Tài liệu Quy trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong làm nước quả

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  BÁO CÁO TIỂU LUẬN MÔN: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Đề tài: QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PECTINASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÀM NƯỚC QUẢ GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang SVTH: Trần Thị Mỹ Nhung 3004110234 Nguyễn Thị Ngọc Thi 3005110299 Phạm Thị Kim Tươi 3005110263 Phùng Thị Hằng 3005110064 Vũ Ngọc Khiêm 3005110125 Vũ Thị Tuyết Trang 3005110357 Tp.HCM 06/2014 Nhóm 20Trang 1 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Nhóm 20Trang 2 TPHCM. T04/2013 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU......................................................................................................................................2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PECTINASE...............................................................3 1.1. Định nghĩa Enzyme pectinase ............................................................................................3 1.2. Cấu tạo..................................................................................................................................4 1.3. Phân loại...............................................................................................................................4 1.4. Đặc điểm của Enzyme pectinase:........................................................................................7 1.4.1. Enzym pectinase từ nguồn thực vật:............................................................................7 1.4.2. Enzym pectinase từ vi sinh vật......................................................................................9 1.5. Trung tâm hoạt động của pectinase...................................................................................12 1.6. Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase...............................................................................12 1.7. Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase..............................................................................13 CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PECTINEASE............................................16 2.1. Nguồn gốc thu nhận...........................................................................................................16 2.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt............................................................................................17 2.3. Tách và làm sạch................................................................................................................20 2.3.1. Phương pháp thu nhận...............................................................................................20 2.3.2. Từ môi trường nuôi cấy bề mặt..................................................................................21 2.3.3. Từ môi trường nuôi cấy bề sâu...................................................................................23 2.4. Phương pháp tinh sạch......................................................................................................24 2.4.1. Giới thiệu chung.........................................................................................................24 2.4.2. Phương pháp kết tủa..................................................................................................26 2.4.3. Kỹ thuật siêu lọc.........................................................................................................30 2.4.4. Phương pháp sắc ký...................................................................................................31 2.4.5. Phương pháp thẩm tích.............................................................................................33 2.4.6. Kết tủa ái lực..............................................................................................................34 2.5. Thu chế phẩm từ ASP.NIGER 72-32................................................................................34 2.5.1. Ảnh hưởng thời gian nuôi..........................................................................................34 2.5.2. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi...........................................................................................34 2.5.3. Ảnh hưởng độ ầm ban đầu của môi trường nuôi cấy..............................................35 2.6. Xác định hoạt tính enzyme................................................................................................37 2.6.1. Phương pháp nhớt kế................................................................................................37 2.6.2. Phương pháp đông chung(Cu-pectat).......................................................................37 2.6.3. Phương pháp so màu:................................................................................................38 Nhóm 20Trang 3 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ENZYME PECTINEASA TRONG LÀM NƯỚC QUẢ...................39 3.1. Giới thiệu về ứng dụng enzyme pectinase........................................................................39 3.2. Ứng dụng enzyme pectinase sản xuất nước quả..............................................................40 3.2.1. Các chế phẩm enzyme................................................................................................40 3.2.2. Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả.........................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................................48 Nhóm 20Trang 4 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay nước ta đang trong thời kỳ phát triển mạnh, cùng với xu thế hội nhập nền kinh tế quốc tế, thì các ngành khoa học kỹ thuật và dịch vụ ngày càng phát triển, theo đó ngành công nghệ thực phẩm cũng từng bước được cải tiến để cung cấp các sản phẩm đầy đủ chất dinh dưỡng, đẹp mắt, tiện lợi đáp ứng những nhu cầu ngày càng cao của con người. Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống đã trở thành phổ biến trong ngành sản xuất thực phaamt và mang lại lợi ích khá lớn. Trước đây, nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày nay, người ta nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú và đa dạng và rẻ tiền. Và được ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản xuất khác nhau. Để hiểu sâu hơn về nguồn enzyme này nhóm em thực hiện đề tài tiểu luận quy trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong sản xuất nước quả. Vì thời gian hoàn thành báo cáo không nhiều, cũng như kiến thức còn hạn chế nên không tránh khỏi những sai sót, em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của cô, các bạn để bài báo cáo của em được hoàn thiện hơn và giúp em tiến bộ hơn trong những bài làm sắp tới. Nhóm 20Trang 5 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PECTINASE 1.1. Enzyme là gì? Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin , sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol… đây là một nhóm ezyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Enzyme này ban đầu được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đầu tiên phải kể đến là phát hiện của E.fremi (1840) trên đối tượng cà rốt. 1.2. Cấu tạo Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –α–D–1,4 galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic. Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic. Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên dạng –COO. Người ta cho rằng protopectine là hợp chất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột. Trọng lượng phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC. 1.3. Phân loại Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng: Nhóm 20Trang 6 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase St Enzym (tên gọi theo Enzym(tên t hệ thống) thường gọi) 1 Pectin-pectinhydrolase pectinesterase 2 3 4 Poly--1,4 galacturonid- glycano hydrolase-PG Endopoly galacturonase (endo-PG) Poly--1,4-D- Exopoly galacturonidgalacturon- galacturonase hydrolase (exo-PG) Poly--1,4-D- Endopolymetil- galacturonidmetilester- galacturonase glycanohydrolase (Endo-PMG) Phản ứng xúc tác Pectin + H2O = n metanol + pectic acid Thủy phân liên kết -1,4-Dgalacturonid trong galacturonid không theo một trật tự nào Thủy phân liên kết -1,4-Dgalacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự đứt mạch của acid galacturonic Thủy phân liên kết -1,4-Dgalacturonid trong pectin không theo một trật tự nhất định. Thủy phân liên kết -1,4-D- 5 Poly--1,4-D-galacturonid Exo-pectatliase digalacturonoliase (exo-PKTE) galacturonid trong pectat với sự tạo thành -4,5 aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định. 6 Poly--1,4-D-galacturonid Endopectatliase glicanoliase Nhóm 20Trang 7 (PETE) Thủy phân liên kết -1,4-Dgalacturonid trong pectat, GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang trong galacturonic với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định Thủy phân liên kết -1,4-D7 Poly--1,4-D-galacturonid Endopectinliase metylester glicanoliase galacturonid trong pectin với (Endo-PTE) sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định  Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH 3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62 oC. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+. Polygalacturonase: còn có tên gọi là poly -1,4- galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết –1,4glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4--D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4--D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại: Polymethylgalacturonase hay còn gọi là -1,4-galacturonite- methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, Nhóm 20Trang 8 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang đó là endo-glucosidase-polymethyl galacturonase kiểu I và exo-glucosidasepolymethylgalaturonase kiểu II. Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũng được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV. Enzyme endoglucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá pectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả. Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này thường bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A. niger, A, awamori. Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4--D-galac turonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4--D-galacturonic lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca 2+ để hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. Ngoài ra còn có:  Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly –1,4-galaturonite methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid.  Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly -1,4D- galaturonite –glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme. 1.4. Đặc điểm của Enzyme pectinase: 1.4.1. Enzym pectinase từ nguồn thực vật: Nhóm 20Trang 9 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang  Pectinesterase: Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enyme PE.Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca 2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme. - Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67 oC. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M, theo thứ tự. - PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình thành do quá trình để methyl hoá các phân tử galacturonic acid. - Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại. - Polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose. PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là - 10,05 và 11,0, theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0. - Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyem, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease. Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và 36kD, theo thứ tự. Nhóm 20Trang 10 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Hình 2.1: Cấu trúc của pectinesterase từ carrot - Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt.  Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín. Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme.PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78oC.PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở 57oC. PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6. Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế.Sự thủy phân polymer này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh Nhóm 20Trang 11 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan. 1.4.2. Enzym pectinase từ vi sinh vật Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. Nấm mốc: penicillium glaucum, p.ehrlichii, p.chrysogenum, p.expanam, p.cilrimim, aspergillus awamori, a.foetidus, a.niger, a.terrus, a.saitoi, a.aureus, a.oryzae, a.wentii, fusarium moniliforme,… Nấm men: saccharomyces fragilis Vi khuẩn: bacillus polymyxa, flavobacterium pectinovorum, klebsiella aerogenes… Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật. khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật. Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc. Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime này a.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase. con.diplodiella, pen.citrimin tạo ra chủ yếu là polygalacturonase. Nấm men sacch.fragilis dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase. Vi khuẩn bac.polymyxa, bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase.  Pectinesterase: Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị PH tối ưu khác nhau: PH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có PH tối ưu từ 2,0 đến Nhóm 20Trang 12 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang 6,5. Trái lại ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6 đến 7,5 – 8. Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 45 0C.từ 55 đến 620C thì enzime bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 600C Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oC, PHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62 oC và từ thực vật (phopt=7,5-8, toopt= 55-60oC). khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc conithyrium diplodiella và từ a.niger.trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái đông thể. và người ta cũng đã xác lập được rằng n-axit cuối trong phân tử enzime là phenylalanin. Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do. và enzime sẽ thủy phân lần lượt cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin. hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa. Chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm mốc a.niger, cần thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%.  Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về Polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn Vi sinh vật. Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: saccharomyces fragilis, asperigillus niger, lactobacillus plantarum, cochlibolus carbonum, neurosrora crassa, các loài ascomycete, rhizopus arrchizus và fusarium oxysrorum. Nhóm 20Trang 13 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang PH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất. Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5. cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có ph tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì ph tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6 Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6 Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5 Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 -450C.trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C. 1.5. Trung tâm hoạt động của pectinase Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng xoắn kép về phía phải với 2 vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất. Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate và Lysine. Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45 – 550C. 1.6. Cơ chế tác dụng của enzyme pectinase Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mục đích cơ bản. - Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả. - Làm trong và ổn định chất lượng nước.  Phá vỡ thành tế bào. Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế bào). Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho Nhóm 20Trang 14 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang tế bào. Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào. Các chế phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn chứa các enzym trong nhóm cellulase. Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và giúp quá trình thu nhận dịch tế bào tốt hơn. Làm trong nước quả. Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào  thường chứa nhiều chất khác nhau. Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường gây hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả. Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào. Pectin chứa polygalacturonic acid, araban và galactan.Trong đó lượng polygalacturonic acid chiếm tới 40-60%. Khi bị thủy phân, pectin tách thành hai phần: - Phần trung tính – phức chất galactanoraban - Phần acid – acid pectic. Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào và gian bào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng kim loại khá lớn và một lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ metocyl hóa cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt. Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào khó liên kết với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra.Pectin thường có mối liên kết hydro và liên kết nguyên tử yếu hơn so với cellulose. Tham gia phân hủy pectin gồm nhiều loại enzym : cellulose, pectinase,… 1.7. Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp. Số lượng enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều. Nhóm 20Trang 15 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinase dưới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm mốc sấy khô. Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%. Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang. - Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn; - Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,.. - Sản xuất nước giải khát. - Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan.  Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả. Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép lên tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được. Nhờ pectinase phân giải các cơ chất pectin, làm các chất chiết trong dịch bào dễ thoát ra ngoài hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, hơn nữa dịch quả trong suốt không bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzym pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng của thành phẩm. Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu sau: - Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được gây ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm; nghĩa là chế phẩm phải được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vang. Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu suất Nhóm 20Trang 16 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang chung và đặc biệt là hiệu suất của phần tự chảy có chất lượng cao. Để tăng nhanh và tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzym chính như endo – PMG là 55,0.102 đơn vị/mg protein chứa trong chế phẩm, còn enzym Cx là 57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít dung dịch. Trong trường hợp này không cần có mặt PE. Nhưng nếu hoạt độ của endo – PMG ở trong chế phẩm là 31,0.102 đơn vị/mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vị/mg protein. Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng enzym endo – PMG va Cx phải có sự tương quan nhất định. Khi chế phẩm có hoạt độ endo – PMG là 28,2.102 đơn vị/mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh hơn khi có hoạt độ endo – PMG là 25,4.10 2 đơn vi/mg P và Cx là 55,0 đơn vị/mgP. - Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phải chứa enzym proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin. - Để tránh gây tổn thất các chất màu cùa vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng thì hoạt độ của các enzym oxy hoá trong chế phẩm không được vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chế phẩm. Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo toàn được hoạt độ trong điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điều kiện có độ pH nhất định. Để xử lý dịch hoặc bã nghiền ở trạng thái dòng có thể dùng chế phẩm pectinase có hoạt độ cao (12000đv/g) hoặc dùng chế phẩm pectinase không tan. Chẳng hạn trong sản xuất vang nho, khi sử dụng chế phẩm pectawamorin PM10x, người ta thấy có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32%. Trung bình thể tích của phần dịch tự chảy có thể tăng được 10%, còn hiệu suất chung của dịch tăng lên 1 – 2%. Hoặc khi ép bã nghiền nho trắng đã được xử lý bằng pectinol thì thấy quá trình ép tiến hành nhanh hơn. Hiệu suất dịch khi đó tăng lên 9,6%. Vậy dùng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng tốc độ làm trong và tốc độ lọc của dịch. Nhóm 20Trang 17 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch như protein, pectin … sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt do đó làm tăng tốc độ lọc. Trong 1 giờ dịch thu được từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽ qua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không được xử lý. Khi dịch không được xử lý bằng enzym thì trong quá trình lắng, các hạt vẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống. Khi sử dụng enzym thì các chất cao phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độ làm trong đều tăng. Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của vang. Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phần hóa học của bã thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol. Người ta thấy rằng khi xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng hàm lượng catesin ở trong dịch. Khi đó quá trình trích ly sẽ vượt lên trước quá trình oxy hoá catesin ngay cả khi nhiệt độ tăng. Điều này rất quan trọng, vì các hợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường có họat tính của vitamin P. Như vậy xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang. Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bã bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn. Người ta cho thấy rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc, Botrylis cinerea gây ảnh hưởng rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương thơm mạnh và dịu do hàm lượng glyxerin và ester ở trong vang cao. Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế phẩm enzym bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulase. Trong đó, enzym pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất. Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên, tuyệt đối không được có mặt enzym polygalacturonase, đặc biệt không được chứa enzym endopolygalacturonase. Những enzym này thường làm giảm độ nhớt của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả. Nhóm 20Trang 18 GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PECTINEASE 2.1. Nguồn gốc thu nhận  Từ vi sinh vật : Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú.Vi sinh vật phân giải pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:  Nấm mốc: Asp.niger, Asp.oryase, Asp.terreus, Asp.saito, Asp.japonicus…  Nấm men: sac.ellipsoideus, sac.fragilis, sac.ludwigii …  Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum… 2.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt  Quy trình sản xuất Môi trường Dụng cụ nuôi cấy Hấp khử trùng Hấp khử trùng Để nguội Để nguội Phối vào dụng cụ Cấy vào môi trường Nuôi cấy trong 36h Nhóm 20Trang 19 Thu nhận enzyme thô Nhân giống Giống vi sinh vật GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Sang  Thuyết minh quy trình:  Môi trường nuôi cấy Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng. Môi trường rắn thường dùng nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiều enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao. Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khí tốt, giúp cho sự phát triển của nấm. Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấy gồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dd khác ( mầm mạ, nước khoai tây, … để cung cấp thêm nguồn Nitơ, Photphat, Kali, … ). Môi trường rắn cần được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì nhiều loại vi khuẩn phát triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi trường nhanh khô, sinh bào tử mạnh.  Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá.  Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở 121 0C/1atm/30 phút để tránh tạp nhiễm.  Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 30 0C thì tiến hành cấy giống.  Giống Sử dụng nấm mốc.Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránh nhiễm tạp.giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môi trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân giống thường để cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theo Nhóm 20Trang 20