Tài liệu Sản xuất và thu nhận

  • Số trang: 21 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 255 |
  • Lượt tải: 1
tranvantruong

Đã đăng 3224 tài liệu

Mô tả:

SẢN XUẤT VÀ THU NHẬN
Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng      Trường ĐH Nông Lâm tp Hồ Chí Minh Bộ môn Công Nghệ Sinh Học -----o0o----- CHỦ ĐỀ SEMINAR: SẢN XUẤT VÀ THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VŨ BẢO MSSV:06126009 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 Page 1    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    .......................................................................................................................... B/ ĐẶT VẤN ĐỀ: Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội nói chung và của nền y học nói riêng đã đem lại nhiều phương pháp mới trong việc phòng ngừa, phát hiện và chữa trị bệnh cả trên người lẫn trên thú. Có rất nhiều phương pháp mới được nghiên cứu, thử nghiệm và đã đem lại nhiều ứng dụng to lớn. Một trong những phương pháp mới xuất hiện trong thời gian gần đây là sử dụng kháng thể đơn dòng trong việc chuẩn đoán và điều trị bệnh. Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies-mAb) được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh học cơ bản, trong chẩn đoán bệnh, và trong điều trị các bệnh như bệnh nhiễm trùng và ung thư. Kháng thể đơn dòng là công cụ quan trọng được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng nhiều trong các nghiên cứu của họ và đã mang lại nhiều tiến bộ về mặt y tế. Với vai trò quan trọng như trên và tiềm năng vô cùng to lớn trong việc chuẩn đoán, điều trị bệnh. Kháng thể đơn dòng cần phải được nghiên cứu nhiều hơn, sâu hơn để có thể khai thác hết những lợi ích mà nó đem lại. Tuy nhiên, việc hiểu về kháng thể đơn dòng vẫn còn nhiều hạn chế vì đây là một trong những lĩnh vực còn khá mới mẻ đặc biệt là đối với nước ta. Trong bài viết này, tôi hy vọng sẽ mang lại cho các bạn một vài thông tin cơ bản về kháng thể đơn dòng, mà cụ thể là về sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng. Thông qua bài viết này, tôi hy vọng sẽ đem lại cho các bạn cái nhìn cơ bản nhất, tổng quát nhất về kháng thể đơn dòng. Hy vọng rằng bài viết này sẽ là cơ sở, là tiền đề để từ đó thuận lợi hơn trong những bước đi tiếp trong việc tìm hiểu, nghiên cứu về kháng thể đơn dòng của các bạn sau này. Page 2    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    C/TỔNG QUAN: C.I/Khái quát về kháng thể đơn dòng: C.I.1/Kháng thể (antibody) : Kháng thể là những phân tử protein được sản xuất bởi những những tế bào lympho B khi có sự kích ứng đáp ứng miễn dịch bởi kháng nguyên trên cơ thể vật chủ . Có hai loại kháng thể : - Kháng thể đa dòng: Tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước . Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên :đáp ứng như vậy gọi là đa dòng.  - Kháng thể đơn dòng : chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn . Tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào.  Các kháng thể có tính kết hợp đặc hiệu với các kháng nguyên đã kích ứng tạo ra chúng . Đây chính là cơ sở của các phản ứng bảo vệ của cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh và của các kỹ thuật chuẩn đoán miễn dịch . Sự tạo thành kháng thể phụ thuộc vào bản chất của kháng nguyên (protein, polysaccharide, … ), phương pháp gây miễn dịch (chất bổ trợ, đường xâm nhập, số lần xâm nhập,… ) và phụ thuộc vào cơ thể vật chủ (tình trạng sức khỏe, tình trạng miễn dịch, dinh dưỡng, tuổi,… ) Các tế bào lympho B là các tế bào sản xuất kháng thể . Mỗi dòng tế bào lympho B chỉ có thể sản xuất một loại kháng thể tương ứng với yếu tố kháng Page 3    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    nguyên mà chúng nhận diện được . Do mỗi kháng nguyên có nhiều yếu tố kháng nguyên khác nhau nên đáp ứng miễn dịch sẽ tạo thành nhiều loại kháng thể khác nhau, trong trường hợp này ta có kháng thể đa dòng (polyclonal antibody) C.I.2/Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – mAb ) là kháng thể được tạo thành từ những tế bào lympho B có nguồn gốc từ một dòng tế bào lympho B. Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh học cơ bản, trong chẩn đoán bệnh, và trong điều trị các bệnh như bệnh nhiễm trùng và ung thư. Sản xuất mAb yêu cầu phải tiến hành gây kích ứng miễn dịch cho thú, thường là một con chuột, sau đó thu nhận các tế bào sản xuất kháng thể từ lách của nó và dung hợp các tế bào này với tế bào ung thư (như từ các tế bào u tủy myeloma ) để làm cho chúng trở nên bất tử giống như đặc điểm của các tế bào u tủy, điều này có nghĩa là chúng sẽ phát triển và phân chia vô hạn định. Một khối các tế bào hợp nhất được gọi là khối tế bào lai (hybridoma), và các tế bào này sản xuất ra mAb. Sự phát triển của hybridoma bất tử đòi hỏi việc sử dụng động vật. Việc thay thế không dùng động vật không được phổ biến. Một nhà nghiên cứu, người muốn nghiên cứu một protein đặc biệt hoặc những phân tử khác, đã chọn một dòng tế bào hybridoma để sản xuất mAb mà phản ứng một cách mạnh mẽ với protein hoặc phân tử đó. Các tế bào phải phát triển và nhân lên để tạo thành một dòng tế bào mà sẽ sản xuất ra mAb mong muốn . Có hai phương pháp để phát triển các tế bào này: tiêm chúng vào khoang màng bụng của một con chuột hoặc dùng trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro. Khi tiêm vào một con chuột, các tế bào hybridoma sẽ nhân lên và sản xuất ra dịch lỏng (bệnh cổ trướng) ở bụng của nó. Dịch lỏng này có chứa một nồng độ cao kháng thể. Sản xuất kháng thể bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột thì rẻ tiền, dễ thực hiện, và quen thuộc . Tuy nhiên, nếu tích tụ quá nhiều dịch lỏng hoặc nếu hybridoma là một bệnh ung thư độc, chuột sẽ trải qua đau đớn hoặc nguy hiểm. Nếu một quy trình sản xuất gây đau đớn hoặc nguy hiểm với động vật, thì nên điều chỉnh để tìm kiếm các lựa chọn thay thế. Một trong những giải pháp thay thế là gia tăng số lượng những tế bào hybridoma trong môi trường nuôi cấy tế bào. Kĩ thuật này yêu cầu một số kiến thức chuyên môn, những phương tiện, thiết bị đặc biệt, có thể tốn kém về mặt tiền bạc và mất nhiều thời gian . Hiện Page 4    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    đã có một số nghiên cứu đáng kể trong kĩ thuật nuôi cấy tế bào in vitro cho sự phát triển hybridoma, và những phương pháp mới hơn này ít tốn kém hơn, nhanh hơn, và sản xuất kháng thể ở một nồng độ cao hơn so với những phương pháp trước đây. C.II/ Quá trình sản xuất kháng thể đơn dòng: Quy trình sản xuất kháng thể được tóm tắt ở sơ đồ bên dưới : C.II.1/ Sự hình thành tế bào lai hybridoma: ( Dòng tế bào bất tử sản xuất kháng thể đơn dòng ) Sự sản xuất kháng thể đơn dòng bao gồm: phương pháp in vivo, in vitro hoặc kết hợp cả hai phương pháp . Trước khi sản xuất kháng thể bằng phương pháp in vivo hoặc in vitro, những tế bào lai mà sẽ làm nhiệm vụ sản xuất kháng thể được tạo ra Các bước sản xuất những tế bào lai này được mô tả ở sơ đồ bên dưới . Sản xuất kháng thể đơn dòng-những tế bào sản xuất được sử dụng đối với động vật, thường sử dụng chuột. Phương pháp này cung cấp một dòng tế bào có khả năng sản xuất một loại kháng thể trong một giai đoạn dài. Một khối u từ dòng tế bào”bất tử” thì được gọi là một hybridoma Không có phương pháp sản xuất tế bào lai hybridima nào mà không sử dụng động vật. Gần đây, kỹ thuật in vitro cho phép sản xuất những phần kháng thể gắn Page 5    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    kháng nguyên bên trong tế bào, nhưng kỹ thuật này vẫn đang được thử nghiệm và kết quả, và chức năng chưa chắc chắn (Frenken và cộng sự 1998). Nó cũng có thể thay đổi nhiều về mặt di truyền của kháng thể đơn dòng chuột sản xuất với trình tự gen người, giảm tính sinh miễn dịch của kháng thể đơn dòng đã định trước cho việc điều trị bệnh trên người. Trước khi đến phương pháp hybridoma, các nhà nghiên cứu chỉ có thể sản xuất huyết thanh kháng thể đa dòng. Một số lương lớn những nhu cầu về động vật được chủng ngừa và không làm bất tử tế bào sản xuất kháng thể, vì vậy nó yêu cầu phải lặp đi lặp lại trên động vật dùng để thu được nhiều kháng thể hơn. Phát triển kỹ thuật tế bào lai hybridoma làm giảm một số lượng lớn động vật (chuột, thỏ, …) cần thiết để sản suất kháng thể. Bước 1: gây miễn dịch trên chuột và lựa chọn những con chuột hiến để sản xuất tế bào lai hybridoma Chuột được gây miễn dịch với một kháng nguyên đã được chuẩn bị cho việc tiêm hoặc nhũ hóa kháng nguyên với tá chất Freund hoặc những tá chất khác hoặc bằng một miếng mỏng dạng gel đồng nhất có chứa kháng nguyên. Những tế bào nguyên vẹn, bao gồm cả màng và những vi sinh vật thì thường được dùng như là những kháng nguyên. Ở hầu hết tất cả các phòng thí nghiệm, chuột được sử dụng để sản xuất kháng thể mong muốn. Thường thì, chuột được gây miễn dịch 2-3 tuần một lần nhưng phương pháp gây miễn dịch biến đổi giữa các nhà nghiên cứu. Khi hàm lượng kháng thể tạo ra đủ lớn. Chuột đã có đáp ứng miễn dịch mạnh sẽ được gây mê và thu lấy lách để chọn lọc dòng tế bào lympho chuyên biệt dùng cho việc lai với tế bào ung thư myeloma. Bước 2: sự lựa chọn chuột để sản xuất kháng thể Sau một vài tuần gây miễn dịch, mẫu máu thu được từ chuột để đo lượng kháng thể huyết thanh. Một vài kỹ thuật nhân đạo được phát triển để thu tập một thể tích nhỏ máu từ chuột (Loeb and Quimby 1999). Độ chuẩn của kháng thể huyết thanh được xác định bởi nhiều kỹ thuật khác nhau, như enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) và phép chẩn đoán số lượng DNA trong tế bào( flow cytometry). Nếu độ chuẩn của kháng thể cao, sự hợp nhất có thể được thực hiện. Nếu độ chuẩn của kháng thể thấp, chuột có thể tăng lên cho tới khi phản ứng đủ là được, vì vậy việc xác định mẫu máu được lặp đi lặp lại nhiều lần. Khi độ chuẩn của kháng thể đủ cao, chuột thường tăng bằng cách tiêm kháng nguyên không có tá dược trong màng bụng hoặc trong tĩnh mạch (theo tĩnh mạch đuôi) 3 ngày trước khi hợp nhất nhưng 2 tuần sau lần gây miễn dịch đầu tiên. Sau đó, chuột bị giết và lách của chúng được lấy ra để sản xuất tế bào lai hybridoma bằng phương pháp in vitro. Bước 3: Chuẩn bị tế bào ung thư tủy xương Myeloma Sự dung hợp những tế bào lách sản xuất kháng thể, mà có thời gian tồn tại giới hạn, với những tế bào ung thư tủy bất tử (myeloma), kết quả là trong tế bào lai hybridoma có khả năng phát trển không giới han Page 6    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    Tế bào ung thư tủy xương myeloma là những tế bào bất tử mà được nuôi cấy với 8azaguanine để đảm bảo tính nhạy cảm của chúng với hypoxanthine-aminopterinthymidine (HAT) môi trường chọn lọc được dùng sau khi dung hợp tế bào Một tuần trước khi dung hợp tế bào, những tế bào ung thư tủy xương myeloma được cho phát triển trong 8-azaguanine. Các tế bào phải có khả năng sống cao và phát triển nhanh chóng. Môi trường HAT chỉ cho phép những tế dung hợp tồn tại trong một thời gian dài trong môi trường nuôi cấy. Bước 4: Sự hợp nhất giữa tế bào ung thư tủy xương myeloma với tế bào lách của chuột đã được gây miễn dịch: những tế bào lách đơn từ chuột đã gây miễn dịch được hợp nhất với các tế bào ung thư tủy xương myeloma đã được chuẩn bị trước đây. Sự dung hợp được hoàn thành bởi polyethylene glycol, là chất có khả năng làm tan màng tế bào, tạo điều kiện cho tế bào lympho sản xuất kháng thể với tế bào myolema có thể kết hợp lại với nhau và tạo thành tế bào lai hybridoma bất tử. Một chú ý trong bước thứ 3 này là chỉ có những tế bào dung hợp mới phát triển được trong môi trường chọn lọc đặc biệt. Những tế bào này sau đó được phân phối tới đĩa có 96 giếng chứa đựng những tế bào tiếp liệu thu được từ việc rửa màng bụng chuột trong nước muối . Tế bào tiếp liệu được tin rằng để cung cấp các yếu tố phát triển để đẩy mạnh sự phát triển của tế bào lai hybridoma (Quinlan and Kennedy 1994). Việc chuẩn bị thương mại là kết quả từ việc thu gom môi trường giúp cho phát triển trong nuôi cấy tế bào và chứa đựng các yếu tố phát triển có sẵn để có thể sử dụng thay cho các tế bào tiếp liệu thu được từ chuột. Nó cũng có thể được sử dụng cho đại thực bào xuất phát từ tủy xương chuột như những tế bào tiếp liệu (Hoffman and others 1996). Bước 5: Tạo dòng dòng tế bào lai hybridoma bằng “pha loãng có giới hạn” hoặc phát triển và ổn định dòng bằng sản xuất dịch tràn ổ bụng. Điểm mới ở bước này, một nhóm nhỏ các tế bào lai hybridoma từ đĩa 96 giếng có thể phát triển trong nuôi cấy mô theo sau bởi sự lựa chọn cho việc gắn kết kháng nguyên hoặc phát triển bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột với việc tạo dòng ở thời gian trễ hơn. Tạo dòng bằng “ pha loãng có giới hạn” ở thời điểm đảm bảo phần lớn mỗi giếng chứa tối đa một dòng đơn. Phần lớn các đánh giá là cần thiết ở giai đoạn này lựa chọn tế bào lai hybridoma có khả năng phát triển chống lại tất cả các tế bào dung hợp không thành công nhờ vào sự thưa thớt hoặc không phù hợp trong nuôi cấy in vitro ở nồng độ pha loãng cao. Trong một vài trường hợp, kháng thể tiết ra độc tố để những tế bào yếu ớt được duy trì trong môi trường in vitro. Việc tối ưu hóa phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột ở giai đoạn này có thể cứu vãn tế bào. Ngoài ra , nó cũng trải qua nhiều giai đoạn ngắn của quá trình phát triển bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng chuột sản xuất dòng tế bào trễ hơn in vitro và những giai đoạn của phương pháp in vivo chứng tỏ sức mạnh được gia tăng (enhanced hardiness) và tối ưu sự sản xuất kháng thể (Ishaque and AlPage 7    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    Rubeai 1998). Theo nguyên tắc đã đề ra đã công bố đến các cộng sự nghiên cứu trong việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột trong những cách đó (Jackson anh Fox 1995). Việc lựa chọn môi trường phát triển có chứa chất ức chế aminopterin, là trở ngại trong con đường tổng hợp nhân tạo. Vì vậy, những tế bào phải sử dụng con đường vòng để tổng hợp acid nucleic, một con đường mà có khuyết điểm trong dòng tế bào ung thư tủy xương để những tế bào sản xuất kháng thể đơn dòng bình thường là dung hợp. Bởi vì cả tế bào ung thư tủy xương myeloma và tế bào sản xuất kháng thể đều sẽ không phát triển một mình, chỉ có tế bào lai là có thể phát triển. Sơ đồ quy trình tạo tế bào lai hybridoma Page 8    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    C.II.2/ Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro: Một thuận lợi chính trong việc sử dụng kháng thể đơn dòng hơn là huyết thanh miễn dịch đa dòng là những tiềm năng sẵn có gồm: hầu hết số lượng lớn các kháng thể đơn dòng đặc hiệu đối với một epitope riêng biệt (một phần của phân tử antigen mà có nhiệm vụ tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể). Thông thường, kháng thể đơn dòng được tìm thấy trong môi trường phát triển của nuôi cấy tế bào lai hybridoma bằng phương pháp in vitro hoặc trong dịch tràn ổ bụng từ chuột được tiêm tế bào lai hybridoma. Kháng thể đơn dòng có thể được làm tinh khiết từ cả hai nguồn trên nhưng thường sử dụng trong môi trường hoặc trong dịch tràn ổ bụng. Trong phương pháp in vitro nên sử dụng cho mục đích sản xuất kháng thể đơn dòng khi việc này là có lý do và thiết thực. Nhiều dụng cụ sẵn có trên thị trường làm phát triển cho sự nuôi cấy in vitro. Những dụng cụ này cần thiết phải thay đổi để tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt động của chúng, một số lượng những người trực tiếp sử dụng máy cần thiết phải được đào tạo, sự phức tạp trong quy trình hoạt động, nồng độ cuối cùng của kháng thể đạt được, chi phí, sự điều tiết thể tích dịch. Chi phí của trang thiết bị nên được xem xét trong giá thành của phương pháp sản xuất in vitro. Mỗi dòng tế bào lai hybridoma phản ứng khác nhau đối với môi trường sản xuất in vitro. Trong phần này mô tả phương pháp sản xuất in vitro có sẵn và thảo luận về lợi ích và sự hạn chế của mỗi phương pháp . Sơ đồ tóm tắt các bước trong sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro: Page 9    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    C.II.2.1/Phương pháp nuôi cấy khối mô: Phương pháp đơn giản nhất để tiếp cận sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro là gia tăng nuôi cấy tế bào lai hybridoma thành những khối và làm sạch kháng thể đơn dòng từ môi trường nuôi cấy. Huyết thanh của bò cái đang mang thai đươc sử dụng trong hầu hết môi trường nuôi cấy mô và có chứa khoảng 50 µg/ml globulin miễn dịch của bò. Việc sử dụng huyết thanh trong môi trường nuôi cấy tế bào lai hybridoma có thể giải thích cho một lượng lớn globulin miễn dịch hiện diện trong dịch nuôi cấy (Darby and cộng tác viên 1993). Để tránh sự gây bẩn với globulin miễn dịch của bò, một vài công ty đã phát triển công thức môi trường không có huyết thanh để làm nguồn phát triển của dòng tế bào lai hybridoma (Federspiel và cộng tác viên 1991, Tarleton và Beyer 1991, Velez và cộng tác viên 1986). Trong hầu hết các trường hợp, tế bào lai hybridoma phát triển trong 10% huyết thanh thai bê (FCS) có thể thích nghi trong khooảng thời gian bốn giai đoạn ( 8-12 ngày) để phát triển trong ít hơn 1% FCS hoặc trong môi trường không có FCS. Tuy nhiên, sự thích nghi này có thể kéo dài hơn và trong 3-5% trường hợp tế bào lai hybrydoma sẽ không bao giờ thích nghi với môi trường FCS thấp. Sau khi thích nghi, việc nuôi cấy tế bào cho phép nuôi theo thông thường, sử dụng bình thót cổ nuôi cấy mô dưới điều kiện phát triển chuẩn khoảng 10 ngày. Page 10    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    Kháng thể đơn dòng sau đó sẽ được thu hoạch từ môi trường. Phương pháp được đề cập trên đây là sản xuất kháng thể đơn dòng ở nồng độ đặc thù là dưới 20 µg/ml. Những phương pháp mà làm tăng nồng độ bằng cách loại bỏ oxy trong môi trường có thể gia tăng khả năng phát triển của tế bào và mật độ phát triển tế bào và vì vậy gia tăng nồng độ kháng thể đơn dòng (Boraston và cộng tác viên 1984, Miller và cộng tác viên 1987). Một số phương pháp đó sử dụng spinner flasks và roller bottles để giữ môi trường nuôi cấy trong lưu thông không đổi và vì vậy cho phép chất dinh dưỡng và chất khí phân phối đều hơn trong môi trường nuôi cấy thể tích lớn (Reuveny và cộng sự 1986, Tarleton và Beyer 1991). Túi mà không khí có thể đi qua được, phát triển khá gần đây, gia tăng độ loại bỏ không khí bằng cách cho phép không khí đi xuyên qua vách của vật chứa môi trường. Tất cả những phương pháp này có thể gia tăng căn bản khả năng sản xuất, nhưng nồng độ kháng thể vẫn giữ nguyên trong tầm vài micrograms mỗi mililit ( Heidel 1997, Peterson và Peavey 1998, Vachula và cộng sự 1995). Hầu hết ứng dụng của những nghiên cứu yêu cầu nồng độ kháng thể đơn dòng từ 0,1-10 mg/ml, cao hơn nhiều so với nồng độ kháng thể đơn dòng trong môi trường nuôi cấy khối mô (Coligan và cộng sự). Nếu kháng thể không tinh sạch đủ cho ứng dụng của nghiên cứu, phương pháp lọc theo ngưỡng trọng lượng phân tử thấp dựa vào sự ly tâm hoặc sự ép của không khí có thể được dùng để gia tăng nồng độ kháng thể đơn dòng. Như một sự lựa chọn, nuôi cấy mô nổi bề mặt có thể được tinh khiết bằng cách cho đi qua cột ái lực protein A và protein G, kháng thể đơn dòng sau đó có thể tách rửa từ cột ở một nồng độ thích hợp cho hầu hết các ứng dụng (Akerstrom và cộng sự 1985, Peterson và Peavey 1998). Tuy nhiên, globulin của bò hay những globulin miễn dịch khác hiện diện trong môi trường nuôi cấy sẽ làm bẩn kháng thể đơn dòng được chuẩn bị. Cả hai bước cô đặc có thể thực hiện trong một ngày hoặc ít hơn với thời gian thực hiện tối thiểu. Tóm lại, phương pháp nuôi cấy khối mô là một công nghệ tương đối đơn giản để thực hiện, có giá thành đầu tư thực hiện tương đối thấp, có thời gian từ lúc bắt đầu đến khi kết thúc khoảng 3 tuần, điều này gần giống với phương pháp dịch tràn ổ bụng, và làm cho nó có thể sản xuất số lượng kháng thể đơn dòng có thể so sánh được với việc sản xuất bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Điều bất lợi trong những phương pháp này là một thể tích lớn môi trường nuôi cấy mô phải xử lý, nồng độ kháng thể đơn dòng thu được sẽ thấp ( khoảng vài microgam trong mỗi mililit) và một vài kháng thể đơn dòng bị biến đổi trong suốt quá trình cô đặc và tinh sạch (Lullau và cộng sự 1996). Trên thực tế, sự chọn lọc một kháng thể đơn dòng cho thấy độ hoạt động bị giảm sút 42% bằng một hoặc một nồng độ chuẩn Page 11    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    khác hoặc một quy trình tinh khiết khác (Underwood và Bean 1985) Trên đây là những hình ảnh về: spinner flasks Trên đây là những hình ảnh về : roller bottles Trên đây là những hình ảnh về flasks C.II.2.2/ Những hệ thống màng nền bán thấm: Như đã đề cập ở trên, sự phát triển của tế bào lai hybridoma với mật độ cao hơn trong quá trình nuôi cấy, kết quả là tạo ra một lượng lớn kháng thể đơn dòng có thể thu được từ môi trường nuôi cấy. việc sử dụng những rào cản, hoặc là hollow fiber (tạm dịch là màng sợi rỗng) hoặc là một màng với một ngưỡng trọng lượng phân tử thấp (10.000-30.000 kD), được thực hiện trong một vài thiết bị cho Page 12    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    phép tế bào phát triển ở một mật độ cao (Evans và Miller 1988, Falkenberg và cộng sự 1995, Jackson và cộng sự 1996). Những thiết bị này được gọi là hệ thống màng nền bán thấm. Mục đích của những hệ thống này là cô lập các tế bào và kháng thể đơn dòng trong một ngăn nhỏ phân cách bởi một rào cản từ một ngăn lớn hơn có chứa môi trường nuôi cấy. Sự nuôi cấy có thể bổ sung nhiều yếu tố để làm tối ưu hóa sự phát triển của tế bào lai hybridoma (Jaspert và cộng sự 1995 ). Chất dinh dưỡng và phế phẩm của tế bào khuếch tán dễ dàng từ bên này sang bên kia rào cản và đạt trạng thái cân bằng với một thể tích lớn, nhưng tế bào và kháng thể đơn dòng được giữ lại trong một thể tích nhỏ hơn (1-15 ml trong hệ thống màng đặc thù hoặc cuộn sợi rỗng nhỏ (small hollow-fiber cartridge). Việc sử dụng cạn kiệt môi trường trong bể chứa lớn lớn có thể được thay thế mà không làm hư hại đến những tế bào hoặc kháng thể đơn dòng, cũng như vậy, các tế bào và kháng thể đơn dòng có thể được thu hoạch độc lập trong môi trường phát triển. Sự phân tách tế bào thành các ngăn nhỏ phân cách nhau bằng màng khiến cho nó có thể đạt được nồng độ kháng thể đơn dòng có thể so sánh với nông độ kháng thể đơn dòng trong phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Hai hệ thống màng nền bán thấm sẵn có là: mini- PERM (Unisyn Technologies, Hopkinton, MA) và CELLine (Integra Bioscience, Ijamsville, MD). Celline có hình dạng và được sử dụng tương tự như đối với một T Flask chuẩn nhưng phân tách thành hai ngăn bởi một màng bán thấm và một màng mà chất khí có thể thấm qua được với mặt sát bên dưới của nó đến ngăn tế bào. Mini-PERM có dạng tương tự nhưng nó có hình trụ và trở thành một đơn vị vận động mà chức năng là làm lăn fermentor liên tục để cho phép sự phân phối của chất khí và chất dinh dưỡng. Gía bắt đầu cho việc khởi công những đơn vị này khoảng 300$-800$ và đòi hỏi phải có tủ ấm CO2. Thuận lợi của hệ thống màng nền bán thấm là thu được nồng độ cao của kháng thể có thể được sản xuất trong thể tích tương đối thấp và huyết thanh thai bê có thể hiện diện trong môi trường cung cấp trao đổi chéo không quan trọng bằng globulin miễn dịch ở bò trong ngăn tế bào. Một điểm bất lợi là kháng thể đơn dòng có thể bị nhiểm bẩn bởi những sản phẩm tế bào chết. Điều cản trở trong kĩ thuật là nhỏ hơn phương pháp nuôi cấy khối mô nhưng sẽ không có vấn đề gì trong phòng thí nghiệm mà đã làm nuôi cấy mô. Toàn bộ kháng thể đơn dòng được sản xuất ra từ hệ thống màng nằm trong tầm từ 10-160 mg theo như các tài liệu của Unisyn. Trong bioreactor có màng sợi rỗng, môi trường tiếp tục được bơm qua một vòng bao gồm một cuộn sợi rỗng (a hollow-fiber cartridge), hệ thống ống mà các chất khí có thể thấm qua được để thêm oxy vào trong môi trường, và nguồn cung cấp môi trường. Cuộn sợi rỗng (The hollow-fiber cartridge) bao gồm nhiều thớ sợi chạy xuyên suốt buồng mà có chứa những tế bào lai hybridoma phát triển ở một mật độ cao. Những sợi này có tính bán thấm và có vai trò tương tự như hệ thống màng nền. bioreactor với những sợi rỗng (the hollow-fiber bioreactor) được tạo ra để mang lại kết quả tống số lên tới 500 mg kháng thể đơn dòng hoặc nhiều hơn Page 13    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    nữa. Việc khởi công kiểu hệ thống này thường tiêu tốn hơn 1200 $. Vì những lý do đó, bioreactor với hệ thống sợi rỗng (hollow-fiber bioreactor ), chỉ được dùng nếu người ta cần một số lượng lớn kháng thể đơn dòng. Reactor với hệ sợi rỗng (The hollow-fiber reactor) được sử dụng thành công trong nhiều phòng thí nghiệm độc lập ( Jackson và cộng sự 1996, Knazek và cộng sự 1972, Peterson và Peavey 1998). Nếu các nhà nghiên cứu không thể đầu tư thời gian hoặc những chi phí lớn, một vài cơ quan nòng cót về thiết bị chức năng, chính phủ, các phòng thí nghiệm có hợp đồng thương mại sản xuất kháng thể đơn dòng từ tế bào lai hybridoma. Ví dụ như: các phòng thí nghiệm có hợp đồng thương mại điển hình tiêu tốn 11$/mg để sản xuất 1.000 mg với những reactor với hệ sợi rỗng(hollow-fiber reactors) (Chandler, 1998). Gần đây, một vài hội thảo, diễn đàn, và một số công bố đã thảo luận về việc sử dụng của một số phương pháp thay thế để thay thế chuột để sản xuất kháng thể đơn dòng (Center for Alternatives to Animal Testing và OPRR/NIH 1997, Marx và cộng sự 1997, de Geus và Hendriksen, eds 1998). Những kết luận của họ cho rằng những phương pháp thay thế có thể cung cấp một cách đầy đủ bằng việc tạo ra hầu hết các kháng thể đơn dòng cần thiết bởi những tổ chức nghiên cứu. Những phương pháp in vitro trong sản xuất kháng thể đơn dòng thích hợp trong nhiều tình huống, và nó đáp ứng cho các nhà nghiên cứu để đưa ra biện hộ có tính khoa học cho việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Nó là cơ sỏ của IACUC để đánh giá biện hộ của các nhà nghiên cứu và để tán thành hoặc phản đối việc sử dụng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Trên đây là những hình ảnh về hollow fiber C.II.3/ Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vivo: (phương pháp dịch tràn ổ bụng) Page 14    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    C.II.3.1/Lý do sử dụng phương pháp in vivo: Mặc dù kĩ thuật in vitro có thể được sử dụng nhiều hơn 90% trong sản xuất kháng thể đơn dòng, nhưng phải thừa nhận rằng trong một số trường hợp phương pháp in vitro sẽ không có hiệu quả. Bởi vì đặc điểm của tế bào lai hybridoma thay đổi và nhu cầu sản xuất kháng thể đơn dòng thì đa dạng, kỹ thuật in vitro không thích hợp trong hầu hết các trường hợp, và việc sử dụng chúng có thể là trở ngại trong nghiên cứu, đặc biệt là nếu một số lượng lớn kháng thể đơn dòng được tách được hiệu quả hoặc đặc biệt trong điều trị bệnh. Trong một số trường hợp, sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro không đáp ứng những mục đích khoa học của công trình nghiên cứu. Cụ thể như sau: * Một số dòng tế bào lai hybridoma không thích ứng tốt trong điều kiện in vitro * Kháng thể đơn dòng từ dịch tràn ổ bụng chuột có thể cần thiết cho những thí nghiệm mà kháng thể đơn dòng được sử dụng trên chuột * Dòng tế bào lai hybridoma chuột cống không tạo ra bệnh cổ trướng một cách có hiệu quả ở chuột cống, thường kém thích ứng trong điều kiện in vitro, nhưng thường tạo ra bệnh cổ trướng trong chuột nhắt không có khả năng miễn dịch. * Giai đoạn làm tinh khiết có thể gây ra sự biến tính protein và làm suy giảm sự hoạt động của kháng thể. * Những điều kiện không có huyết thanh hoặc có huyết thanh ở nồng độ thấp không thể cung cấp đủ lượng kháng thể đơn dòng cho một số mục đích , như đánh giá những vacxin mới trong việc chống lại những sinh vật lây nhiễm. * Phương pháp nuôi cấy đôi khi mang lại những tập hợp mAb IgG mà được glycozyl ở những vị trí khác nhau từ những thu hoạch từ dịch tràn ổ bụng ở chuột, do đó ảnh hưởng đến khả năng kháng nguyên – ràng buộc và các chức năng sinh học quan trọng. * Khi những tế bào lai hybridoma sản xuất mAb có chứa các tác nhân lây nhiễm, như nấm men hay nấm, những tế bào thường phải thông qua con chuột. C.II.3.2/ Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vivo: Để sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp dịch tràn ồ bụng, chuột sẽ được tiêm dòng tế bào lympho chuyên biệt vào trong cơ thể chúng . Tuy nhiên, để gia tăng đáp ứng sản xuất kháng thể, chuột được kích hoạt bằng hai mũi tiêm đầu tiên có chứa pristane vào xoang bụng, cách nhau một tuần . Pristane có tác dụng gây nên phản ứng viêm hạt và tác động đến quá trình tích dịch ổ bụng . Liều thích hợp của pristane là khoảng từ 0,1-0,5 ml. Hai tuần sau khi chuột được tiêm pristane, tiếp tục tiêm vào xoang bụng chuột khoảng 106 tế bào lai hybridoma . Việc tiêm tế bào lai hybridoma vào xoang bụng chuột sẽ gây nên các cục bướu và kích thích tiết dịch tràn ổ bụng làm cho bụng chuột phình to lên . Sau khi bị tiêm tế bào lai hybridoma, chuột chỉ có thể sống được nhiều nhất là 20 ngày Page 15    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    . Dịch tràn ổ bụng sẽ thu được bằng phương pháp chọc dò vào khoảng 2 tuần sau khi chuột được tiêm tế bào lai hybridoma . Lượng dịch tràn ổ bụng thu được trên mỗi chuột vào khoảng 10 ml . Hàm lương kháng thể thu được trong phương pháp dịch tràn ổ bụng rất cao, khoảng từ 2-10 mg kháng thể / ml dich tràn Sơ đồ tóm tắt sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột: Một số hình ảnh về phương pháp chọc dò: C.III/Sự thuận lợi và khó khăn của phương pháp in vitro và in vivo: Page 16    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp in vitro và phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột trong việc sản xuất mAb được nêu bật trong phần này. Cần lưu ý rằng có khả năng là phương pháp in vitro sẽ đáp ứng hơn 90% tổng nhu cầu cho mAb. Một số thuận lợi và bất lợi có liên quan tới vấn đề về sự bảo vệ động vật. những người khác đề cập đến nền kinh tế sản xuất mAb. Như đã lưu ý dưới đây thuộc phần có tiêu đề “ phương pháp in vivo và in vitro cho việc sản xuất thương mại mAb”, trong phương pháp in vitro có thể chi phí từ ½ đến 6 lần phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Một số yếu tố là nguyên nhân của việc sản xuất in vitro trở nên tốn kém là phí lao động và thiết bị mà thường do các tế bào lai hybridoma sản xuất quá ít mAb trong phương pháp in vitro. Nếu các nhà nghiên cứu phải sử dụng một vài loại môi trường hoặc những dụng cụ khác nhau, như thỉnh thoảng diễn ra, chi phí lao động tăng và nghiên cứu bị trì hoãn (Moro và cộng sự 1994; Stoll và cộng sự 1996; Butler và Huzel 1995) C.III.1/Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp in vitro: C.III.1.1/Những thuận lợi của phương pháp in vitro: - Phương pháp in vitro giảm việc sử dụng chuột ở giai đoạn sản xuất kháng thể (như có thể sử dụng chuột như một nguồn của những tế bào tiếp liệu khi việc sản xuất kháng thể đang được tiến hành) - Những phương pháp in vitro thường là những phương pháp được lựa chọn cho cho sự sản xuất ở quy mô lớn của nghành công nghiệp dược phẩm bởi vì dễ dàng trong nuôi cấy tạo ra sản phẩm so với việc sử dụng động vật và bởi vì những cân nhắc về kinh tế. - Phương pháp in vitro tránh được nhu cầu để trải qua quy trình động vật để sản xuất kháng thể đơn dòng - Phương pháp in vitro tránh được hoặc làm giảm sự cần thiết về kinh nghiệm của nhân viên phòng thí nghiệm trong việc thao tác với động vật. - Phương pháp in vitro sử dụng hệ thống màng nền bán thấm sản xuất mAb có nồng độ thường cao như trong phương pháp dich tràn ổ bụng và tránh được sự tạp nhiễm từ cơ thể chuột C.III.1.2/ Khó khăn của phương pháp in vitro: - Một số tế bào lai hybridoma không phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy hoặc bị mất trong môi trường nuôi cấy. - Phương pháp in vitro thường yêu cầu việc sử dụng FCS (huyết thanh thai bê). Việc sử dụng phương pháp in vitro để sản xuất kháng thể đơn dòng thường yêu cầu sử dụng FCS, là một mối quan tâm từ quan điểm chăm sóc động vật. - Giảm ái lực miễn dịch, thay đổi chức năng sinh học của kháng thể. - Nói chung, nuôi cấy nổi bề mặt chứa đựng ít hơn mAb ( 0,002-0.01) mỗi mililit của môi trường so với phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột. Lưu ý rằng hệ thống màng nền bán thấm đã được phát triển để có thể sản xuất ra nồng độ kháng thể đơn dòng có thể so sánh với nồng độ quan sát trong dịch tràn ổ bụng chuột. Page 17    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    - Trong phương pháp nuôi cấy khối mô, nồng độ mAb có xu hướng thấp ở bề mặt. Những bước cô đặc cần thiế này có thể làm thay đổi ái lực kháng thể, làm biến tính kháng thể , tăng thời gian và chi phí. Nồng độ thích hợp của mAb có thể thu được trong hệ thống màng nền bán thấm. - Hầu hết các lô mAb sản xuất bởi phương pháp in vitro có sử dụng màng nền bị ô nhiễm với những tế bào lai hybridoma chết và sản phẩm của tế bào lai hybridoma chết. Vì vậy, yêu cầu phải làm sạch sớm. - mAb sản xuất bằng phương pháp in vitro có thể sản xuất ra kháng thể có ràng buộc ái lực kém hơn so vói kháng thể thu được bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng. - Phương pháp nuôi cấy in vitro thường tốn kém hơn phương pháp dịch tràn ổ bụng ở quy mô sản xuất mAb nhỏ hoặc trung bình ( Hendriksen và de Leeuw 1998; Jackson và cộng sự 1996; Peterson Peavey 1998; Marx 1998; Lipman 1997) - Số lượng của mAb được sản xuất bằng phương pháp in vitro bị giới hạn bởi số lượng của thiết bị mà nó được thực hiện có sẵn. - The Food and Drug Administration (FDA) ước tính rằng để chứng minh sự tương đương của một mAb sản xuất bằng phương pháp in vitro đối với một mAb trước đây sản xuất bằng phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột sẽ tốn kém khoảng bảo trợ là 2-10 triệu đô la (Stein 1998; Maxim 1998). - Yêu cầu cao về trang thiết bị và trình độ chuyên môn, khó triển khai rộng rãi. C.III.2/ Thuận lợi và khó khăn của phương pháp in vivo: C.III.2.1/ Thuân lợi của phương pháp in vivo: - Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột thường sản xuất mAb ở một nồng độ rất cao mà thường không yêu cầu các thủ tục cô đặc thêm nữa mà có thể gây biến tính kháng thể và làm giảm hiệu quả. - Nồng độ cao của mAb mong muốn trong dịch tràn ổ bụng ở chuột có thể tránh được những ảnh hưởng của chất gây ô nhiễm trong dịch nuôi cấy in vitro khi số lượng tương đương của mAb được sử dụng. - Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột tránh được sự cần thiết phải thuần hóa kháng thể sản xuất bởi phương pháp nuôi cấy mô. - Đơn giản, dễ triển khai rộng rãi. C.III.2.2/ Khó khăn của phương pháp in vivo: - Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột kéo theo việc tiếp tục sử dụng chuột và yêu cầu phải theo dõi hằng ngày - mAb sản xuất bằng phương pháp in vivo có thể chứa nhiều protein chuột và nhựng chất gây ô nhiễm khác mà yêu cầu phải được làm sạch - Phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột có thể tốn kém nếu đòi hỏi sử dụng chuột suy giảm miễn dịch Page 18    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    - Phương pháp in vivo có thể là nguyên nhân gây đau đớn và nguy hại đến chuột. C.IV./ Thu nhận kháng thể đơn dòng: Việc thu hoạch kháng thể đơn dòng có thể được thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng và bản chất của kháng thể . Một số kỹ thuật cơ bản sau thường được sử dụng trong thu hoạch kháng thể đơn dòng : - Ngưng tụ bằng ammonium sulfat nồng độ 50% - Sắc ký trao đổi ion - Sắc ký lọc gel - Sắc ký ái lực Tùy theo yêu cầu sử dụng, kháng thể đơn dòng có thể được thu nhận ở tình trạng không cần tinh khiết bằng các phương pháp ly tâm phân đoạn . Trong trường hợp cần kháng thể tinh khiết hơn có thể sử dụng các phương pháp sắc ký cột ái lực với protein A, protein G... Tuy nhiên trong mọi trường hợp thì vẫn khó tránh khỏi sự tạp nhiễm của kháng thể bò hoặc kháng thể khác hiện diện trong môi trường nuôi cấy . Cần lưu ý rằng kháng thể đơn dòng rất dễ bị biến tính vì thế nên sử dụng các phương pháp ít ảnh hưởng nhất đến chất lượng của kháng thể đơn dòng . Khi trong các nghiên cứu không yêu cầu quá cao về sự tinh khiết của kháng thể đơn dòng mà yêu cầu về tính ái lực và hoạt tính sinh học quan trọng hơn thì phương pháp dịch tràn ổ bụng sản xuất kháng thể đơn dòng có nhiều ưu điểm hơn. C.V/Sản xuất kháng thể đơn dòng ở quy mô lớn: Khoảng 25,000 mAb được liệt kê trong danh ba của Linscott (1998-1999). Hầu hết được sản xuất ở những số lượng nhỏ (ít hơn 0.1g) cho những mục đích nghiên cứu liên quan (de Geus và Hendriksen 1998). Tuy nhiên, một số đã thu được thanh công trong thương mại và vì vậy đòi hỏi một quy mô sản xuất khác nhau. Về mặt thương mại xem xét quy mô sản xuất từ 0.1-10 g là nhỏ, 10-100 g là vừa, và hơn 100g là lớn. Sự sản xuất ở quy mô thương mại nói chung thực hiện sản xuất mAb cho ba muc đích: chuẩn đoán, điều trị , và nghiên cứu, phát triển các tác nhân điều trị bệnh mới. *Sản xuất kháng thể đơn dòng cho mục đích chuẩn đoán và điều trị: Một lượng kháng thể đơn dòng cần thiết và tầm quan trọng của một vài yếu tố như chi phí, thời gian quay vòng, và tuân thủ các quy định phụ thuộc vào mục đích này. Nghành công nghiệp chuẩn đoán đầy cạnh tranh liên quan tới chi phí, thời gian quay vòng, và những yêu cầu về quản lý. Sự sản xuất mAb của nghành công nghiệp chuẩn đoán thường ở quy mô nhỏ hoặc trung bình và rất hiếm khi ở quy mô lớn. Nghành công nghiệp điều trị ít liên quan nhiều hơn nghành công nghiệp chuẩn đoán với chi phí và thời gian quay vòng, và quy mô sản xuất của nó là từ trung bình cho tới lớn. Nghành công nghiệp điều trị thì quy định rất cao và nhạy cảm với cấu trúc quy định và chi phí pháp lý rất cao của một vài thay đổi về Page 19    Sản xuất và thu nhận kháng thể đơn dòng    thủ tục. Nghành công nghiệp công nghệ sinh học mà phát triển các tác nhân trị bệnh sản xuất mAb ở quy mô nhỏ đến trung bình. Nó ít liên quan với chi phí sản xuất hơn so với nghành công nghiệp chuẩn đoán và liên quan nhiều hơn đến nghành công nghiệp điều trị, nhưng thời gian quay vòng là rất quan trọng. Vì vậy, nó đòi hỏi phải quay vòng nhanh chóng . Việc sản xuất mAb thương mại yêu cầu nhiều hơn những mẻ nuôi cấy lớn hoặc sản xuất ở một số lượng lớn chuột. Nó đòi hỏi một sự nỗ lực đáng kể ở giai đoạn chuẩn bị sản xuất để đảm bảo rằng các dòng tế bào được ổn định, có thể sản xuất thương mại số lượng thích hợp một kháng thể ổn định, và có thể sản xuất một sản phẩm không bị nhiễm bẩn. Sản xuất thương mại cũng bao gồm việc xây dựng một cơ sở chất lượng cao cho việc sản xuất in vivo và in vitro và chế biến kháng thể. Có một nhu cầu cho việc kiểm soát chất lượng và các bộ phận đảm bảo chất lượng để đáp ứng được các yêu cầu thực tiễn sản xuất tốt để yêu cầu cho sản xuất thương mại. Việc sản xuất lô thử nghiệm là cần thiết để đảm bảo sản phẩm trước khi sản xuất. D/ KẾT LUẬN: Kháng thể đơn dòng (mAb) là thuốc thử quan trọng được sử dụng trong nghiên cứu y sinh, trong chẩn đoán bệnh và trong điều trị một số bệnh như bệnh nhiễm trùng và ung thư. Kháng thể đơn dòng được sản xuất bởi dòng tế bào hoặc dòng vô tính thu được từ động vật đã được gây kích ứng miễn dịch với yếu tố kháng nguyên đang nghiên cứu. Để sản xuất được kháng thể đơn dòng mong muốn, các tế bào phải được phát triển bằng một trong hai cách sau: Bằng cách tiêm vào xoang bụng của một con chuột thích hợp được chuẩn bị hoặc nuôi cấy mô tế bào trong các bình thoát cổ. Xa hơn nữa là xử lý dịch tràn ổ bụng của chuột và nuôi cấy mô nổi bề mặt có thể cần thiết để thu được kháng thể đơn dòng độ tinh khiết và nồng độ theo yêu cầu. Phương pháp sử dụng chuột thường quen thuộc, được hiểu rõ, và phổ biến rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm; Nhưng những con chuột yêu cầu giám sát cẩn thận để giảm đến mức tối thiểu sự tổn thương và sự nguy hại đến chuột do một số dòng tế bào gây ra bằng cách tích tụ quá mức dịch lỏng (dịch tràn ổ bụng ) ở ổ bụng hoặc sự xâm phạm của nội tạng. Phương pháp nuôi cấy mô sẽ được chấp nhận rộng rãi nếu nó quen thuộc và phổ biến rộng rãi như phương pháp sử dụng chuột và nếu nó có thể sản xuất một lượng kháng thể cần thiết với mọi dòng tế bào, nhưng phương pháp nuôi cấy này rất đắt, tốn thời gian, và thường không có khả năng sản xuất một lượng kháng thể cần thiết mà không có những kĩ năng đáng kể về thao tác. Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy ngày nay đang ngày càng trở nên rẻ hơn, quen thuộc hơn, và rộng rãi hơn E/TÀI LIỆU THAM KHẢO: - Công nghệ sinh học trong thú y – PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải – Nhà xuất bản Nông Nghiệp Page 20   
- Xem thêm -