Tài liệu Race dịch

1. Giới thiệu Racecadotril (RACE) [(RS) -benzyl N- [3- (acetylthio) -2-benzylpropanoyl] glycinate] là một thuốc chống tiêu chảy hoạt động thông qua ức chế enkephalinase ngoại vi, thích hợp cho cả trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Thuốc được chuyển đổi nhanh chóng trong cơ thể thành thiorphan, một chất ức chế men enkephalinase mạnh. Enkephalins là các peptide nội sinh tiết ra bởi các tế bào thần kinh niêm mạc và niêm mạc đường tiêu hóa. Cơ chế hoạt động của enkephalins liên quan đến việc kích hoạt thụ thể opioid δ gây ức chế sự bài tiết các ion Cl- và dịch là nguyên nhân chính gây mất dịch và chất điện giải khi bị tiêu chảy. Sự ổn định dưới điều kiện khắc nghiệt là một phần quan trọng của quá trình phát triển thuốc và giúp xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến hạn dùng của thuốc. Nó bao gồm sự ổn định hóa học và vật lý trong giai đoạn thiết lập công thức tiền lâm sàng, quá trình phát triển, phát triển bao bì và hạn sử dụng sau khi đưa ra thị trường. Lợi ích của việc xác định cấu trúc của các sản phẩm phân hủy bao gồm: sự hiểu biết về nguồn gốc, từ đó có phương pháp kiểm soát chúng trong quá trình tổng hợp hoặc phát triển công thức. Ngoài ra, các sản phẩm phân hủy có thể được phân lập hoặc tổng hợp để đánh giá độc tính bằng các phép thử độc tế bào như phép thử MTT giúp nghiên cứu và phát triển thuốc. Một vài phương pháp phân tích đã được ghi nhận đối với RACE, bao gồm các phương pháp xác định sự ổn định [5-6], các phương pháp phân tích sinh học [9-10]. Quá trình thủy phân của RACE đã được nghiên cứu trong các điều kiện acid và kiềm bởi Pawan và cộng sự [11]. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu có tính hệ thống nào về sự phân hủy của racecadotril và xác định cấu trúc tất cả các chất phân hủy hình thành. Các nghiên cứu dưới điều kiện khắc nghiệt nói chung bị giới hạn ở các DP không bay hơi, trong khi việc xác định DP bay hơi thường không được thực hiện. Trong khi nghiên cứu tất cả các DP bay hơi lẫn không bay hơi cũng giúp thiết lập cân bằng về khối lượng (mass balance). Do đó, mục đích của nghiên cứu này là phát triển một phương pháp xác định độ ổn định cho RACE và xác định sản phẩm phân hủy (bay hơi lẫn không bay hơi) tạo thành theo điều kiện khắc nghiệt đề xuất của ICH sử dụng LC- ESI- MS / MS, HS-GC-MS, NMR và phương pháp đánh giá độc tính tế bào MTT với các sản phẩm phân huỷ chính phân lập được. Kết quả của nghiên cứu này cũng có thể hữu ích cho việc đánh giá chất lượng của các sản phẩm hết hạn sau quá trình bảo quản hoặc gần hết hạn. 2. Thực nghiệm 2.1. Thuốc và thuốc thử Racecadotril tinh khiết (99,56%) được tại trợ bởi Symed Labs Hyderabad, Ấn Độ. Methanol, acetonitrile và hydrogen peroxide đạt chuẩn sử dụng cho UPLC được mua từ Merck (Mumbai, Ấn Độ). Tất cả các chất phân tích: ammonium formate, acid formic, natri hydroxit, axit clohidric và hydrogen peroxide 30% (kl/kl) được mua từ SD Fine Chemicals Pvt. Ltd, (Mumbai, Ấn Độ). Nước cất sử dụng cho LC được chuẩn bị bằng cách lọc qua hệ thống Millipore Milli-Q-plus (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ). MTT (3- (4,5-dimetylthiazol-2-yl) -2,5diphenyltetrazolium bromide) được mua từ Sigma-Aldrich. Neuro-2a (tế bào biểu mô tế bào thần kinh chuột), tế bào ung thư phổi A549, tế bào ung thư gan Hep G2 thu được Sưu tập giống chuẩn của Mỹ (ATCC) (Manassas, VA, Hoa Kỳ). 2.2. Thiết bị sử dụng Đối với phân tích LC-MS, thiết bị Agilent Infinity series 1290 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA) kết hợp với đầu dò khối phổ tứ cực TOF (quadrupole time-of-flight) (QTOF LC-MS 6540) được trang bị ion hóa phun điện tử (ESI) đã được sử dụng. Việc thu thập dữ liệu đã được kiểm soát của phần mềm máy trạm Mass Hunter. Các điều kiện nguồn ESI đã được tối ưu hóa như sau: điện áp tạo phân mảnh (fragmentor voltage), 150 V; điện áp mao mạch (capillary voltage), 4000 V; skimmer, 65 V; nitơ được sử dụng làm khí sấy (350°C, 10 L/phút) và khí đẩy (nebulizer) (40 psi). Đối với chế độ quét toàn bộ MS, phạm vi khối lượng được đặt ở m/z 50-2000. Nitơ độ tinh khiết cao được sử dụng làm khí va chạm (collision gas). Tất cả các phổ được ghi lại trong điều kiện thí nghiệm giống nhau và có trung bình từ 20-25 lần quét. Việc xác định sản phẩm phân hủy bay hơi đã được thực hiện trên máy sắc ký khí Agilent 6890 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, California, USA) trang bị đầu dò khối phổ (MSD, 5973), máy tự động lấy mẫu (G2614) và quá trình bắn phá electon (EI) được kiểm soát bởi phần mềm ChemStation. Các phổ 1D và 2D NMR được thực hiện trên máy NMR tần số 500 MHz (AVANCE III HD-500, Bruker, Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ) sử dụng CDCl3 làm dung môi. Phổ H1 có giá trị thay đổi hóa học được ghi nhận trên thang đo δ theo ppm so với TMS (δ = 0,00 ppm) làm chất chuẩn. Việc thu thập và xử lý thông tin phổ NMR được thực hiện bằng phần mềm Top spin (phiên bản 3.2). Các nghiên cứu quang học được thực hiện trong tủ vi khí hậu (Osworld OPSH-G-16-GMP series, Osworld Scientific Equipments Pvt. Ltd., Ấn Độ) đặt ở nhiệt độ ± 40% ± 5°C/75,0% RH ± 3,0% và được trang bị đèn cao áp, bao hai đèn UV và bốn đèn huỳnh quang trắng, phù hợp với hai lựa chọn theo hướng dẫn Q1B của ICH. Các nghiên cứu phân hủy do nhiệt đã được tiến hành trong phòng thí nghiệm Osworld (Osworld scientific Pvt. Ltd., Ấn Độ). Tất cả các phép đo pH được thực hiện trên máy đo pH (Metrohm Schweiz AG, máy đo pH 780, Đức) với máy in Epson Lx-300 t và được cân bằng cân Sartorius (CD 225 D, 22308105 Đức). 2.3. Các nghiên cứu về sự phân hủy chủ động Các nghiên cứu về quá trình phân hủy của RACE đã được thực hiện trên số lượng lớn theo hướng dẫn của ICH [12-13]. Quá trình thủy phân cấp tốc RACE được tiến hành bằng cách đun hồi lưu 30 phút trong dung dịch acid (1,0 N HCl), và 5 phút trong kiềm (0,01 N NaOH) ở nhiệt độ phòng, với dung môi hỗn hợp acetonitrile và methanol. Các điều kiện lão hóa cấp tốc gồm oxy hóa, quang hóa và nhiệt độ được tối ưu hóa trong Bảng 1. Các dung dịch thuốc đã được chuẩn bị ở nồng độ 1,0 mg/mL cho tất cả các mẫu thử. 2.4. Chuẩn bị mẫu Tất cả các mẫu thử cấp tốc (thủy phân, oxy hóa, nhiệt và quang hóa) đều được trung hòa và pha loãng với pha động, sau đó lọc qua màng lọc 0,22 μ trước khi phân tích LC-MS. 2.5. Thử nghiệm độc tế bào Các tế bào Neuro-2a, A549 và Hep G2 được nuôi cấy với mật độ 5 x 103 tế bào/giếng trong 96 giếng. Sau khi ủ 24 giờ trong tủ ấm CO2, DP 2 và DP 5 được thêm vào với các nồng độ khác nhau trong khoảng từ 3,125 đến 100 μM, ủ thêm trong 48 giờ. Thêm 100 μL MTT 0,5 mg/mL và ủ tiếp trong 4 giờ. Sau đó dung dịch MTT đã được loại bỏ và các tinh thể formazan hình thành được hòa tan bằng cách thêm 100 μl DMSO và đo độ hấp thụ ở 570 nm sử dụng đầu đọc đĩa đa chùm tia (Spectramax M4, Molecular devices, Mỹ). 2.6. Phân lập các sản phẩm phân huỷ chính bằng sắc ký cột Để phân lập các sản phẩm phân huỷ chính (DP 1, DP 2 và DP 5), điều kiện thủy phân kiềm ban đầu đã được sử dụng, nhưng các sản phẩm phân hủy được hình thành không ổn định và chuyển thành DP 1 trong thời gian ngắn. Do đó, điều kiện thủy phân acid đã được thử bằng cách hòa tan 300 mg RACE trong 5 mL methanol, và thêm 15 mL HCl 1N. Thể tích cuối cùng được bổ sung tới 25 mL bằng methanol và được dun hồi lưu trong 4 giờ ở 80°C; DP 1, DP 2 và DP 5 được hình thành với số lượng lớn. DP 1 là chất lỏng dễ bay hơi đã bay hơi cùng các dung môi (methanol và HCl 1N) và được thu hồi, để lại các sản phẩm phân hủy còn lại trong bình cô quay, được làm đặc lại và nạp vào cột silica. Phần dung dịch này chứa > 99% DP 5 (rửa bằng 40% ethyl acetate trong hexane), DP 2 (rửa với 70% ethyl acetate trong hexan) được trộn chung với nhau; tập trung vào cô quay bay hơi để loại bỏ etyl acetat và hexan trong máy cô quay. DP 2 và DP 5 thu được dưới dạng bột màu trắng với độ tinh khiết sắc ký lần lượt là 99,10% và 99,60% 3. Kết quả và bàn luận 3.1. Khả năng phân tách trong sắc ký Các thí nghiệm sơ bộ đã được thực hiện để phát triển một phương pháp sắc ký có khả năng phân giải thuốc và các sản phẩm phân hủy cấp tốc của nó. Các thử nghiệm ban đầu được thực hiện trên cột Acquity HSS SB C18 (kích thước 100×2,1 mm, kích thước hạt 1,8 μ) sử dụng 0,1% acid formic làm pha phân cực; acetonitril, methanol như pha không phân cực trong chế độ rửa gradient. Sự phân tách rõ và hình dạng đỉnh tốt hơn được ghi nhận với axit formic và acetonitrile, nhưng độ phân giải cho cặp chất trọng yếu, DP 4 và RACE thấp (1.3). Để cải thiện độ phân giải của cặp chất này, thay vì thay đổi các phương pháp gradient và các thành phần pha di động, tiến hành thử với các cột khác nhau: Acquity HSS T3 (100 x 2.1 mm, 1.8 μ), Acquity CSH C18 (100 x 2.1 mm, 1.7 μ) và Acquity HSS Cyano (100 × 2,1 mm, 1,8 μ); cột HSS Cyano cho kết quả tách tốt nhất (độ phân giải là 2). Một chương trình gradient tuyến tính được thiết lập với tỉ lệ như sau: 0/30, 2/30, 5/70, 7/70, 8/30 và 10/30 ở tốc độ dòng 0,3 mL/phút. Sắc ký được theo dõi ở 215 nm, nhiệt độ cột là 30°C và thể tích tiêm mẫu 2 μL. Với phương pháp này. RACE và chất phân hủy của nó đã tách tốt với độ phân giải thích hợp và cho peak có hình dạng đỉnh đối xứng. Để tách các DP dễ bay hơi, cột Zebron ZB-624 (Phenomenex) (30 m × 0,25 mm × 1,40 μ) được sử dụng với nhiệt độ cột GC ban đầu là 35°C (giữ trong 2 phút). Nhiệt độ tăng lên ở tốc độ 8°C/phút đến 220°C, duy trì trong 5 phút; nhiệt độ đầu phun được đặt ở 220°C và đầu dò MSD được đặt ở 230°C. Sử dụng trong chế độ tiêm mẫu chia dòng (1: 50). Hydro được sử dụng làm khí mang với lưu lượng không đổi 1,2 mL/phút 3.2. Quá trình phân hủy của của RACE Quá trình phân hủy của RACE được nghiên cứu sử dụng LC-MS dưới các điều kiện phân hủy khác nhau. Sự phân hủy đã được ghi nhận ở tất cả các điều kiện ngoại trừ quang hóa và sử dụng nhiệt, thuốc được cho là ổn định dưới 2 điều kiện này. Khi methanol được sử dụng làm đồng dung môi (co solvent) hòa tan trong quá trình thủy phân giả DP (axit và base), DP 5 và DP 6 được hình thành. Điều này có thể do sự tham gia của methanol trong phân hủy hóa học bằng cách hoạt động như một chất nhường điện tử để phản ứng với các vị trí amgn điện hoặc trung gian trong con đường phân hủy (Scheme S4a, b, Support ìnormation). Sự chồng lấp (overlay) của sắc ký đồ của tất cả các mẫu phân hủy cấp tốc được ghi nhận trong Hình 1. 3.3. Đặc tính của RACE và các DP của nó bằng LC-MS/MS RACE và tất cả các DP (DP 1-7) được phân tách hoàn toàn bằng LC và cho thấy lượng lớn các ion phân tử được proton hóa (protonated molecular ions) ([M+H]+) trong trạng thái ion hóa dương (positive ionization mode). Phổ MS/MS của [M + H]+ ion của RACE và DP đã được ghi nhận để thu các thông tin về cấu trúc. Các mẫu phân mảnh thu được dựa trên các phổ MS/MS và các phép đo khối lượng chính xác từ dữ liệu HRMS. Tổng cộng có 7 DP được hình thành nhưng chỉ có 6 DP được xác định trên LC-ESI-MS / MS vì DP 1 không được phát hiện dưới điều kiện ion hóa của ESI, APCI và APPI. Các cấu trúc đề xuất của các DP và thành phần cơ bản của chúng được đưa ra trong Scheme 1 và Bảng S1, Supporting information. DP-1 đã được phân tích bởi GC-EIMS và sẽ được thảo luận sau. Phổ ESI-MS/MS được proton hóa của RACE và các DP được ghi nhận trong Hình 2, các mảnh của ion [M + H]+ của chúng được đề xuất trong các sơ đồ từ S1 đến S4, Support information. Thành phần nguyên tố của tất cả các ion trong RACE và các DP được tóm tắt trong Bảng S1, Support information. 3.3.1.MS/MS của [M+H]+ của RACE (m/z 386) Để nghiên cứu quá trình phân hủy của RACE, phổ ESI-MS / MS của phân tử proton hóa của nó (m/z 386) đã được kiểm tra. Phổ cho thấy các ion sản phẩm tại m/z 344 (mất ketene, CH2CO từ m/z 386), m/z 326 (mất phân tử nước từ m/z 344), m/z 278 (mất C6H7O từ m/z 386), m/z 269 (di chuyển nhóm benzyl sang nhóm benzyl khác và mất C2H5NO2 từ m/z 344), m/z 236 (mất C7H8O từ m/z 344), m/z 235 (mất H2S từ m/z 269) m/z 207 (mất CO từ m/z 235), m/z 179 (mất C2H3NO từ m/z 236), m/z 145 (mất H2S từ m/z 179), m/z 117 (mất từ m/z 145), m/z 91 (mất C3H2O từ m/z 145), m/z 65 (mất C2H2 từ m/z 91) và m/z 76 (acid 2-aminoacetic). Các thành phần nguyên tố của tất cả các ion mảnh (SchemeS1, Support information) đã được xác nhận bằng phép đo khối lượng chính xác và được đưa ra trong Bảng S1, Support information. 3.3.2. Xác định các DP Ban đầu, phân tích LC-ESI-MS / MS đã được thử ở cả hai chế độ dương và âm (positive and negative modes). Tất cả các chất phân huỷ cho thấy cường độ [M + H]+ đỉnh ở chế độ positive và các đỉnh cường độ rất thấp ở chế độ negative. Như vậy, phân tích được thực hiện trong chế độ positive và phổ MS/MS của các sản phẩm phân hủy được thể hiện trong hình 2. Hầu hết các cấu trúc có thể đã được đề xuất cho tất cả các DP dựa trên giá trị m/z [M + H]+ của chúng và dữ liệu MS/MS kết hợp với các thành phần cơ bản thu được từ các phép đo khối lượng chính xác. Cấu trúc toàn diện của tất cả các DP được thảo luận dưới đây. DP2: Phổ LC-ESI-MS / MS của [M + H] + của DP 2 (m/z 254, C12H16NO3S+, Rt 2.15 phút) cho thấy các ion sản phẩm tại m/z 236 (mất nước), m/z 179 (mất C2H3NO từ m/z 236), m/z 145 (mất H2S từ m/z 179), m/z 117 (mất CO từ m/z 145), m/z 91 (mất C3H2O từ m/z 145), m/z 65 (mất C2H2 từ m/z 91) và m/z 76. Tất cả các ion mảnh này đều có cấu trúc biểu hiện và tương thích cao với cấu trúc, 2- (2-benzyl-3-mercaptopropanamido ) axit acetic (Scheme S2, Support information). Sự hình thành DP2 dưới điều kiện thủy phân do acid và base có thể được giải thích bằng sự thủy phân của các liên kết este và thioester để tạo thành acid carboxylic và các nhóm thiol (Scheme S4a, b, Support information). DP3: Sản phẩm phân hủy DP 3 tại m/z 296 ([M + H] +, C14H18NO4S+ , Rt 2,46 phút. DP3 có thể được hình thành bằng quá trình thủy phân của nhóm este để tạo thành axit cacbocylic (Scheme S4a, b, Support information) MS/MS cho thấy ion sản phẩm tại m/z 254 (mất ketene CH2CO từ m/z 296), m/z 236 (mất phân tử nước từ m/z 254), m/z 208 (mất CO từ m/z 236), m/z 179 (mất C2H3NO từ m/z 236), m/z 145 (mất H2S từ m/z 179), m/z 117 (mất CO từ m/z 145) m/z 91 (mất C3H2O từ m/z 145) và một đỉnh base mạnh ở m/z 76. Sự hình thành đỉnh mạnh ở m/z 76 chỉ ra rằng phân tử acid 2-aminoacetic của thuốc được giữ nguyên trong DP. Sự phân mảnh DP3 qua quá trình proton hóa được ghi nhận và hỗ trợ bởi các phép đo khối lượng chính xác (Bảng S1, Support information), được thấy phù hợp với cấu trúc đề xuất 2- (3- (acetylthio) -2benzylpropanamido) acetic acid (Scheme S2, Support information). DP4: DP 4 tại m/z 344 ([M + H] +, C19H22NO3S +), được hình thành bằng quá trình thủy phân của nhóm thioeste (Scheme S4a, b Support information), Rt 6,20 phút. Phổ MS/MS cho thấy các ion sản phẩm ở m/z 269 (do di chuyển nhóm benzyl sang nhóm benzyl khác và mất C2H5NO2 từ m/z 344), m/z 236 (mất C7H8O từ m/z 344), m/z 235 (mất H2S từ m/z 269), m/z 207 (mất CO từ m/z 235), m/z 179 (mất C2H3NO từ m/z 236), m/z 145 (mất H2S từ m/z 179), m/z 117 (mất CO từ m/z 145), m/z 91 (mất C3H2O từ m/z 145), m/z 65 (mất C2H2 từ m/z 91) và m/z 76 (axit 2aminoacetic). Dựa vào những dữ liệu này kết hợp với phép đo khối lượng chính xác (Bảng S1, Support information), DP 4 được xác định là axit benzyl 2- (2-benzyl3-mercaptopropanamido) (Scheme S1, Support information). DP5: Phổ ESI-MS/MS của proton DP5 (Rt 3,10, m/z 268) cho thấy các ion sản phẩm tại m/z 250 (mất H2O), m/z 236 (mất methanol từ m/z 268), m/z 208 (mất CO từ m/z 236),, m/z 179 (mất C2H3NO từ m/z 236), m/z 145 (mất H2S từ m/z 179) , m/z 117 (mất CO từ m/z 145), m/z 91 (mất C3H2O từ m/z 145), và m/z 65 (mất C2H2 từ m/z 91). Sự hình thành của một ion mạnh ở m/z 90 chỉ ra sự hiện diện của acid metyl este 2-aminoacetic trong sản phẩm phân hủy. Từ các nghiên cứu phân mảnh (Scheme S2, Support information), DP 5 được xác định là methyl 2- (2-benzyl-3mercaptopropanamido) acetate. Các thành phần nguyên tố của [M + H]+ của DP5 và các ion mảnh của nó đã được xác nhận bằng các phép đo khối lượng chính xác và được cho trong Bảng S1, Support information DP6: Phổ MS/MS của [M + H] + của DP 6 (Rt 3,65 phút, m/z 310, C15H20NO4S+) trong Hình 2. Nó cho thấy các ion sản phẩm tại m/z 278 (mất phần tử methanol từ m/z 310, cho thấy rằng (2(3- (acetylthio) -2-benzylpropanamido) ethylidyne) liên kết oxonium vẫn còn nguyên vẹn). Ion ở m/z 268 (mất CH2CO từ m/z 310) cho thấy sự hiện diện của axit metyl 2- (2-benzyl-3mercaptopropanamido), m/z 236 (mất methanol từ m/z 268), m/z 221 (mất C2H3NO từ m/z 278), m/z 208 (mất CO từ m/z 236), m/z 179 (mất C2H3NO từ m/z 236), m/z 145 (mất H2S từ m/z 179) m/z 117 (mất CO từ m/z 145), m/z 91 (mất C3H2O từ m/z 145). Dựa trên các thí nghiệm MS/MS và các phép đo khối lượng chính xác (Bảng S1, Support information), cấu trúc của DP 6 có thể được chỉ định là methyl 2- (3- (acetylthio) -2-benzylpropanamido) acetat (Scheme S2, Support information). DP7: Phổ ESI-MS của DP 7 (Rt 4,4 phút) cho thấy đỉnh của [M + H]+ tại m/z 402 với công thức nguyên tố, C21H24NO5S. Sự chênh lệch khối lượng 16 Da chỉ ra rằng chất phân hủy này được hình thành bằng cách thêm một nguyên tử oxy. MS/MS của proton DP 7 hiển thị ion sản phẩm tại m/z 384 (mất phân tử nước), m/z 360 (mất ketene), m/z 344 (mất nước từ m/z 360), và m/z 296 (mất C7H6O từ m/z 402). Ion ở m/z 296 có thể được hình thành thông qua sự sắp xếp lại McLafferty liên quan đến hydro nhóm hydroxyl ở cacbon benzyl và nhóm cacbonyl như trong Scheme S3, Support information. Điều này cũng hỗ trợ việc hydroxyl hóa cacbon benzyl trong các điều kiện oxy hóa để hình thành DP 7. Nó cũng cho thấy các ion mảnh ở m/z 285 (hình thành từ m/z 360 bằng cách di chuyển nhóm benzyl sang nhóm benzyl khác, đồng thời mất C2H5NO2), m/z 251 (mất H2S từ m/z 285), m/z 149 (từ m/z 360) (chỗ này không thiếu), m/z 107 (mất CH2CO từ m/z 149), m/z 91 (từ m/z 342), m/z 76 (mất C19H18O3S từ m/z 402) và m/z 65 (mất C2H2 từ m/z 91). Từ dữ liệu MS/MS và các phép đo khối lượng chính xác (Bảng S1, Support information), cấu trúc của DP 7 có thể được đề xuất là benzyl 2- (2- (acetylthiomethyl) -3-hydroxy-3- phenylpropanamido) acetat. DP1: DP1 được tách ra (Rt 13,65 phút, S9 Support information) và được phân tích bởi GCEIMS. Phổ EI của mẫu phù hợp với rượu benzyl từ thư viện NIST (Hình 5). DP này có thể dễ dàng hình thành từ thuốc dưới điều kiện thủy phân như trong sơ đồ S4 a, b, Supporting Information. 3.4. Xác định cấu trúc bằng NMR với 2 sản phẩm phân hủy quan trọng (DP 2 và DP 5) DP5: Phổ H1 NMR và phổ C13 NMR được trình bày cho DP 5 và RACE trong Bảng 2. Các nghiên cứu NMR của DP 5 cho thấy rằng nó có 17 hydro và 13 carbons. Không có singlet ở δ 2,98 ppm (3H), và sự có mặt của triplet ở δ 1,66 ppm (SH) khẳng định sự thủy phân của nhóm thioester. Điều này cũng chứng minh bằng cách không có đỉnh tại δ 195.93 (C = O) trong phổ C13 NMR của DP 5. Phổ H1 và C13 NMR của DP5 cũng chỉ ra sự vắng mặt của các đỉnh proton và cacbon có liên quan đến nhóm benzyl và sự hiện diện của một methyl ở δ 3,73 ppm. Phổ DEPT135 và C13 NMR đã xác minh rằng DP 5 chứa tổng cộng: 1 CH3- (C bậc I), 3 CH2(C bậc II), 6 CH (C bậc III) và 3 C (C bậc IV). Phổ DEPT135 của DP5 cho thấy có đỉnh mới ở δ 52.28 (C thứ 18 - CH3) và không có các đỉnh liên quan đến các nguyên tử cacbon 20, 21, 23, 24, 25, 26 và 27 đã thấy trong phổ DEPT135 của RACE. Phổ tương quan proton – hạt nhân (HSQC) được trình bày trong Hình 4. Phổ HSQC của DP5 cho thấy không có mối tương quan giữa CH3 (20), CH2 (21) và CH (23, 24, 25, 26, 27) đã được quan sát thấy trong phổ HSQC của RACE. Các kết luận từ các phổ H1, C13, DEPT135 và HSQC NMR xác nhận rằng DP 5 là metyl 2- (2-benzyl-3-mercaptopropanamido) acetat (Hình 3). DP2: Cấu trúc DP 2 cũng đã được xác nhận qua phổ H1 NMR. Các giá trị trong phổ H1 NMR trong CDCl3 của DP2 theo thang δ ppm gồm: δ 10.32 (s, 1H) 7.39-7.257 (m, 6H, có 5 H là proton thơm và một là proton CDCl3), 6.06 (s, 1H), 4.20-4.15 (dd, 1H), 3,99-3,95 (dd, 1H), 3,083,04 (m, 1H), 2,97-2,94 (m, 1H), 2,71-2,69 (m, 1H), 2,67-2,65 (m, 1H) và 1,771,74 (t, 1H). Phổ H1 NMR của DP 2 và DP 5 được so sánh để mô tả. Đỉnh đặc trưng nhất ở δ 10.32 (s, 1H) của axit carboxylic và việc mất đỉnh tại 3,73 (s, 3H) của nhóm methyl khẳng định cấu trúc của DP2 là acid 2 - (2-benzyl-3-mercaptopropanamido) 3.5. Thử nghiệm độc tế bào Độc tính của sản phẩm phân hủy, DP 1 (rượu benzyl) đã được nghiên cứu và báo cáo rộng rãi trong tài liệu [15-22]. Do đó, nghiên cứu này chỉ tiến hành đánh giá độc tính cho các sản phẩm phân huỷ DP 2 và DP 5. Từ các giá trị hấp thụ, tỉ lệ ức chế được tính từ phương trình (%Inhibition = (1-ASample / AControl) * 100), và các giá trị IC50 được tính từ biểu đồ nồng độ và tỷ lệ phần trăm ức chế (dựa vào phần mềm GraphPad Prism). Các kết quả chỉ ra rằng hợp chất DP5 có độc tính tế bào đáng kể (trên tế bào A549 và Hep G2), trong khi DP 2 được ghi nhận không gây độc hại. Giá trị IC50 của DP5 đối với tế bào A549 và Hep G2 lần lượt là 58,42 μM (± 7,15) và 82,6 μM (± 9,01). 4. Kết luận Các nghiên cứu lão hóa cấp tốc đối với chủng racecadotril đã được thực hiện theo hướng dẫn ICH. Tổng cộng có bảy DP được xác định và mô tả sử dụng LC-MS / MS và GC-MS. Đây là trường hợp phân hủy điển hình dùng methanol làm dung môi hòa tan đồng thời, methanol phản ứng với RACE dẫn đến sự hình thành các DP giả, DP 6 và DP 5. Các DP chủ yếu (DP 2 và DP 5) được phân lập và cấu trúc của chúng đã được xác định bởi phổ MS/MS và NMR . Nghiên cứu hoạt động gây độc tế bào của hai DP này cho thấy DP2 không gây độc, trong khi DP5 có khả năng gây độc tính trê phổi và gan. Lưu ý: Tất cả dữ liệu thực nghiệm được cung cấp trong Support information (SI).