mới với tiềm năng thành thuốc kháng ung thư, chúng tôi tiến hành đề tài “Sàng lọc hợp chất có khả năng ức chế enzym Histon Deacetylase 2 từ các thuốc và hợp chất giống thuốc” với 2 mục tiêu sau: 1. Sàng lọc các chất ức chế histon deacetylase 2 (HDAC2) bằng mô hình in silico. 2. Đánh giá hoạt tính một số chất ức chế histon deacetylase 2 (HDAC2) sàng lọc được bằng mô hình in vitro: thử tác dụng ức chế HDAC2, thử tác dụng ức chế HDAC trên dòng MCF-7, thử độc tính tế bào. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. 1. Tổng quan histon deacetylase. 1.1.1. Khái niệm histon deacetylase. Nhiễm sắc thể là phức hợp gồm 3 thành phần: ADN, protein histon và protein không phải histon [22]. Đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể là nucleosom. Mỗi nucleosom gồm 146 cặp base ADN được gói trong một protein histon octame [14] tạo bởi 4 thành phần: H2A, H2B, H3, H4 [13]. Các đầu amino của protein histon thường bị biến đổi bởi các quá trình methyl hóa, phosphoryl hóa hoặc acetyl hóa sau dịch mã. Quá trình acetyl hoá là một trong những cơ chế điều hoà chính của biểu thị gen. Kiểm soát quá trình biểu thị gen này phụ thuộc vào sự cân bằng giữa hoạt động của enzym histon acetylase và enzym histon deacetylase, nhờ vào sự điều hoà quá trình acetyl hoá lysin ở phần đuôi histon [6]. Hình 1.1: Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động phiên mã. (a) Sự methyl hóa và deacetyl hóa histon dẫn tới hình dạng đóng xoắn nhiễm sắc thể và ức chế phiên mã. (b) Sự acetyl hóa và demethyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể và cho phép phiên mã. 3 Histon acetyltrasferase (HAT) là enzym acetyl hóa nhóm -NH2 trong gốc lysin (đầu N tận) của histon, làm trung hòa điện tích dương trên lysin, do đó giảm khả năng tương tác của histon với ADN (tích điện âm) tạo cấu trúc mở chromatin. Vì vậy, sự acetyl hóa histon tạo điều kiện cho quá trình phiên mã, dịch mã xảy ra (hình 1.1b) [22] [6]. Histon deacetylase (HDAC) là một họ enzym được tìm thấy trong nhiều loại vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật. Có tác dụng đối lập với HAT, nghĩa là HDAC loại bỏ nhóm acetyl từ acetyl lysin (Ac-Lys) ở đầu N tận của histon, làm đóng xoắn chromatin, do đó ức chế quá trình phiên mã (hình 1.1a) [22] [6]. 1.1.2. Phân loại các histon deacetylase. Hiện nay người ta đã biết đến 18 loại HDAC khác nhau, được chia thành 4 nhóm: I, II, III, IV. HDAC nhóm I, II và IV được gọi là các HDAC “kinh điển” và thường được sử dụng để sàng lọc và thiết kế các chất ức chế HDAC mới [65]. Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8. Các enzym này được tìm thấy trong nhân tế bào, là những HDAC nhiều nhất, có mặt ở khắp mọi nơi và thường có vai trò trong sự phân đôi, sự sống sót của tế bào. Đích cơ bản của HDAC nhóm I là các histon. Nhóm II gồm nhóm IIa và nhóm IIb. Trong đó nhóm IIa có HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, nhóm IIb có HDAC6, HDAC10. Các enzym được tìm thấy cả trong nhân và tế bào chất. Nhóm III ( còn được gọi là sirtuin –SIRT) gồm SIRT 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 có cấu trúc tương đồng với protein Sir2 của nấm men. Chúng có ở ty thể và nhân, tế bào chất. HDAC nhóm III điều hòa quá trình biểu hiện gen trong đáp ứng với những biến đổi trạng thái oxy hóa khử của tế bào . Nhóm IV: HDAC11, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào. Các enzym nhóm I, II và IV phụ thuộc vào Zn 2+. Nhóm III là các enzym có cấu trúc phụ thuộc NAD+ [11], [65]. 4 Trung tâm hoạt động HDAC gồm 2 phần chính (hình 1.2): ion Zn2+ là coenzyme của HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống. Cấu trúc rất linh động, có thể biến đổi phù hợp với chiều dài cơ chất khác nhau. Trên miệng túi có một vành nhỏ được tạo nên từ một vài vòng xoắn protein, phần vành này sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt HDAC [57]. Khi nghiên cứu về hoạt tính của HDAC trên các HDAC kinh điển các nhà khoa học nhận thấy hoạt tính của HDAC phụ thuộc vào khả năng tạo phức với ion Zn2+ ở phần đáy kênh của các chất này. Do HDAC được bảo vệ trong túi enzyme, hầu hết các HDAC đều không thể ức chế chọn lọc riêng một HDAC, chúng có thể ức chế các HDAC thành viên [61]. Hình 1.2. Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV. HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein không histon cũng bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các HDAC. Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II và IV [26], [61]. 5 1.1.3. HDAC2 và vai trò trong ung thƣ. Sự acetyl hóa và deacetyl hóa NST đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen. Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn đến những bất thường biểu hiện gen và do đó dẫn đến ung thư. Histon deacetylase2 (HDAC2) thuộc HDAC nhóm I. HDAC2 hoạt động như một chất ức chế phiên mã thông qua loại bỏ nhóm lysine ở đầu N của protein histon (H2A, H2B, H3 và H4). Tuy nhiên HDAC2 không liên kết với ADN nên chúng sẽ được chọn lọc bởi các yếu tố phiên mã như YY1, SP1/SP3, gen ức chế khối u p53 và BRCA1. HDAC2 cũng có thể được gắn vào ADN như là một phần của phức hợp CoREST, mSin3 và NuRD. Những phức hợp là mục tiêu với các trình tự gen đặc hiệu bằng các tương tác với các yếu tố phiên mã trình tự đặc hiệu. Ví dụ, các HDAC2/HDAC1 chứa phức hợp Sin3-SAP chọn lọc họ E2F của các yếu tố phiên mã để ức chế phiên mã [16]. Phức hợp chứa HDAC2 cũng liên quan đến gen điều chỉnh phiên mã qua thụ thể trung gian. Những phức hợp chứa gen biến đổi biểu sinh khác, chẳng hạn như MeCp2 - là một protein có nhóm liên kết methyl. Các enzym vận chuyển nhóm methyl DNA DNMT1, DNMT3A và DNMT3B. HDAC2 cũng quy định biểu hiện gen thông qua sự deacetyl của yếu tố phiên mã cụ thể bao gồm STAT3 và SMAD7 [38]. HDAC2 là một chìa khóa quan trọng của gen điều hòa chu kỳ tế bào, quá trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào kể cả sự xâm lấn, sự di chuyển và tạo mạch. Cùng với HDAC1, HDAC2 quy định việc phiên mã của các gen liên quan đến quá trình tạo máu, biệt hóa tế bào biểu mô, phát triển tim và tế bào thần kinh [49]. Các đột biến có thể có ở HDAC2 xuất hiện ở tế bào soma. HDAC2 bị đột biến trong các khối u lẻ tẻ và trong các khối u phát sinh ở người có ung thư biểu mô đại trực tràng không polyp di truyền. Đột biến này do sự cắt bỏ 9 adenin ở exon1 tạo thành protein không hoạt động. Sự biểu hiện các dạng đột 6 biến của HDAC2 gây ra sự kháng với tác dụng của các chất ức chế HDAC. Việc thiếu các biểu hiện và chức năng HDAC2 tạo nên sự tăng điều chỉnh gen thúc đẩy tăng trưởng khối u [4], [32]. HDAC2 liên quan đến nhiều bệnh ung thư khác nhau. Việc điều hòa về biểu hiện hoạt động HDAC2 có liên quan đến sự phát triển ung thư. HDAC2 biểu hiện quá mức trong các loại ung thư khác nhau bao gồm cả đại tràng, dạ dày, cổ tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi không tế bào nhỏ và ung thư biểu mô tế bào gan. HDAC2 biểu hiên quá mức liên quan đến ung thư một phần thông qua việc chọn lọc sai lầm của nó và sự im lặng của các gen ức chế khối u. Sự ức chế của gen p21WAF1 ức chế khối u ở vùng khởi động và có thể được đảo ngược bởi việc điều trị bằng thuốc ức chế HDAC [46]. Biểu hiện HDAC2 tương quan với tiên lượng xấu khi bệnh ở giai đoạn tiên triển trong ung thư đại trực tràng, tuyến tiền liệt, dạ dày và biểu mô tế bào gan. Ung thư đại tràng: Có một số nghiên cứu cho thấy HDAC2 biểu hiện quá mức trong ung thư đại tràng. Sự gia tăng các biểu hiện HDAC2 đã được tìm thấy ở mức độ protein và mRNA chỉ ra rằng HDAC2 quá mức là do hoạt hóa phiên mã. Các nghiên cứu cho thấy trong loại khối u này sự phiên mã HDAC2 được điều chỉnh bởi tín hiệu beta-catenin-TCF-myc đã bị xóa bỏ trong bệnh ung thư đại tràng. HDAC2 biểu hiện quá mức tương quan với tiên lượng xấu và bệnh ở giai đoạn tiến triển trong ung thư đại trực tràng. Tuy nhiên, Ropero và các cộng sự tìm thấy một sự đột biến bất hoạt của HDAC2 trong ung thư đại tràng với bất ổn định chuỗi ADN tế bào [microsatellites (MI)] [41]. Ung thư vú: Các nghiên cứu khác nhau cho thấy vai trò quan trọng của HDAC2 trong ung thư vú. HDAC2 gây lão hóa trong tế bào ung thư vú. Hơn nữa sự mất hoạt tính của HDAC2 kéo theo quá trình chết tế bào (apoptosis) [38]. 7 Bệnh ung thư tuyến tiền liệt: Theo nghiên cứu của Weichert và các cộng sự thấy rằng HDAC2 được biểu hiện mạnh mẽ trong hơn 70% các trường hợp phân tích ung thư tuyến tiền liệt. Sự gia tăng trong biểu hiện HDAC2 có liên quan với tăng cường tăng sinh tế bào khối u [4]. Ung thư biểu mô tế bào gan: HDAC2 quy định chu kỳ tế bào và sự phân chia của HDAC2 gây ra ngừng chuyển pha G1/S trong chu kỳ tế bào. Trong quá trình chuyển đổi G1/S,sự phân chia đích của HDAC2 có tính chọn lọc gây ra các biểu hiện của p16 (INK4a) và p21 (WAF1/Cip1), và đồng thời ức chế sự biểu hiện của cyclin D1, CDK4 và CDK2. Do đó, sự ức chế HDAC2 dẫn đến sự giảm điều chỉnh của gen đích E2F/DP1 thông qua việc giảm sự phosphoryl hóa protein PRB (retinoblastoma protein) [4]. Ung thư phổi: HDAC2 được điều chỉnh lên cao trong ung thư phổi. HDAC2 bất hoạt dẫn đến thoái hoá tăng trưởng tế bào khối u và kích hoạt các quá trình chết tế bào (apoptosis) qua p53, và ức chế protein thuộc họ Bcl-2. Trong điều chỉnh chu kỳ tế bào, HDAC2 bất hoạt gây ra cảm ứng biểu hiện p21WAF1/Cip1, đồng thời ức chế sự biểu hiện của cyclin E2, cyclin D1, và CDK2, tương ứng. Do đó, điều này dẫn đến việc giảm quá trình phosphoryl hóa của protein PRB trong chuyển pha G1/S và do đó bất hoạt phiên mã gen đích E2F/DP1 của các tế bào A549. HDAC2 trực tiếp điều chỉnh biểu hiện p21WAF/Cip1 không phụ thuộc p53 [4]. Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD): giảm hoạt động và biểu hiện HDAC2 được tìm thấy trong bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD). Việc giảm hoạt động của HDAC2 làm tăng điều hòa các gen liên quan đến phản ứng viêm và kháng corticosteroid trong COPD [4]. 1.1.4. Các chất ức chế histon deacetylase. Yoshida và cộng sự (1990), đã phát hiện ra dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên có tác dụng ức chế trực tiếp HDAC là Trichostatin A (TSA), vốn là chất có tác dụng chống nấm [62]. Sau đó, dựa trên hiểu biết về mối liên quan giữa HDAC và ung thư đồng thời xác định được cấu trúc 3D của các HDAC, 8 một số chất ức chế HDAC đã được nghiên cứu và thử nghiệm trên lâm sàng để ứng dụng trong điều trị ung thư. Cho đến nay, nhiều chất ức chế HDAC (UHDAC) đã được công bố. Chúng có thể có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp. Dựa vào những cấu trúc hóa học, HDAC được chia thành 5 nhóm: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton. Trong các nhóm chất ức chế HDAC, các acid hydroxamic là nhóm chất được quan tâm chú ý và tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Do các acid hydroxamic có cấu trúc đơn giản, dễ tổng hợp và có nhóm -NHOH tạo được phức bền với Zn2+ ở trung tâm hoạt động của HDAC mang lại có hoạt tính ức chế enzym mạnh. Hiện nay, FDA đã phê duyệt một acid hydroxamic UHDAC điển hình là vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid, Zolinza) vào năm 2006 sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào [cutaneous T-cell lymphoma (CTCL)]. Một hợp chất UHDA khác là depsipeptide (romidepsin, Istodax) cũng được FDA cấp phép lưu hành vào năm 2009 để điều trị CTCL và điều trị ung thư hạch tế bào T ngoại vi [peripheral T-cell lymphoma (PTCL)]. Đây chính là nguồn động lực để các nhà nghiên cứu tiếp tục tìm kiếm các chất ức chế HDAC mới. Nhiều chất ức chế enzym HDAC khác cũng đang được thử nghiệm lâm sàng nhằm phát triển liệu pháp điều trị ung thư dựa trên đích này, bao gồm nhóm hydroxamat, benzamid, acid carboxylic, acid carboxylic (bảng 1.1) [3], [43]. Bảng 1.1. Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng Nhóm Hợp chất Pha Loại ung thƣ Acid carboxylic Butyrat I, II Ung thư đại tràng AN-9 (tiền thuốc) I, II Thể rắn, NSCLC Acid valproic Thể rắn, ung thư máu, I, II AML, MDS, CTCL, u 9 Phenyl butyrat I trung biểu mô Thể rắn, AML/MDS CTCL Thể rắn, ung thư máu PXD101 II Ung thư máu NVP-LAQ824 I Thể rắn, ung thư máu LBH-589 II, III Thể rắn, AML, MDS ITF-2357 II U lympho Hodgkin SB-939 I Thể rắn, ung thư máu CRA 024781 I JNJ-16241199 Các benzamid Đã c/m I, II Acid hydroxamic I SNDX-275 I, II SAHA Thể rắn, u lympho, AML, u hắc sắc tố ác tính di căn (MS-275) tiến triển CI-994 I, II Thể rắn, NSCLC, tế bào thận, tuỵ MGCD-0103 II Thể rắn, ung thư bạch cầu, MDS Peptid vòng Depsipeptid I, II Thể rắn, CLL, AML, CTCL, u đa tuỷ xương, (FK228) NHL tế bào T ngoại vi, RAI kháng thyroid, ung thư đại tràng tiến triển Tuy nhiên, mỗi nhóm nêu trên đều có những hạn chế nhất định như: các acid hydroxamic bị chuyển hoá nhanh, ức chế không chọn lọc lên các loại enzym HDAC; các benzamid và acid béo có hiệu lực kém; dẫn chất ceton dễ bị khử hóa trong huyết tương. Trong khi các peptid vòng có cấu trúc phức tạp, khó tạo thành về mặt hoá học và FK-228 có phần gắn kết với ion Zn2+ có chứa thiol không mong muốn [35]. 10