Tài liệu Sản xuất thử nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ THỰC HIỆN CỦA DỰ ÁN Tên dự án: "Sản xuất thử nghiệm vắcxin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ" Mã số: DADL-2006/04 Lĩnh vực: Nông – Lâm – Ngư nghiệp. Họ và tên Chủ nhiệm dự án: TS. Trần Thị Liên Đơn vị chủ trì: Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương 7518 24/10/2009 Hà Nội, tháng 12 năm 2008 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ THỰC HIỆN I. THÔNG TIN CHUNG VỀ DỰ ÁN 1.Tên dự án: "Sản xuất thử nghiệm vắcxin vô hoạt phòng bệnh xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ". Cấp quản lý : Nhà nước. Thuộc chương trình : Dự án sản xuất thử nghiệm độc lập cấp Nhà nước. 2.Chủ nhiệm dự án: TS. Trần Thị Liên 3.Tổ chức chủ trì : Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương. Địa chỉ: Đức Thượng – Hoài Đức – Hà Nội Số điện thoại: 04.33862381 - 04.33661562 4.Danh sách cán bộ tham gia chính (tên, học vị, chức danh, đơn vị công tác): STT Họ và tên Học vị Chức danh Cơ quan công tác 1 Trần Thị Liên Tiến sĩ Phó giám đốc Xí nghiệp thuốc thú y TƯ 2 Lê Minh Hồng Kỹ sư Giám đốc Xí nghiệp thuốc thú y TƯ Cử nhân Phó giám đốc Xí nghiệp thuốc thú y TƯ Cử nhân Kế toán trưởng Xí nghiệp thuốc thú y TƯ 3 4 5 6 7 8 9 Nguyễn Thị Minh Ước Trần Danh Mạc Nguyễn Đức Thắng Cử nhân Minh Nguyễn Kim Lin Hoàng Minh Thành cung tiêu Quản đốc phân Cù Hữu Lương Nguyễn Hồng Trưởng phòng xưởng Thạc sĩ Phó quản đốc phân xưởng Xí nghiệp thuốc thú y TƯ Xí nghiệp thuốc thú y TƯ Xí nghiệp thuốc thú y TƯ Trung tâm nghiên cứu Dê Kỹ sư và thỏ Sơn Tây Trung tâm nghiên cứu Dê Kỹ sư và thỏ Sơn Tây 2 5.Thời gian thực hiện đã được phê duyệt: Năm bắt đầu :2006 Năm kết thúc : 2008 6. Thời gian kết thúc thực tế (thời điểm nộp báo cáo kết quả): 31/12/2008 7. Kinh phí thực hiện dự án: 7.600 triệu đồng Trong đó : Ngân sách sự nghiệp khoa học : 2.250,00 triệu đồng. Vốn tự có của cơ quan chủ trì : 5.350,00 triệu đồng. II. KẾT QUẢ THỰC HIỆN CỦA DỰ ÁN 1.Kết quả nghiên cứu: a. Hoàn thiện và ổn định các qui trình về giống virus - Đánh giá, bổ sung các chỉ tiêu về giống virus. + Xác định đặc tính của giống. Qua nhiều lần thí nghiệm, chúng tôi đã xác định được các đặc tính của giống virus RHD như sau: − Giống hoàn toàn vô trùng, không phát hiện bất kỳ một loại khuẩn lạc nào trên các môi trường kiểm tra. − Virus giống gây ngưng kết hồng cầu nhóm O của người, không gây ngưng kết hồng cầu ngựa, bò, cừu hoặc hồng cầu người khác nhóm O. − Khi gây nhiễm virus giống trên thỏ có những biểu hiện triệu chứng lâm sàng và bệnh tích giống với thỏ bị nhiễm bệnh tự nhiên ở các ổ dịch. + Triệu chứng:Sốt, bỏ ăn, ủ rũ, thở gấp, thở ra bọt có nhiều dịch nhầy, có dấu hiệu thần kinh, co giật, kêu rên, chảy nước mắt, nước mũi, xung huyết kết mạc mắt. + Bệnh tích: Gan sưng to, xung huyết, thận sưng rất to, xung huyết, khí quản, phổi xung huyết, nhiều dịch nhầy, một số cơ quan nội tạng xuất huyết. Kết quả nghiên cứu về giống được tổng hợp trong bảng 1. 3 Bảng 1: Kết quả nghiên cứu về giống virus Xuất huyết truyền nhiễm thỏ. Bệnh tích nội tạng thỏ được gây nhiễm Lô thí Số lượng HA nghiệm mẫu 1 5 + 2 5 + 3 5 + 4 5 + 5 5 + Gan Thận Biến màu, sưng to, xuất huyết, các tiểu thuỳ có hiện tượng thoái hoá Lách Phổi Khí quản Có dịch nhầy, Sưng Thuỷ thuỷ thũng to, Xung thũng, kèm theo xuất xung huyết xung huyết có bọt huyết huyết khí + Xác định độc lực của giống. Giống virus RHD ở dạng đông khô được pha loãng với dung dịch PBS vô trùng thành dãy pha loãng từ 10-1 - 10-5, mỗi nồng độ tiêm cho 10 thỏ khoẻ mạnh, có độ tuổi từ 2 tháng trở lên, hiệu giá kháng thể kháng virus RHD trước khi tiêm là âm tính, theo đường tiêm bắp, mỗi con 1 ml. Sau khi tiêm hàng ngày theo dõi nhiệt độ và những biểu hiện lâm sàng của thỏ, thời gian theo dõi khoảng 6 ngày Kết quả được ghi lại và tính toán theo công thức Reed & Muench xác định liều gây chết thỏ 50% (LD50). Thí nghiệm được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả được chúng tôi thể hiện trên bảng 2. Bảng 2. Kết quả xác định độc lực của giống. Số thỏ thí nghiệm (con) Liều gây nhiễm (ml) 1 50 1 104,0 2 50 1 103,6 3 50 1 4 50 1 103,7 5 50 1 104,1 Hiệu giá trung bình 4 Đường gây nhiễm Hiệu giá Lô thí nghiệm Tiêm bắp (LD50/ 1ml) 103,8 103,84 Qua bảng 2 chúng tôi xác định được hiệu giá trung bình của giống virus RHD là 103.84 LD50/ 1 ml + Xác định tính kháng nguyên. Virus giống RHD có tính kháng nguyên ổn định, qua nhiều lần tiếp đời trên thỏ, virus giống RHD vẫn giữ được tính kháng nguyên , có tỷ lệ gây bệnh và tử vong cao, gây ngưng kết hồng cầu người nhóm O. Sau khi vô hoạt đưa vào cơ thể, vắcxin tạo miễn dịch nhanh và kéo dài. + Xác định hiệu giá ngưng kết hồng cầu người nhóm O Phản ứng ngưng kết hồng cầu người nhóm O là phản ứng đầu tiên được sử dụng để chẩn đoán bệnh Xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ. Virus RHD chỉ gây ngưng kết hồng cầu người nhóm O, còn các loại hồng cầu khác, virus gây ngưng kết rất yếu hoặc không gây ngưng kết. Qua các thí nghiệm, chúng tôi đã xác định hiệu giá ngưng kết với hồng cầu người nhóm O cao của virus giống RHD là 1/4096. - Kiểm tra sự ổn định về các đặc tính sinh học của giống trong những điều kiện khác nhau. Giống virus RHD được giữ ở hai dạng khác nhau: dạng tươi và dạng đông khô, bảo quản ở nhiệt độ -850C. Định kỳ 3, 6, 9, 12 tháng tiến hành kiểm tra các đặc tính sinh học của chúng. Qua kiểm tra đều nhận thấy: Đối với giống tươi sau 6 tháng, giống đông khô sau 1 năm, vẫn ổn định và giữ nguyên các đặc tính sinh học như hồ sơ giống gốc - Lựa chọn phương pháp giữ giống. Qua quá trình kiểm tra các đặc tính sinh học của giống trong những điều kiện khác nhau, chúng tôi đã xác định được phương pháp giữ giống tối ưu đó là: + Giống virus RHD giữ ở dạng đông khô + Giống bảo quản ở -850C theo hệ thống lô giống gốc (Seed lot system) + Một năm cấy chuyển giống một lần b. Hoàn thiện và ổn định quy trình sản xuất vắcxin 5 - Nuôi cấy virus. + Xác định nồng độ virus thích hợp khi gây nhiễm trên thỏ. Giống virus RHD tươi hoặc đông khô được pha loãng với dung dịch PBS vô trùng ở các độ pha loãng 1/5, 1/10, 1/20 sau đó tiêm cho 10 thỏ khỏe mạnh, có độ tuổi ít nhất từ 2 tháng tuổi trở lên, mỗi thỏ 1 ml theo đường tiêm bắp (Trước khi tiêm hiệu giá kháng thể của thỏ phải là âm tính). Sau khi tiêm hàng ngày theo dõi nhiệt độ thỏ. Kết quả thí nghiệm được trình bày trên bảng 3. Bảng 3. Kết quả xác định nồng độ virus thích hợp khi gây nhiễm trên thỏ. Nồng độ Số lượng thỏ gây Số thỏ chết ở các thời điểm sau khi gây nhiễm pha loãng nhiễm với các nồng độ pha loãng khác nhau (con) virus (con) 1/5 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 10 0 7 3 0 1/10 10 0 4 4 2 1/20 10 0 0 2 8 Qua bảng 3, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ pha loãng virus 1/5, thỏ nung bệnh và chết tập trung ở thời điểm 48 – 72 giờ (10/10 con). Ở nồng độ pha loãng virus 1/10 thỏ nung bệnh chết ở 48 – 96 giờ sau gây nhiễm. Còn ở nồng độ 1/20, thỏ chết chủ yếu ở 96 giờ sau gây nhiễm. Căn cứ lý lịch giống gốc, chúng tôi đã xác định được nồng độ pha loãng virus 1/5 và tiêm mỗi thỏ 1 ml theo đường tiêm bắp là thích hợp nhất. + Xác định thời điểm thích hợp để thu hoạch virus Chúng tôi bố trí 5 lô thí nghiệm, mỗi lô 10 thỏ, mỗi thỏ được tiêm 1ml giống virus RHD được pha với dung dịch PBS vô trùng tỷ lệ 1/5 theo đường tiêm bắp. Sau khi tiêm theo dõi nhiệt độ thỏ, những con bị chết được mổ thu hoạch nội 6 tạng như gan, thận, lá lách, phổi và kiểm tra hiệu giá virus ở các cơ quan đó. Kết quả được trình bày trên bảng 4. Bảng 4. Kết quả xác định hiệu giá virus ở một số cơ quan nội tạng của thỏ sau khi chết ở thời điểm 48 giờ và 72 giờ. Hiệu giá virus trung bình ở các cơ quan nội tạng (HA) Lô thí nghiệm Gan 48 giờ Lá lách Thận Phổi 72 giờ 48 giờ 72 giờ 48 giờ 72 giờ 48 giờ 72 giờ 1 1/4096 1/2048 1/512 1/256 1/2048 1/2048 1/256 1/64 2 1/4096 1/4096 1/256 1/128 1/2048 1/1024 1/512 1/128 3 1/4096 1/2048 1/512 1/128 1/2048 1/2048 1/512 1/128 4 1/2048 1/1024 1/512 1/64 1/4096 1/4096 1/1024 1/256 5 1/4096 1/2048 1/512 1/128 1/4096 1/4096 1/1024 1/128 Qua bảng 4, chúng tôi nhận thấy: - Gan là cơ quan có hàm lượng virus cao nhất, sau đó là thận, lá lách và phổi có hàm lượng virus thấp hơn. - Những thỏ chết ở 48-72 giờ có hàm lượng virus tương đương nhau. Như vậy, chúng tôi đã xác định được nội tạng thu hoạch để làm vắcxin là gan và thận và thời điểm thích hợp nhất thu hoạch làm vắcxin là những thỏ chết từ 48 - 72 giờ sau khi gây nhiễm. + Xây dựng phương pháp tiếp đời trên thỏ. Giống virus RHD dùng làm giống gốc hoặc giống sản xuất được tiếp đời định kỳ trên thỏ như đã nêu ở trên. Khi tiếp đời lựa chọn thỏ khoẻ mạnh, có trọng lượng từ 1,8 - 2 kg, chỉ chọn những thỏ có hiệu giá kháng thể đối với virus RHD âm tính để gây nhiễm virus giống. Sau khi gây nhiễm 48 - 72 giờ, những thỏ chết được mổ thu hoạch 7 gan, thận và kiểm tra các đặc tính về giống sau đó đông khô và bảo quản ở nhiệt độ -850C. - Vô họat kháng nguyên và bổ sung chất bổ trợ. Trên cơ sở sản xuất các lô vắcxin thử nghiệm trong ba năm 2006 - 2008, chúng tôi đã xác định được hoá chất, nồng độ hoá chất để vô hoạt kháng nguyên, xác định được dung môi bổ trợ, nồng độ dung môi để bổ xung vào vắc xin: + Dung dịch Formalin là hoá chất thích hợp nhất để vô hoạt virus RHD. + Nồng độ Formalin 0,2% ở nhiệt độ 370C trong thời gian 72 giờ được khuấy liên tục trên máy khuấy từ sẽ có khả năng làm vô hoạt hoàn toàn virus RHD nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên của nó. + Chất bổ trợ: Keo phèn được sản xuất tại Xí nghiệp thuốc thú y TU là chất bổ trợ thích hợp đối với vacxin RHD, loại keo phèn này đã được sử dụng để bổ sung vào vacxin Tiêu chuẩn hạt keo bao gồm: Hàm lượng clorua không vượt quá 0,3% Hàm lượng sunfat không vượt quá 0,2 – 0,3% Hàm lượng kim loại nặng không vượt quá một phần vạn Hàm lượng sắt không vượt quá 0,03% Độ pH từ 6,8 – 7,2 Sức hút có độ hấp phụ màu là đỏ Congo 0,077% Hàm lượng Al2O3 phải đạt từ 4,2 – 5,6% + Tỷ lệ chất bổ trợ keo phèn trong vắcxin là 15%. + Kiểm tra độ an toàn của chất bổ trợ keo phèn (Al(OH)3) trên thỏ, chuột lang và chuột bạch cho thấy: chất bổ trợ keo phèn rất an toàn đối với cả 3 loại động vật trên. Theo dõi sau 14 ngày số động vật trên đều khỏe mạnh, phát triển bình thường. c. Hoàn thiện và ổn định quy trình kiểm nghiệm vắcxin. - Kiểm tra độ vô hoạt của virus trong vắcxin Huyễn dịch virus RHD sau khi được vô hoạt bằng Formalin 0,2% ở 370C/ 72 giờ đã được lấy mẫu và tiến hành kiểm tra độ vô hoạt trên thỏ. 8 Chọn 10 thỏ khoẻ mạnh, trọng lượng 1,8 - 2 kg, có hiệu giá kháng thể âm tính với virus RHD, tiêm mỗi con 2 ml huyễn dịch virus RHD vô hoạt, 10 thỏ đối chứng không tiêm, theo dõi thỏ 14 ngày. Kết quả kiểm tra vô hoạt của các lô vắc xin thử nghiệm trong 3 năm 2006 – 2008 được thể hiện trên bảng 5 Bảng 5. Kết quả kiểm tra vô hoạt các lô vắc xin RHD thử nghiệm trong ba năm từ 2006 – 2008. STT Lô vắc Ngày xin RHD kiểm tra Số thỏ sống sau khi theo dõi 14 ngày Lô thí nghiệm Lô đối chứng (con) (con) Kết quả 1 01 29.03.06 10/10 10/10 Đạt 2 02 10.04.06 10/10 10/10 Đạt 3 03 27.04.06 10/10 10/10 Đạt 4 04 14.05.06 10/10 10/10 Đạt 5 05 18.06.06 10/10 10/10 Đạt 6 06 21.07.06 10/10 10/10 Đạt 7 07 21.08.06 10/10 10/10 Đạt 8 08 15.09.06 10/10 10/10 Đạt 9 09 30.10.06 10/10 10/10 Đạt 10 10 20.11.06 10/10 10/10 Đạt 11 11 27.01.07 10/10 10/10 Đạt 12 12 11.02.07 10/10 10/10 Đạt 13 13 21.03.07 10/10 10/10 Đạt 14 14 23.05.07 10/10 10/10 Đạt 15 15 02.07.07 10/10 10/10 Đạt 16 16 10/10 10/10 Đạt 17 17 10/10 10/10 Đạt Từ kết quả bảng 5 cho thấy: Qua kiểm tra 17 lô vắc xin RHD thử nghiệm sản xuất trong ba năm từ 2006 – 2008 với quy trình xử lý hoá chất như trên, các 9 lô vắc xin đã sản xuất đều cho kết quả kiểm tra vô hoạt. Tất cả số thỏ kiểm tra (cả thí nghiệm, cả đối chứng) đều khoẻ mạnh, phát triển bình thường, không có bất kỳ biểu hiện lâm sàng nào của bệnh RHD. - Kiểm tra vô trùng vắcxin RHD Các lô vắc xin RHD đã sản xuất trong 3 năm (2006 – 2008) đều được kiểm tra vô trùng theo quy trình như sau: + Lấy mẫu Vắcxin được lấy mẫu theo TCN 160-92 "Vắcxin thú y - Quy trình lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiêm". Mỗi lô vắcxin lấy 1% số thành phẩm của mỗi lô (Tối thiểu 3 mẫu, tối đa 10 mẫu). + Kiểm tra vi trùng − Cấy huyễn dịch vắc xin vào các môi trường qui định (Thạch máu, nước thịt, nước thịt gan yếm khí, thạch nấm), mỗi loại môi trường cấy 2 ống. Các môi trường ở trên được chế theo qui định thông dụng để phát hiện các vi khuẩn dung huyết, hiếu khí, yếm khí và nấm có trong vắcxin. − Lượng vắcxin cấy kiểm tra bằng 1 đến 2 % dung tích môi trường. − Môi trường đã cấy kiểm tra đem bồi dưỡng trong tủ ấm 370C, theo dõi 7 ngày. Riêng môi trường nấm để ở nhiệt độ phòng (25 - 30 0C). Kết quả kiểm tra vô trùng các lô vắc xin thử nghiệm được thể hiện trên bảng 6. 10 Bảng 6. Kết quả kiểm tra vô trùng các lô vắc xin RHD sản xuất trong 3 năm từ 2006 - 2008 Số lô vắc Ngày kiểm xin tra 1 01 2 Năm Kết quả kiểm tra Thạch Thạch Nước Yếm máu nấm thịt khí 29.03.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 02 10.04.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 3 03 27.04.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 4 04 14.05.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 5 05 18.06.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 6 06 21.07.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 7 07 21.08.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 8 08 15.09.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 9 09 30.10.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 10 10 20.11.06 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 11 11 27.01.07 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 12 12 11.02.07 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 13 13 21.03.07 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 14 14 23.05.07 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 15 15 11.07.07 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 16 16 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 17 17 ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ (-): Âm tính – không có khuẩn lạc mọc. Kết quả kiểm tra cho thấy: Cả 17 lô vắc xin RHD sản xuất trong ba năm (2006 – 2008) đều cho kết quả vô trùng, không có bất kỳ một khuẩn lạc hay nấm nào mọc trên các môi trường kiểm tra. - Kiểm tra an toàn trên thỏ. Các lô vắc xin RHD đươch kiểm tra an toàn theo quy trình như sau: 11 Chọn 10 thỏ khoẻ mạnh, trọng lượng 1,8 - 2 kg, có hiệu giá kháng thể âm tính với virus RHD, tiêm mỗi con 3 liều vắcxin sử dụng (3 ml) theo đường tiêm bắp, 10 con đối chứng không tiêm. Tất cả số thỏ được theo dõi trong 21 ngày. Kết quả được thể hiện trên bảng 7 Bảng 7. Kết quả kiểm tra an toàn các lô vắc xin RHD thành phẩm sản xuất trong ba năm (từ 2006 – 2008) Lô vắc STT xin RHD Lượng Đường Số lượng Số lượng Ngày vắc xin tiêm thỏ kiểm thỏ đối kiểm tra sử dụng tra chứng (liều) (con) (con) Kết quả 1 01 30.03.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 2 02 11.04.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 3 03 28.04.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 4 04 15.05.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 5 05 19.06.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 6 06 22.07.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 7 07 22.08.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 8 08 16.09.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 9 09 31.10.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 10 10 21.11.06 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 11 11 28.01.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 12 12 12.02.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 13 13 22.03.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 14 14 24.05.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 15 15 12.07.07 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 16 16 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 17 17 3 Tiêm bắp 10 10 An toàn 12 Qua bảng 7 cho thấy, cả 17 lô vắc xin RHD được kiểm tra an toàn theo quy trình trên đều cho kết quả an toàn, thỏ hoàn toàn khoẻ mạnh, phát triển bình thường khi sử dụng 3 liều vắc xin theo đường tiêm bắp. Như vậy, cả 17 lô vắc xin RHD sản xuất trong ba năm (2006 – 2008) đều đạt tiêu chuẩn an toàn. - Kiểm tra hiệu lực Tất cả các lô vắcxin được kiểm tra hiệu lực theo quy trình như sau. Lô thí nghiệm: Chọn 10 thỏ ít nhất 2 tháng tuổi, khoẻ mạnh, có hiệu giá kháng thể âm tính với virus RHD, mỗi thỏ tiêm 1 liều vắcxin sử dụng (1 ml) theo đường tiêm bắp. Lô đối chứng: 10 thỏ cùng nguồn gốc với lô thí nghiệm không tiêm làm đối chứng. Tất cả số thỏ của lô thí nghiệm và lô đối chứng sau 3 tuần được công cường độc theo đường tiêm bắp, mỗi con 1 liều virus RHD cường độc chứa ít nhất 100 LD50. Toàn bộ số thỏ được theo dõi trong 14 ngày. Kết quả kiểm tra hiệu lực các lô vắc xin thành phẩm sản xuất trong ba năm 2006 - 2008 được thể hiện trên bảng 9. 13 Bảng 9. Kết quả kiểm tra hiệu lực các lô vắc xin RHD thành phẩm sản xuất trong ba năm (2006 – 2008) Lô STT vắc xin RHD Ngày kiểm tra Kết quả theo dõi Ngày công cường đôc Lô thí Lô đối nghiệm chứng S C S C Kết quả 1 01 30.03.06 20.04.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 2 02 11.04.06 10/10 0/10 2/10 8/10 Đạt 3 03 28.04.06 19.05.06 10/10 0/10 0/10 10/10 Đạt 4 04 15.05.06 05.06.06 10/10 0/10 0/10 10/10 Đạt 5 05 19.06.06 10.07.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 6 06 22.07.06 12.08.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 7 07 22.08.06 12.09.06 10/10 0/10 2/10 8/10 Đạt 8 08 16.09.06 07.10.06 10/10 0/10 2/10 8/10 Đạt 9 09 31.10.06 21.11.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 10 10 21.11.06 12.12.06 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 11 11 28.01.07 18.02.07 10/10 0/10 2/10 8/10 Đạt 12 12 12.02.07 05.03.07 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 13 13 22.03.07 12.04.07 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 14 14 24.05.07 14.06.07 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 15 15 12.07.07 02.08.07 10/10 0/10 1/10 9/10 Đạt 16 16 17 17 02.5.06 Như vậy, tất cả số thỏ được tiêm vắcxin đều sống khoẻ, phát triển bình thường, không có bất kỳ triệu chứng lâm sàng và bệnh tích nào của bệnh RHD. Thỏ đối chứng không tiêm vắcxin có tỷ lệ chết từ 80 – 100 %. So sánh với tiêu chuẩn của OIE, chúng tôi nhận thấy các lô vắcxin chúng tôi kiểm tra đều đạt kết quả hiệu lực. 14 - Xác định độ dài miễn dịch của thỏ sau khi được tiêm vắcxin. Chọn 40 thỏ khoẻ mạnh, ít nhất 2 tháng tuổi có hiệu giá kháng thể âm tính đối với virus RHD, tiêm mỗi con 1 liều (1 ml) vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp hoặc tiêm dưới da. Sau khi tiêm kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus RHD bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) tại các thời điểm khác nhau. Kết quả được thể hiện trên bảng 10. Bảng 10. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của thỏ ở các thời điểm sau khi tiêm vắcxin. Thời điểm kiểm tra sau khi tiêm Hiệu giá kháng thể trung bình (tuần) (log2) Tỷ lệ bảo hộ (%) 2 7,8 100 4 9,3 100 6 9,97 100 8 10,6 100 10 11,5 100 12 11 100 14 10,5 100 16 9,7 100 18 8,6 100 20 6,2 75 22 5,4 50 24 5,1 40 Qua các thí nghiệm cho thấy độ dài miễn dịch của thỏ kéo dài đến 24 tuần (6 tháng) sau khi tiêm vắcxin. Tuy nhiên, ở thời điểm 24 tuần hiệu giá kháng thể 15 trung bình và tỷ lệ bảo hộ thấp. Ở giai đoạn này, thỏ dễ bị tác động của virus RHD ngoài môi trường. Do vậy, cần phải tiêm phòng vắcxin RHD cho thỏ vào thời điểm này để thỏ có đủ kháng thể kháng lại virus RHD. d. Hoàn thiện và ổn định quy trình sử dụng và bảo quản vắcxin. - Khẳng định lại độ tuổi và thời gian tiêm phòng vắcxin Chúng tôi tiến hành kiểm tra kháng thể của những thỏ con đẻ ra từ thỏ mẹ đã được tiêm phòng vắcxin RHD ở các lứa tuổi khác nhau. − Nhóm 1: 10 thỏ 1 tháng tuổi. − Nhóm 2: 10 thỏ 1,5 tháng tuổi. − Nhóm 3: 10 thỏ 2 tháng tuổi. Các nhóm thỏ được lấy máu ở các thời điểm 0 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày, chắt huyết thanh và kiểm tra kháng thể thụ động. Kết quả kiểm tra được thể hiện trên bảng 11. Bảng 11. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể thụ động kháng virus RHD trong huyết thanh của thỏ. Thời điểm kiểm tra Hiệu giá kháng thể trung bình của các nhóm thỏ thí nghiệm Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 0 7,2 log2 5,8 log2 4,5 log2 5 6,6 log2 5,4 log2 4,2 log2 10 6,2 log2 4,6 log2 3,6 log2 15 5,7 log2 4,4 log2 3,2 log2 (ngày) Qua theo dõi, chúng tôi nhận thấy hiệu giá kháng thể trung bình của cả 3 nhóm thỏ đều giảm dần qua các thời điểm kiểm tra. Thỏ ở 1 tháng tuổi có hiệu giá kháng thể trung bình là 7,2 log2, sau đó giảm dần đến 1,5 tháng tuổi là 5,7 5,8 log2 và đến 2,5 tháng tuổi chỉ còn 3,2 log2. Theo kết quả bảng 10, chúng tôi đã xác định được hiệu giá kháng thể của thỏ là 6,2 log2 có tỷ lệ bảo hộ là 75%, 5,4 log2 là 50%. Như vậy, vào thời điểm 16 1,5 tháng tuổi, hàm lượng kháng thể thụ động của đã giảm, một số thỏ đã không còn đủ khả năng chống đỡ lại virus RHD khi virus xâm nhập vào cơ thể. Do đó, chúng tôi đã xác định được thời gian tiêm mũi vắcxin RHD đầu tiên cho thỏ con từ 1,5 - 2 tháng tuổi để thỏ kịp thời có đáp ứng miễn dịch kháng lại virus RHD. - Khẳng định lại đường tiêm, liều tiêm vắcxin cho thỏ + Khẳng định lại liều tiêm vắcxin cho thỏ. Bố trí 4 lô thỏ thí nghiệm, mỗi lô 10 con thỏ khoẻ mạnh, 2 tháng tuổi. + Lô thí nghiệm 1: Tiêm 0,5 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp. + Lô thí nghiệm 2: Tiêm 1 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp. + Lô thí nghiệm 3: Tiêm 1,5 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp. + Lô thí nghiệm 4: Không tiêm vắcxin làm đối chứng. Sau 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày, 28 ngày, lấy máu kiểm tra kháng thể kháng RHD. Kết quả được thể hiện trên bảng 12 Bảng 12. Hiệu giá kháng thể trung bình của thỏ sau khi tiêm với các liều tiêm khác nhau Hiệu giá kháng thể trung bình ở các thời điểm kiểm tra Lô thí nghiệm Lô thí nghiệm 1 (tiêm 0,5 ml) Lô thí nghiệm 2 (tiêm 1 ml) Lô thí nghiệm 3 (tiêm 1,5 ml) Lô thí nghiệm 4 (Không tiêm) 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 5,2 5,6 6 7 7 7,4 9,2 9,4 7,2 7,6 9,2 9,6 3 3,3 3 2,8 17 Qua bảng 12 cho thấy với liều tiêm là 0,5 ml vắcxin sử dụng, hàm lượng kháng thể của thỏ sau 28 ngày vẫn chưa đạt mức bảo hộ 100%. Còn ở lô thí nghiệm 2 và 3 sau 7 ngày tiêm vắcxin thỏ đã đủ lượng kháng thể bảo hộ kháng lại virus RHD. Nhưng để tính hiệu quả kinh tế và tránh gây sốc cho thỏ khi tiêm vắcxin, chúng tôi đã xác định liều tiêm thích hợp cho thỏ là 1 ml. + Khẳng định lại đường tiêm vắcxin cho thỏ Khi xác định được liều tiêm thích hợp, chúng tôi tiếp tục bố trí 2 lô thỏ thí nghiệm, mỗi lô 10 con thỏ khoẻ mạnh, ít nhất hai tháng tuổi, trọng lượng 1,8 - 2 kg. Lô thí nghiệm 1 tiêm 1 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm dưới da cổ. Lô thí nghiệm 2 tiêm 1 ml vắcxin sử dụng theo đường tiêm bắp. Sau 7, 14, 21, 28 ngày tiến hành lấy máu chắt lấy huyết thanh và kiểm tra kháng thể kháng virus RHD. Kết quả được thể hiện trên bảng 13. Bảng 13. Hiệu giá kháng thể trung bình của thỏ sau khi tiêm theo các đường tiêm khác nhau Hiệu giá kháng thể trung bình ở các thời điểm kiểm tra Lô thí nghiệm Lô thí nghiệm 1 (tiêm dưới da cổ) Lô thí nghiệm 2 (tiêm bắp) 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 7,2 8,2 8,6 9,4 7 7,8 8,4 9 Qua hai thí nghiệm đều cho thấy sau 7 ngày tiêm vắcxin lượng kháng thể trung bình của hai lô thỏ thí nghiệm đã đạt mức bảo hộ 100%. Do vậy, chúng tôi đã xác định đường tiêm vắcxin thích hợp cho thỏ là tiêm dưới da cổ hoặc tiêm bắp. - Theo dõi thỏ sau khi tiêm vắcxin. 18 Sau khi được tiêm vắcxin RHD với liều và đường tiêm đã khẳng định, thỏ được theo dõi trong vòng 3 tuần. Tất cả thỏ đều khoẻ mạnh, phát triển bình thường, không có con nào có biểu hiện lâm sàng của bệnh RHD. - Khẳng định nhiệt độ và thời gian bảo quản vắcxin Vắcxin RHD là vắcxin vô hoạt có chất bổ trợ là keo phèn (Al(OH)3), do đó vắcxin phải được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80C, không được làm đông đá. Cứ sau 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng và 12 tháng, các lô vắc xin được lấy mẫu và kiểm tra hiệu lực theo quy trình. Kết quả được trình bày trên bảng 14. Bảng 14. Kết quả xác định tính bền vững của vắcxin Xuất huyết truyền nhiễm thỏ bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC. LôTN I II III Thời gian bảo quản Số lượng mẫu kiểm tra (n) (tháng) Tỷ lệ bảo hộ (%) 0 5 100 3 5 100 6 5 100 9 5 95 12 5 90 0 5 100 3 5 100 6 5 100 9 5 100 12 5 95 0 5 100 3 5 100 6 5 100 9 5 95 12 5 90 19 Qua bảng 14 cho thấy, sau 1 năm bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80C, vắcxin vẫn tạo miễn dịch cho thỏ và có tỷ lệ bảo hộ 90 - 95%. Theo tiêu chuẩn OIE, vắc xin vẫn đạt tiêu chuẩn hiệu lực. Như vậy, chúng tôi đã xác định được hạn sử dụng vắcxin là 12 tháng kể từ khi xuất xưởng. e. Thử nghiệm vácxin tại cơ sở. Là một dự án được triển khai nghiên cứu và sản xuất ngay trong điều kiện sản xuất của Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương. Vì vậy việc nghiên cứu phải gắn liền với phục vụ sản xuất cũng như nhu cầu kinh doanh của Xí nghiệp, do đó vácxin sau khi sản xuất sẽ được kiểm tra chất lượng ngay tại Xí nghiệp và cũng đã gửi mẫu các lô vắcxin đại diện kiểm nghiệm tại Trung tâm kiểm nghiệm Trung ương 1. Chúng tôi cũng đã cho thử nghiệm vácxin ngay trên trại thỏ của Xí nghiệp và thử nghiệm ở một số cơ sở nuôi thỏ khác theo một quy trình sử dụng như sau: + Tiêm miễn dịch vácxin 2 lần cho thỏ, mỗi lần 1 liều. + Lần đầu khi thỏ được 2 hoặc 3 tháng tuổi. Lần thứ 2 nhắc lại sau 2 tuần. + Vị trí tiêm: Bắp đùi hoặc vùng dưới da ở cổ. Việc thử nghiệm vácxin trên đàn thỏ của Xí nghiệp được tiến hành từ năm 2005 - 2008 cho kết quả tốt, đàn thỏ được sử dụng vácxin đều khoẻ mạnh, sinh sản và phát triển bình thường. Ngoài việc thử nghiệm tại Xí nghiệp, chúng tôi đã thử nghiệm ở một số địa điểm nuôi thỏ thường xuyên có dịch bệnh này xảy ra như: Thị trấn Phùng huyện Đan phượng – Hà Tây, huyện Phú Bình tỉnh Thái Nguyên, Trung tâm nghiên cứu dê thỏ Sơn Tây,Viện kiểm nghiệm thuốc thuộc Viện vệ sinh dịch tễ Hà nội, trại dê thỏ An Việt thuộc tỉnh Bình Phước,… Các cơ sở đã sử dụng vácxin Xuất huyết truyền nhiễm thỏ đều cho biết bệnh không xảy ra và đàn thỏ sinh trưởng phát triển bình thường. Kết quả thử nghiệm vắcxin Xuất huyết trên đàn thỏ ở một số cơ sở được trình bày ở bảng 15: 20