Tài liệu Sản xuất chế phẩm trichoderma ở quy mô phòng thí nghiệm ứng dụng trong nông nghiệp

MỞ ĐẦU Ngày nay, trong công tác bảo vệ thực vật, việc ngăn chặn và phòng trừ các loại dịch bệnh trên cây trồng do nấm, ký sinh trùng, sâu hại bằng các tác nhân sinh học đang dần thay thế các loại thuốc có nguồn gốc hóa học. Các tác nhân sinh học được sử dụng là những vi sinh vật như nấm mốc, vi khuẩn, nhóm sinh vật kí sinh,… có khả năng đối kháng với các sinh vật gây hại cho cây. Nhiều nghiên cứu khoa học gần đây càng cho thấy tầm quan trọng của các tác nhân sinh học này vì không có lượng hóa chất tồn dư trong đất cũng như trong nông phẩm nên không gây ô nhiễm môi trường sinh thái, không nguy hiểm đối với người và động vật. Ưu điểm nổi bật của các tác nhân sinh học trong bảo vệ thực vật chính là tác dụng lâu dài và khả năng cải tạo đất. Một trong những tác nhân sinh học đang được nghiên cứu sâu rộng trong và ngoài nước là nấm mốc Trichoderma. Nấm Trichoderma hiện diện trong đất, phát triển nhanh ở những nơi có nhiều dinh dưỡng, chất hữu cơ và ngay ở những vùng rễ cây. Ngoài khả năng phân giải các chất hữu cơ, cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, chúng còn là một tác nhân đối kháng lại nhiều loài nấm gây bệnh trên cây trồng tồn tại trong đất như: Rhizoctonia, Fusarium, Sclerotium, Verticillium, Botrytis,… thông qua tác động của các hoạt chất kháng sinh (trichodermin, glyotoxin,…) và đặc biệt qua hệ enzyme thủy phân (cellulase, chitinase,…) Hoạt động đối kháng của nấm Trichoderma đã được biết từ lâu. Những ứng dụng của nấm Trichoderma trong đấu tranh sinh học với các nấm gây bệnh ở cây trồng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể trong và ngoài nước. Nấm Trichoderma ngày càng được biết đến nhiều hơn và được sử dụng rộng rãi trong các ngành nông nghiệp, công nghiệp, ngành thực phẩm, dệt may,… Chế phẩm sinh học Trichoderma đã và đang được nhiều nông dân sử dụng làm phân bón hữu cơ, thuốc bảo vệ thực vật trong canh tác cây trồng, không những thế chúng còn có tác dụng xử lý phân chuồng và các loại chất thải hữu cơ (vỏ cà phê, rơm, rạ,…) rất hiệu quả. Xuất phát từ những ứng dụng rộng rãivà tiềm năng lâu dài của các chế phẩm sinh học Trichoderma, tôi thực hiện đề tài: “Sản xuất chế phẩm Trichoderma ở quy mô phòng thí nghiệm ứng dụng trong nông nghiệp”, với các nội dung sau: 1. Phân lập chủng giống Trichoderma từ chế phẩm Best, Canada. 2. So sánh khả năng lên men của chủng Trichoderma trên các môi trường khác nhau. 3. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm Trichoderma ở quy mô phòng thí nghiệm. 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Đặc điểm chung của nấm mốc Nấm mốc là một nhóm có cơ thể nhân chuẩn (Eukaryote), là loại sinh vật phát triển thành sợi phân nhánh. Những sợi phân nhánh này phát triển thành đám chằng chịt gọi là khuẩn ty hay hệ sợi nấm. Đường kính của khuẩn ty dinh dưỡng thay đổi từ 3 đến 5 µm hoặc có thể lớn hơn cho nên có thể quan sát sợi nấm bằng mắt thường. Nấm mốc sinh sôi nảy nở bằng các phương pháp vô tính hay hữu tính rất khác nhau về mặt cấu tạo của các cơ quan sinh sản, đó là một trong những tiêu chuẩn chủ yếu để phân loại và phân chia các loài nấm mốc [1]. Trong đất có chứa một số lượng lớn nấm mốc dưới dạng bào tử hoặc khuẩn ty có hoạt tính sinh học. Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm hoại sinh, có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất. Trong quá trình sống, nấm mốc tiết ra nhiều chất có hoạt tính sinh lý, sinh hóa như enzyme, acid hữu cơ, vitamin, chất kháng sinh, độc tố, … Đặc biệt là các enzymecó khả năng phân giải các hợp chất bền vững như chất mùn, lignin, chitin, cellulose,… tạo điều kiện cho các sinh vật khác tiếp tục đồng hóa các chất này [2]. Nấm mốc phân bố rộng rãi trong môi trường sống, chúng hiện diện hầu hết mọi nơi trên thế giới. Trên môi trường đặc, sợi nấm thường chia làm 2 loại: - Khuẩn ty dinh dưỡng làm nhiệm vụ như chiếc rễ của cây xanh, có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng trong môi trường cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. -Khuẩn ty khí sinh đóng vai trò sinh sản là chủ yếu. Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài không phân nhánh hoặc phân nhánh, có kích thước khác nhau, đường kính của sợi nấm thường 3 – 5 µm, nhưng cũng có thể tới 10 µm. Chiều dài của các sợi nấm có thể lên đến vài chục cm. Các sợi nấm thường phát triển theo chiều dài, vừa phân nhánh vừa tạo thành các vách ngăn, các nhánh lại có thể phân nhánh thứ cấp. Toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ bào tử nấm được gọi là hệ sợi nấm. Một số sợi nấm có cấu tạo đặc biệt để thích nghi với các điều kiện phát triển. Sợi nấm phát triển từ ống nảy sợi mọc ra từ bào tử. Ống nảy sợi chỉ là một đoạn sợi nấm non, không phân hóa đặc biệt so với các phần khác của sợi nấm, mọc ra trực tiếp từ bào tử [1]. Mỗi một sợi nấm được phát triển thành những bộ phận khác nhau. Dưới cùng, nơi tiếp giáp với môi trường dinh dưỡng là sợi nấm và từ sợi đó phát triển thành một giá đỡ. Trên giá đỡ là bọng nấm, xung quanh bọng nấm là những thể tế bào hình chai. Trên những thể hình chai là hàng chuỗi bào tử trần, các bào tử trần liên kết với nhau bởi chất nhầy. 3 Nấm mốc không có khả năng di chuyển và là sinh vật hiếu khí nên chỉ phát triển được trong điều kiện thoáng khí. Trên môi trường nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và cả một số cơ chất tự nhiên, hệ sợi nấm thường phát triển thành một khối có hình dạng nhất định, thường có tiết diện tròn hoặc gần tròn gọi là khuẩn lạc. Khuẩn lạc của nấm mốc có dạng sợi, dạng bông xốp, dạng mạng nhện hoặc cũng có thể là dạng bột. Giai đoạn khuẩn lạc còn non có màu trắng hoặc xám nhạt, khi các cơ quan sinh sản phát triển, khuẩn lạc chuyển dần sang các màu sắc khác như: màu lục, màu vàng, màu đỏ,… Ở một số nấm mốc, sắc tố khuếch tán cả vào môi trường [1]. 1.2. Ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycotina) Ở các loài nấm bất toàn, các đặc điểm phân loại bao gồm các đặc điểm phát sinh hoặc hình thái của bào tử trần, bộ máy mang bào tử trần và các đặc điểm phát sinh hình thái của hệ sợi nấm. Nấm bất toàn có bào tử trần là loại bào tử vô tính, không phải là kết quả của các quá trình hữu tính [1,2]. Các loài nấm bất toàn đều có hệ khuẩn ty thật, gồm có sự phát triển hệ sợi, phân nhánh và có vách ngăn. Hệ sợi nấm thường có gian bào hoặc nội bào và mỗi tế bào chứa nhiều nhân [1,2]. Sợi nấm của nấm bất toàn có vách ngang, chúng ta gọi những sợi nấm này là nấm ngăn vách. Vách ngang phân chia sợi nấm thành những “tế bào cộng bào”. Các vach ngang thường có một lỗ thông ở khoảng giữa vách, nhờ đó các dòng tế bào, các thể nhỏ và các nhân tế bào có thể di chuyển dọc theo sợi nấm. Các vách ngang được tạo thành như sau: một khuyên gờ mỏng xuất hiện ở mặt trong của vách bên, khuyên mỏng này phát triển một cách nhanh chóng vào phía trung tâm sợi nấm. Khuyên càng phát triển, lỗ hổng giữa sợi nấm càng nhỏ lại và cuối cùng để lại một lỗ thủng ở giữa. Theo Buller (1993), thời gian để tạo thành một vách ngang ở loài Rhizoctonia là khoảng 10 phút [1,2]. Nấm bất toàn sinh sản vô tính bằng bào tử đính, hoàn toàn không sinh sản hữu tính. Bào tử đính bất động, có hình dạng, kích thước, màu sắc khác nhau theo từng loài, bào tử đính có thể đơn nhân hoặc đa nhân, có vách ngang, dọc hoặc không có vách ngăn, bào tử phát triển bên ngoài cuống bào tử đính, có dạng hình trứng, thuôn dài, hình cầu hoặc hình sao,… Bào tử đính còn gọi là bào tử trần hoặc conidi, là dạng bào tử vô tính sinh ra ở bên trong (nội sinh) hoặc được sinh ra ở bên ngoài (ngoại sinh). Kích thước bào tử trần thay đổi từ 1,2 µm đến vài chục µm. 4 Một số loài nấm bất toàn mang 2 dạng bào tử trần khác nhau về hình thái và kích thước, do vậy ở những loài nấm này người ta phân biệt thành 2 loại bào tử: bào tử trần lớn (macroconidium) và bào tử trần nhỏ (microconidium) [2,3]. Giá bào tử trần là các nhánh sợi nấm phân hóa hình thái nhiều hay ít, có khả năng trực tiếp sinh bào tử trần hoặc phát sinh các nhánh có khả năng sinh bào tử trần. Dựa vào hình thái, người ta phân biệt hai loại giá bào tử trần: - Giá bào tử trần không phân hóa hình thái: ngắn, có bề ngang bằng hoặc nhỏ hơn đường kính của sợi nấm. - Giá bào tử trần phân biệt về hình thái rõ rệt với sợi nấm: có hoặc không có vách ngăn. Các giá bào tử trần mọc riêng rẽ từng nhánh hoặc mọc thành từng cụm từ hai đến nhiều nhánh trên sợi nấm [2]. 1.3. Đặc điểm của nấm Trichoderma 1.3.1. Đặc điểm hình thái Trichoderma thuộc nhóm nấm bất toàn, sống hoại sinh trên phế thải hữu cơ hay kí sinh trên nấm khác. Trichoderma thuộc họ Choanophoraceae, bộ Murcorales, lớp Phycomytes. Cuống bào tử phân nhánh mạnh, thể bình hình chai, đứng riêng lẻ thành từng nhóm, bào tử màu xanh sáng, khuẩn lạc của nấm có màu trắng, trắng xanh, vàng xanh hoặc xanh đậm, Trichoderma sinh sản bằng bào tử trần [2,10]. Bào tử của Trichoderma là dạng bào tử đính, luôn luôn là đơn bào, có hình cầu hay dạng hình elip, không dài quá 5 µm, thường nhẵn. Bào tử một số loài có bứu lồi [3]. Cuống bào tử của Trichoderma thường mọc thành đám hay thành từng đoạn dọc theo hệ sợi hay ở các vùng lan tỏa của khuẩn lạc. Đoạn có kích thước từ 1 – 7 mm, chúng có thể mọc thành từng đám rất dày đặc hoặc dạng bông xốp. Một số loài Trichoderma có xu hướng hình thành cuống sinh bào tử phân tán trên một vùng rộng [5,6]. Thể bình là tế bào sinh ra bào tử đính, mọc trực tiếp từ trục gần đầu mút, đôi khi cách trục chính khá xa, thường điểm cuối của trục chính là thể bình. Các nhánh mọc ở những khoảng cách khác nhau từ đầu mút trục chính, các nhánh này thường là một cặp hoặc gồm 3 nhánh tạo thành một góc 90 độ so với trục chính. Các nhánh cấp một lại phân nhánh thành các nhánh cấp hai, nhánh cấp hai trực tiếp hình thành thể 5 bình. Trục chính ở dạng cuống sinh bào tử này thường không lớn hơn chiều rộng của thể bình [4,6]. Trichoderma là một loài vi nấm sinh sản theo phương thức vô tính nên tốc độ tăng trưởng rất nhanh và sản sinh nhiều bào tử. Đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 25 – 30oC. Khả năng sinh trưởng và phát triển của Trichoderma phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh như khí hậu, độ ẩm, ánh sáng, nhiệt độ, pH [5]. 1.3.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma 1.3.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng Những nghiên cứu cho thấy Trichoderma có khả năng cảm ứng và tổng hợp sinh học nhiều hệ enzyme khác nhau, do vậy các chủng Trichoderma đều có khả năng phát triển trên các môi trường nghèo dinh dưỡng. Là vi nấm hoại sinh, Trichoderma có thể tăng trưởng tốt trên những cơ chất cacbon và nitơ phức tạp, hơn nữa nhiều chủng có thể biến đổi hay thậm chí phân hủy những hợp chất hóa học nguy hiểm và tồn tại lâu dài [11]. 1.3.2.2. Nhu cầu cacbon Trichoderma nổi bật về khả năng tiết ra enzyme phân hủy nhiều loại polysaccharide như cellulose, hemicellulose, chitin… Tuy vậy theo nghiên cứu của Manczinger và Pollner (1985), đối với đa số các giống Trichoderma , nguồn cung cấp cacbon tốt nhất có thể là glucose, fructose, mannose, galactose, xylose, trehalose và cellobinose. Ngược lại, Trichoderma thường không có khả năng sử dụng α-ethyl-Dxylosid, α-methyl-D-mannosid, methanol, ethylamine, 5-ketogluconic acid, L-tartaric, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, glyoxalic acid, DL-isocitric acid, adipic acid, DL-lactic acid, malonic acid, acetol, maltitol, dextran, uracil, cytosin, L-lysin, Lhistidin, L-methionin, L-cystein, α-DL-aminoadipic acid, β-alanin, ethanolamin, nhiều loại D-animo acid, benzoic acid, ferrulic acid và anthranilic acid. Việc sử dụng một số nguồn cacbon như tinh bột, xylan, lactose, sucrose, maltose, một vài polyol, sugar acid, hầu hết các amino acid và một số pentose,… thì tùy thuộc vào từng loài và có thể sử dụng cho mục đích phân loại [11]. 1.3.2.3. Nhu cầu nitơ Trichoderma có khả năng sử dụng những nguồn nitơ đơn giản hay phức tạp để tăng trưởng. Khi Trichoderma đang tăng trưởng trên nguồn cacbon là cacbohydrat, nguồn nitơ thường được sử dụng là amonium hơn là nitrat. Một vài chủng như là T. reesei hay T. koningii cũng không thể sử dụng nitrat. Đó là do sự thiếu enzyme nitrat permease (E.M.Kubicek) [11]. 6 Nguồn nitơ hữu cơ như pepton thường được sử dụng trong môi trường vì cung cấp đồng thời cả nguồn nitơ lẫn nguồn cacbon, và được ưu tiên sử dụng trước khi có mặt polysaccharide. Trong số những amino acid, nguồn nitơ tốt nhất cho Trichoderma là alanin, aspatric acid và glutamic acid. Ngoài amino acid thì T.viride được báo cáo là có thể sử dụng base purin, purin nucleosid và nucleotid tương ứng như là nguồn nitơ duy nhất [11]. 1.3.2.4. Nhu cầu khoáng Ngoài những nguồn cacbon và nitơ, hầu hết những chủng phân loại hoang dại của Trichoderma không yêu cầu những nhân tố tăng trưởng phức tạp. Trong khi đó, phần lớn những loài có khả năng sử dụng phosphat và sulphat vô cơ để lấy nguồn phospho và sulfur. Tuy nhiên, Grayson và cộng sự (1986) đã chứng tỏ sự oxi hóa sulfur bởi T .harzinum khi sinh trưởng trên sucrose, rơm hay đất vô trùng như là nguồn cacbon duy nhất [11]. Thành phần ion kim loại của sợi nấm T.reesei đã được phân tích bởi Gaunt và cộng sự (1984), và có thể được sử dụng để tính toán nhu cầu về ion kim loại. Những ion kim loại như Fe2+, Mg2+,… thì cần thiết cho sự tăng trưởng, và có thể được tìm thấy trong môi trường ở nồng độ rất thấp [11]. Bên cạnh đó những ion kim loại khác cũng rất quan trọng cho sự tăng trưởng của Trichoderma ở những nồng độ thấp, tuy nhiên ở nồng độ cao lại ức chế sự tăng trưởng. Sự thêm vào của Cd2+ và Hg2+ ở nồng độ 1 – 10 mM dẫn đến ức chế tăng trưởng T.viride và dẫn đến kiểu hình bất thường của nấm (Frank và cộng sự, 1993). Yang và cộng sự (1982) phát hiện rằng arsenat ở nồng độ 10ppm thì gây độc cho Trichoderma sp.. [11]. 1.3.2.5. Nhu cầu O2 và CO2 - O2: Trichoderma là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, mặc dù những chủng đã phân lập đượcđều thu nhận trên những môi trường sống có áp suất từng phần O 2 rất thấp. Sự cung cấp O2 và hoạt động của ti thể là những nhân tố điều hòa sự hình thành cellulase của T.reesei và nồng độ của O2 mức dưới cực thuận dường như thích hợp cho sự tổng hợp enzyme. Ảnh hưởng này phụ thuộc vào dạng cơ chất sử dụng [11]. - CO2: Sản phẩm cuối cùng của sự oxi hóa là CO2 sẽ được tích lũy ở mộtmức độ nào đó trong môi trường tăng trưởng rắn, phụ thuộc vào pH và nhiệt độ. Vì vậy, vài loài Trichoderma sp. bị ức chế bởi CO2 theo phương thức phụ thuộc vào pH: sự ức chế mạnh nhất trong môi trường kiềm nhẹ và trung tính (Danielson và Davey, 1973). Hutchinson và Cowan(1972) báo cáo rằng T. harzianum tạo ra hiệu ứng ức chế CO2 và ethanol trên sự tăng trưởng và tạo bào tử của nhiều nấm khác (Aspergillus niger, 7 Pestalotia rhododendri) và trên cây con của Lactuca sativa. Ngược lại, không có ảnh hưởng nào được quan sát trên một vài loài vi khuẩn (Bacillus sp, Klebsiela sp, Pseudomonas sp). Điều này cho thấy một vài chủng Trichoderma có thể chấp nhận sự tích tụ CO2 nhiều hơn một số nấm khác. Schiner và Concin (1982) báo cáo rằng đặc tính này có thể là do Trichoderma sp. cũng có thể tiến hành sự cố định CO 2 dị dưỡng. Mặt khác, Desgranges và Durand (1990) báo cáo rằng thậm chí CO 2 ở nồng độ thấp (2%) đã ức chế sự tạo bào tử của T. viride. Sự chấp nhận CO2 là một đặc tính phụ thuộc vào chủng 11]. 1.4. Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 1.4.1. Trong nông nghiệp 1.4.1.1. Cải thiện năng suất cây trồng Sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thoái hóa, làm hạn chế độ tơi xốp của đất dẫn đến độ thông khí cần thiết cho rễ cây cũng thiếu hụt. Bên cạnh đó, lượng hóa chất tồn dư trong đất sẽ làm cho các loại giun đất, các loài vi sinh vật có lợi cho cây trồng không phát triển được. Vì vậy, các nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới, thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học. Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có các tác dụng sau: - Phân giải cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh dưỡng và kích thích sinh trưởng của cây. - Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, bệnh héo rũ,… và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân. - Một số loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và sự ra hoa. Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng T. harzianum và T. koningii kích thích sự nảy mầm và tăng trưởng của cây. Đối với các loài được trồng trong nhà kính, T. harzianum đẩy nhanh ngày ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa [9]. - Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật nốt sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất; bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng [9]. - Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng T. harzianum còn có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. 8 - Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn. Những nghiên cứu đã cho biết nếu bắp có T. harzianum T-22 hỗ sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22 [13]. Như vậy, các chủng nấm Trichoderma sp. trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên [9,12]. 1.4.1.2. Sử dụng Trichoderma để phòng trừ nấm gây bệnh Trong số các bệnh hại do nấm gây ra, có những bệnh liên quan đến các bộ phận nằm dưới đất (thân ngầm và rễ) rất khó trị bằng các phương pháp hóa học truyền thống [1]. Trichoderma là loại nấm có mặt trong hầu hết các loại đất nông nghiệp. Chúng có khả năng kiềm chế các loại nấm khác phát triển và trở thành đồng minh quan trọng giúp cây trồng chống lại các loại nấm gây bệnh. Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma sp. được quan tâm nhiều nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật. Trichoderma là tác nhân đối kháng tự nhiên của loài nấm gây bệnh chứa trong đất và là một tác nhân kiểm soát sinh học đã được ứng dụng thành công trong nhà kính và ngoài ruộng. Chúng là những ký sinh nấm rất hữu hiệu trên đủ các mầm bệnh thực vật. Trong công trình nghiên cứu của Wells và các cộng sự (1972) đã cho thấy nấm Trichoderma harzianum đã ngăn chặn được bệnh do nấm Sclerotium rolfsii. Backman, Redriguer – Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm Trichoderma harzianum ngăn chặn bệnh do nấm Rhizoctonia solani, Pythium sp. bảo vệ cây họ đậu và củ cải tránh được bệnh chết yểu. Gulia (1982) cho biết nấm Trichoderma lignorum đối kháng được với nhiều loài nấm bệnh như: Fusarium lini, Alternaria tennis, Botrytis cinerea, Verticillium sp.,…[9,12] Những loài Trichoderma được dùng phổ biến trong kiểm soát sinh học là T. koningii, T. harzianum, T. viride, T. hamatum, T. polysportum. Cơ chế chính của quá trình kiểm soát sinh học các mầm bệnh thực vật nhờ Trichoderma là sự cạnh tranh do ký sinh nấm và sự tấn công vào mầm bệnh. Trichoderma sp. tấn công vào nấm chủ bằng cách cuộn, móc hoặc ép sát sợi nấm. Sợi nấm Trichoderma thường cuộn quanh và phát triển song song với nấm chủ, hình thành những cái móc nhập vào hệ sợi nấm chủ. Chúng cũng có thể xâm nhập hệ sợi nấm chủ nhờ tổng hợp và tiết ra enzyme thủy giải từng phần vách tế bào chủ. Sợi nấm có các hốc nhỏ trở nên dễ mắc bệnh, dần dần kiệt quệ và cuối cùng tan rã (xem minh họa hình 1.1., 1.2. ) [12]. 9 Hình 1.1. Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh trên khuẩn ty nấm bệnh Rhizoctonia solani Hình 1.2. Hệ enzyme của nấm mốc Trichoderma phân giải vách sợi nấm Rhizoctonia solani tạo thành những lỗ trên bề mặt, tạo điều kiện thuận lợi cho Trichoderma thâm nhập vào bên trong 10 1.4.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường T. harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng. T. harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol,… Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do trong môi trường khoáng mặn. T. harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin, glycophosphat và amino methylphosphonic acid (3-methoxyphenyl). T. harzianum 2023 (Khoa Sinh lý thực vật trường đại học California) có thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachlorophenol. T. harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và trong đầm lầy [9]. 1.4.3. Trong công nghiệp thực phẩm Người ta đã sử dụng Trichoderma rosenum để thay thế một phần malt đại mạch trong sản xuất bia, có thể thay thế đến 10 – 15% malt đại mạch mà không ảnh hưởng đến chất lượng bia. Đối với những nước chưa trồng được đại mạch thì vấn đề này rất có ý nghĩa thực tế [9]. Gần đây người ta còn chuyển gen endo-β-1,4-glucanase của Trichoderma reesei vào tế bào nấm men bia, kết quả cho thấy có hoạt tính endoglucanase ở ngoài môi trường, hơn nữa chất lượng bia cũng tốt hơn và dịch bia cũng trong hơn [10]. Trong công nghiệp chế biến rượu và sản xuất nước ép trái cây, để có được một hương vị đăc biệt thơm ngon, người ta cũng phải phối hợp nhiều enzyme khác nhau. Enzyme của chủng Trichoderma longibrachiatum đã được khảo sát và cho thấy có thể làm tăng hương vị của men rượu. Đồng thời, các loại glucanase và glucosidase được tiết ra bởi chủng này có khả năng thủy phân liên kết glycoside do đó đã thủy giải các liên kết glycosid-terpen, phóng thích terpen, tạo mùi thơm đặc trưng [9]. Exo-β-1,3-glucanase ở Trichoderma harzianum có thể cắt liên kết β-1,3 và β1,6-glucan, góp phần tăng độ trong của rượu. β-glucan hiện diện trong các hèm rượu có thể làm vẩn đục, thậm chí làm kết tủa rượu. Người ta có thể bổ sung β-glucanase thương mại để phân cắt các β-glucan này nhưng thường có nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Để khắc phục vấn đề này, người ta cho vào một hỗn hợp cellulase của Trichoderma reesei với hàm lượng 0,05 – 0,1 ml chế phẩm/kg lúa mạch, kết quả cho 11 thấy đến 90% glucan bị phân cắt và tiết kiệm 30% lượng thời gian so với dùng các glucanase thương mại khác để làm trong dung dịch [9,10]. Bột lúa mì để sản xuất bánh mì thường chứa đầy đủ hàm lượng β-amylase nhưng lại thiếu α-amylase, cho nên người ta thường phải bổ sung vào bột nhồi một lượng α-amylase nhất định. α-amylase có thể lấy từ lúa đại mạch nảy mầm, vi khuẩn hay nấm. Trong đó, nấm là nguồn cung cấp α-amylase phong phú và tốt nhất. Người ta đã chuyển gen α-amylase ở nấm Trichoderma vào nấm men bánh mì dưới sự kiểm soát của promotor ACT1. Bánh mì tạo ra có kích thước lớn hơn và ruột bánh mì cũng mềm hơn, chậm cứng hơn, kéo dài thời gian bảo quản [9]. Ở Nhật, người ta đã sử dụng Trichoderma viride (hãng Kinkiyakyet) và Trichoderma koningii (hãng Meyseika) nuôi cấy theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzyme cellulase. Hệ enzyme cellulase có một tiềm năng rất lớn trong lĩnh vực tạo dịch glucose hay dịch thủy phân chứa glucose. Glucose có thể được dùng làm thực phẩm cho người và làm nguyên liệu cho công nghiệp lên men (nhất là công nghiệp sản xuất cồn làm nhiên liệu) [9]. 1.4.4. Trong các lĩnh vực khác Trichoderma sp. là nguồn sản xuất hiệu quả các hệ enzyme cellulase ngoại bào. Các enzyme này được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp dệt, do chúng có thể làm vải bông mềm và trắng hơn [9]. L.Granger và cộng sự đã biểu hiện gen β-xylanase của T.reesei ở Saccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose trong lúa mạch và các cây lương thực khác [9]. 1.5. Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp ở Việt Nam Hiện nay, ở Việt Nam, nhóm nấm Trichodermađược sử dụng rất rộng rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học. Phân hữu cơ sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là loại phân có tác dụng rất tốt trong việc phòng trừ các bệnh lá chết nhanh hay còn gọi là bệnh thối rễ do Phytophthora palminova gây ra, bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do nấm Pythium sp., Fusarium solani, …[14] Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học hiện có trên thị trường phía Nam với chất lượng tốt và có uy tín như nhóm sản phẩm phân hữu cơ Cugasa của công ty Anh Việt, phân VK của công ty Viễn Khang, phân hữu cơ Phaga,…[4,14] Chế phẩm sinh học đối kháng Trichoderma ngoài tác dụng làm phân bón hữu cơ sinh học hay sử dụng như một loại thuốc bảo vệ thực vật thì còn có tác dụng xử lý 12 phân gia súc, phân chuồng, vỏ cà phê, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác hữu cơ rất hiệu quả [4,15]. Chế phẩm sinh học BIMA (có chứa Trichoderma) của Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh, chế phẩm Vi – ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam,… đang được nông dân thành phố Hồ Chí Minh, khu vực đồng bằng sông Cửu Long nói riêng và khu vực Đông Nam Bộ nói chung sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng. Việc sử dụng chế phẩm này đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần so với phương pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng. Người nông dân lại tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có ở trong phân [16]. Sử dụng các chế phẩm sinh học trong canh tác cây trồng là một hướng đi đúng đắn, hướng tới một nền nông nghiệp hữu cơ, sinh thái bền vững và thân thiện với môi trường. Hiện nay, ngày càng nhiều nông dân sử dụng các chế phẩm sinh học chứa Trichoderma trong canh tác cây trồng, phòng trừ sâu bệnh hại cây. Không những thế họ còn hiểu rất rõ các đặc tính, cơ chế, công dụng của nhóm nấm này. Trichoderma là một tiềm năng đã được đánh thức và đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam [4,14]. 13 PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu Chế phẩm vi nấm Trichoderma do công ty Best, Canada sản xuất. Chế phẩm dạng bột, màu xanh, mịn, dễ đồng nhất với nước. 2.2. Môi trường, nguyên liệu 2.2.1. Môi trường nuôi cấy - Môi trường phân lập: Môi trường thạch Czapek – Dox, pH = 5,6 (Phụ lục) - Môi trường nhân giống: Môi trường thạch Saboraud, pH = 5,6 - (Phụ lục) Môi trường thử hoạt tính enzyme cellullase: Môi trường thạch CMC (Phụ lục) 2.2.2. Nguồn nguyên liệu sử dụng trong quá trình lên men Lên men Trichoderma trong môi trường rắn gồm cám mì và dịch rỉ đường. - Cám mì có 2 loại: loại màu vàng nâu nhạt bao gồm vỏ cám và loại màu trắng ngà bao gồm vỏ cám và một phần tinh bột mì. Trong thành phần cám mì có cellulose và tinh bột. - Dịch rỉ đường: sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến đường, là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô đặc và kết tinh, trong thành phần có: Nước: 7,4 – 19,4% Protein: 5,6 – 9,9% Glucid: 65 – 84,4% Khoáng: 2,9 – 7,5% 2.2.3. Môi trường lên men  Công thức 1 Cám mì MgSO4.7H2O DAP [(NH4)2HPO4] KNO3 KCl Mật rỉ đường Nước 1 kg 3g 3g 25 g 1,5 g 50 g (1 lít ≈ 1,45kg) 1 lít 15  Công thức 2: Cám mì MgSO4.7H2O DAP [(NH4)2HPO4] KNO3 KCl Mật rỉ đường Nước  Công thức 3: Cám mì MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O DAP [(NH4)2HPO4] KNO3 KCl Mật rỉ đường Nước  Công thức 4: Cám mì MgSO4.7H2O DAP [(NH4)2HPO4] KNO3 KCl Pepton Mật rỉ đường Nước 1 kg 3g 3g 25 g 1,5 g 100 g 1 lít 1 kg 3g 0,5 g 3g 25 g 1,5 g 50 g 1 lít 1 kg 3g 3g 25 g 1,5 g 5g 50 g 1 lít 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp phân lập Đồng nhất mẫu: Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý, lắc đều thu được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1. Dùng micropipet hút chính xác 1 ml dung dịch nồng độ 10 -1 cho vào ống nghiệm 1 chứa 9 ml nước muối sinh lý, thu được dung dịch có nồng độ pha loãng 10 -2. Từ ống nghiệm 1, hút chính xác 1 ml dung dịch cho vào ống nghiệm 2 chứa 9 ml nước muối sinh lý, thu được dung dịch có nồng độ pha loãng 10 -3. Tiếp tục pha loãng lần lượt đến khi đạt đến nồng độ mong muốn. 16 Với mỗi nồng độ pha loãng, hút chính xác 0,1 ml dung dịch, cho vào đĩa thạch Czapek - Dox, dùng que gạt thủy tinh dàn đều dung dịch trên bề mặt thạch. Sau đó, ủ trong tủ ấm với nhiệt độ 28oC từ 4 đến 6 ngày. 2.3.2. Phương pháp cấy chuyền Khi thấy những khuẩn lạc khác nhau mọc trên bề mặt thạch thì tiến hành cấy chuyền. Chọn những khuẩn lạc đặc trưng, đứng riêng biệt, dùng que cấy vô trùng cấy chuyền sang thạch nghiêng. Ủ ở nhiệt độ 28 – 30 oC trong tủ ấm từ 4 đến 6 ngày. Khi khuẩn lạc phát triển thì tiến hành cấy chuyền một hoặc hai lần nữa để thu được chủng giống thuần. 2.3.3. Phương pháp nhân giống Sau khi có được chủng giống thuần, tiến hành nhân giống ra đĩa petri. Dùng que cấy móc, lấy một lượng nhỏ sợi nấm trong ống thạch nghiêng, cấy sang môi trường Saboraud. Ủ các đĩa vừa cấy trong tủ ấm ở 28oC trong 5 ngày. 2.3.4. Phương pháp lên men 2.3.4.1. Chuẩn bị môi trường lên men - Cân chính xác các thành phần môi trường theo 4 công thức (xem phần 2.2.3). - Trộn đều nguyên liệu và cho vào các bịch nylon. Buộc kín miệng bịch. - Hấp khử trùng các bịch môi trường ở 121oC trong 15 phút. Sau đó lấy ra, để nguội. 2.3.4.2. Tiến hành lên men - Chuyển môi trường từ bịch nylon vào các rổ nhựa kích thước 40x20x10 cm. Dưới đáy rổ có lót vải. Bề dày của môi trường lên men trong rổ là 5 cm - Điều chỉnh độ ẩm môi trường khoảng 60% - Cấy giống lên môi trường theo tỷ lệ 1: 99. Đảo trộn nhiều lần nhằm phân bố đều giống vào môi trường. - Dùng vải sạch phủ kín bề mặt môi trường. - Lên men ở nhiệt độ 25-30oC. - Hàng ngày theo dõi nhiệt độ và độ ẩm của môi trường. - Xác định số lượng bảo tử 3 ngày 1 lần. 17 2.3.4.3. Thu nhận sản phẩm Kết thúc quá trình sản xuất, tiến hành thu nhận sản phẩm, sấy khô ở khoảng 40 C để giảm độ ẩm của hỗn hợp xuống dưới 3%. Ở điều kiện độ ẩm này bào tử không thể nảy mầm, ta có thể bảo quản sản phẩm được lâu hơn.. o 2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase Sau khi quan sát hình thái và phân lập được chủng nấm Trichoderma thuần, tiến hành cấy nấm vào một điểm giữa đĩa môi trường thạch CMC, ủ ở nhiệt độ 28 oC. Đo đường kính vòng phân giải của nấm sau một thời gian nuôi cấy (4 đến 5 ngày) bằng cách: dùng pipet nhựa nhỏ thuốc thử luigol lên bề mặt nuôi cấy sao cho thuốc thử dàn đều khắp bề mặt thạch đĩa, quan sát sự đổi màu: - Vùng có Trichoderma phát triển, không bắt màu thuốc thử, sẽ có màu trắng. - Vùng không có Trichoderma, bắt màu thuốc thử, có màu tím. Đo đường kính vòng tròn màu trắng, chính là vòng phân giải cellulose. 2.3.6. Phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm Phương pháp tiêu bản phòng ẩm là nuôi cấy nấm mốc trên lam kính, cách tiến hành như sau: - Cắt một miếng thạch Czapek_Dox đặt lên lam kính, dùng que cấy móc cấy nấm mốc lên 4 điểm trên thạch (thông thường cấy nấm mốc lên trung điểm của 4 cạnh của miếng thạch), đậy lamen lên. - Đặt tiêu bản lên một miếng bông thấm nước để tạo độ ẩm, đặt tất cả vào trong một đĩa petri, đậy nắp lại. - Nuôi cấy ở 28oC trong 4 đến 5 ngày, tiến hành quan sát hình thái của nấm mốc dưới kính hiển vi trong thời gian nuôi cấy. - Mô tả đặc điểm hình thái của nấm mốc: đặc điểm sợi nấm, màu sắc, hình dạng bào tử, hình thái tế bào. 2.3.7. Phương pháp đếm bào tử nấm mốc 2.3.7.1. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu - Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp bằng nước muối sinh lý. - Dùng pipet nhỏ một ít nước cất lên 2 khoang bên của buồng đếm, đặt lá kính lên rồi dùng tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt với phiến kính. - Dùng pipet lấy dung dịch đã pha loãng cho vài giọt vào khe hở giữa lưới đếm và lá kính. 18 - Dùng giấy thấm, thấm phần dung dịch dư tràn ra ngoài. Đặt buồng đếm lên soi dưới kính hiển vi ở vật kính ×40. Đếm số lượng bào tử trong 5 ô chéo nhau và số bào tử trong 1ml canh trường được tính theo công thức sau: Trong đó: x: Lượng tế bào trong 1ml dung dịch. a: Số tế bào trong 5 ô lớn. b: Tỷ lệ pha loãng dung dịch (dung dịch có nồng độ 10-2 thì b = 102) c: các ô nhỏ trong 5 ô lớn. 2.3.7.2. Đếm gián tiếp bằng cách nuôi cấy trên thạch đĩa Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp. Tiến hành đếm bào tử ở 3 nồng độ liên tiếp nhau. Đối với nấm mốc, khuẩn lạc thường to và có nhiều sợi, nên phải pha loãng đến nồng độ 10-5 – 10-8 để dễ quan sát và đếm khi khuẩn lạc mọc trên bề mặt nuôi cấy. Mỗi khuẩn lạc tượng trưng cho một bào tử. Cách tiến hành: - Lắc đều 3 ống có nồng độ pha loãng liên tiếp nhau. - Dùng micro pipet hút chính xác 0,1ml dung dịch pha loãng cho vào đĩa thạch, dàn đều trên bề mặt thạch bằng que gạt thủy tinh vô trùng. Mỗi độ pha loãng cấy vào 3 đĩa petri. - Đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC, ủ từ 4 đến 5 ngày tiến hành đếm khuẩn lạc. Số lượng bào tử được tính theo công thức: Trong đó: N: Số bào tử trong 1ml dung dịch mẫu phân lập. n: Số khuẩn lạc trung bình trong đĩa petri ở mỗi độ pha loãng nhất định. V: Thể tích dung dịch đem cấy (0,1 ml). D: Hệ số pha loãng. 19 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20