Tài liệu Quy trình sản xuất amylase từ vi sinh vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN HỌC: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI TIỂU LUẬN: QUY TRÌNH SẢN XUẤT AMYLASE TỪ VI SINH VẬT GVDH: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang Nhóm: 09 Lớp: 02DHLTP2 SVTH gồm có: 01 - Trần Thị Chiến - 2205115008 02 - Đỗ Tuấn Hưng - 2205115221 03 - Nguyễn Thị Huyện - 2205115020 04 - Nguyễn Thị Diễm Kim - 2205115131 05 - Trần Thị Hoài Thông - 2205115059 06 - Nguyễn Thị Thơ – 2205115122 Tháng 12- 2012 1 LỜI MỞ ĐẦU Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Quá trình thủy phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hóa và giai đoạn đường hóa. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: thủy phân tinh bột bằng acid và bằng enzyme. Để thủy phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thủy phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy việc thay thế và ứng dụng enzyme để thủy phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển. Enzyme amylase đã được tìm ra đã được góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở quy mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được chiết xuất từ VSV, cụ thể là các chuẩn vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thủy phân tinh bột: năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch (malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc, ... Nguyên liệu sản xuất là gạo, bắp, khoai mì, … Đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền và có thể thấy dễ dàng ở nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. 2 PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE 1.1 Giới thiệu về enzyme Amylase 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, định nghĩa Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hoá tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Thí nghiệm này được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hoá tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hoá. Danh từ diastase là do Payen và Persor dung để gọi enzyme lúc bấy giờ. Enzyme Amylase đã được tìm ra góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Enzyme amylase được sử dụng nhiều trong sản xuất là do khả năng chịu nhiệt cao, năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Các enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: R.R` + H-OH → RH + R`OH 1.1.2 Phân loại, đặc tính, cơ chế tác dụng 1.1.2.1 Phân loại Có 6 loại enzyme được xếp vào hai nhóm lớn: Endoamylase và Exoamylase. Enzyme amylase được phân loại theo sơ đồ sau 3 Enzyme amylase Endoamylase Enzyme khử nhánh β- amylase (α- 1,4 – glucanmaltohydrolase) γ- amylase (glucose amylase) Khử gián tiếp Khử trực tiếp Pullulanase (α-dextrin 6 – glucosidase)  α-amylase Exoamylase Transglucosylase (oligo-1,6 glucosidase) Maylo-1,6glucosidase Endoamylase: α– amylase Amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội bào. α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn. 4 Enzyme khử nhánh -Khử trực tiếp (Pullulanase) Pullulanase là một trong các enzyme quan trọng nhất trong chế biến tinh bột. Enzyme này được sử dụng trên một quy mô lớn trong glucose và các ngành công nghiệp sirô maltose. Pullulanase là một loại enzyme rất mạnh cho sự thoái hóa tinh bột thành glucose hoặc maltose. Pullulanase thủy phân α-1, 6glycosidic liên kết của chuỗi phân nhánh và α-1, 4-glycosidic. -Khử gián tiếp Transglucosylase (oligo-1,6glucosidase) và Maylo-1,6-glucoside: Enzyme này thủy phân liên kết β-1,6glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn có thể chuyển hóa đường có thể lên men được.  Exoamylase β–amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) β–amylase xúc tác từ sự thủy phân các liên kết 1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch. Maltose được hình thành do sự xúc tác của β-amylase có cấu hình β. γ–amylase (glucose amylase) Glucose amylase có khả thủy phân liên kết -1,4 lẫn glucoside, ngoài ra còn có khả thủy phân liên kết -1,2 và glucoside. năng -1,6năng -1,3- 5 Glucose amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại enzyme amylase khác 1.1.2.2 Đặc tính  Đặc tính chung: Khả năng dextrin hóa: Thủy phân tinh bột --> dextrin + một ít maltoza. Dextrin có khả năng họat hóa cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme này. Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme. Tính tan: Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Cơ chất tác dụng: của enzyme amylase là tinh bột và glycogen.  Đặc tính riêng α – amylase có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động, chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt: Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu: với nấm mốc có pH từ 4.5 – 4.9, nấm sợi có pH từ 4.0 – 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4. 5 – 5.8), vi khuẩn có pH từ 5.9 – 6. 1 (pH<3 thì enzyme α – amylase bị vô hoạt trừ enzyme của Asp.Niger có pH 2.5 – 2.8). α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa cao tạo ra một lượng lớn glucose và maltose. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C (Kozmina, 1991). α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành, ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme và duy trì hoạt động của enzyme. Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn 2+, Zn2+, CO2+, Sn2+, Cr3+ thì không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase. 6 1.1.2.3 Cơ chế tác dụng α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên. Nó không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nhưng với tốc độ rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme α-amylase là quá trình đa giai đoạn. Giai đoạn 1 (dextrin hóa): Tinh bột α-amylase dextrin phân tử lượng thấp. Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa):  Dextrin phân tử thấp bị thủy phân --> tetra và trimaltose (không cho màu với iod) thủy phân rất chậm--> disaccharide và monosaccharide. -Amylose phân giải nhanh--> oligosacharide --> poliglucose (gồm 6-7 gốc glucose) bị phân cách--> mạch polyglucose colagen ngắn -->Maltose --> maltotriose --> maltotetrose.  Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. 7 PHẦN 2 TỔNG QUAN VỀ NGUỒN GIỐNG VI SINH VẬT 2.1 Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:  Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.  Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính enzyme).  Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.  Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm. 2.2 Vi sinh vật dùng để sản xuất enzyme Amylase 2.2.1 Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme Amylase Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme amylase chủ đạo. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn,còn xạ khuẩn thì ít hơn. Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus. Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsy, Endomyces cũng tạo amylase. Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa, Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm vi sinh vật khác. Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vugaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ a-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác. 8 2.2.2 Giới thiệu Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae Đặc điểm cấu trúc hình thái của Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae Condium of Aspergillus Oryzae Aspergillus Oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomyctes (năng khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7m, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus Oryzae thường dài 1-2mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergillus Oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…. Bào tử cùng thành phần môi trường 9 được sấy khô ở nhiệt độ < 50oC cho đến khi độ ẩm <8 oC, đưa vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường. Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu cả enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasae,….), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo….đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, bã sắn….chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu đen, vàng… màu do các bào tử già có màu sắc. các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mới. 2.2.3 Các phương pháp phân lập và bảo quản 2.2.3.1 Các phương pháp phân lập Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đên nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt vsv. ở những nơi giàu chất hữu cơ, hay nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thể người, động vật, nơi có nhệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhệt độ cao. VSV có khả năng thích nghi trong trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất. Thông thường để phâp lập một giống chủng vsv để thu nhận enzyme thì có 3 cách phân lập. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên Phân lập giống trong điều kiện sản xuất Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho phù hợp. mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt. Sau đây là một số ưu điểm. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme (ở quy mô sản xuất công nghiệp) với một loại enzyme thật sự mạnh. Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa vào đặc điểm này chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần. Ví dụ: nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân 10 lập vsv có khả năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm. Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hóa hơn các giống vi sinh vật hoang dại. Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu nhận của những chủng có khả năng sinh tổng hợp cao thường rất cao. Phân lập giống trong môi trường giống đã hư hỏng Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất nhiều tế bào vi sinh vật giống bị thoái hóa, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hóa. Việc phân lập lại từ nguồn gốc này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt. Phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được bảo đảm chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm. Quá trình lấy mẫu : có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rửa sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nylon và mang về phòng thí nghiệm. Tiền hành thí nghiệm phân lập  Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây  Lấy 10g mẫu đất hay mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo mẫu.  Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyền sang 1 ống nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng. 11  Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo.  Hút 0.1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển, môi trường PDA (Potato Dextro Agar )  Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày.  Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sánh xung quanh khuẩn lạc.  Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường nước khi cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.  Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông. Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (quy mô nhỏ ).  Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.  Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.  Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm. KH2PO4 1,4 MgSO4.7H2O 0,1 NH4NO3 10 FeSO4 . 7H2O 0,01 KCl 0,5 Hồ tinh bột pH=6,5 20  Phân phối khoảng 30 – 40 ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi Autoclave ở 73 - 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng / phút. Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ. Để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp. 2.2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Mục đích của bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sản xuất enzyme là đảm bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzyme và tính ổn định của hoạt tính enzyme. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như sau:  Cấy truyền và bảo quản lạnh Phương pháp dựa trên nguyên tắc là vi sinh vật sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất trong điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian này vi sinh vật có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzyme. Cách thực hiện : Ống giống vi sinh vật được cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm có môi trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống 12 dùng cho sản xuất hoặc nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản. Có thể làm thêm hai ống để tránh sai sót do thao tác đối với những người mới bắt đầu làm công tác bảo quản giống. Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điểu kiện nhiệt độ lạnh từ 4-70C. Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác này được thực hiện liên tục.  Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát Phương pháp dựa trên nguyên tắc : Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp, vi sinh vật có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trong thời gian dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc Asp.oryzae. Trước khi sử dụng, đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5%. Asp.oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất hoặc cát đã được làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường.  Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc Phương pháp dựa trên nguyên tắc bào tử nấm được giữ trong hạt ngũ cốc đã xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzyme trong thời gian dài. Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống ống nấm mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều . 2.3 Yêu cầu đối với giống vi sinh vật Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:  Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.  Giống phải cho năng suất sinh học cao.  Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. 13  Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.  Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.  Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.  Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản. Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết. Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase.Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường, tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… Là những yếu tố cơ bản quan trọng nhất. 14 PHẦN 3 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME Α- AMYLASE TỪ ASPERGYLLUS ORYZAE 3.1 Bảo quản giống Aspergyllus oryzae: -Cho cát vào ống nghiệm, tiệt trùng trong autoclave 130oC trong 30 phút. -Trộn bào tử vào cát. -Sấy chân không < 40oC (độ ẩm 5%). -Dùng parafin rắn đun chảy và đổ lên nút bông. -Thời gian bảo quản: 1 năm hoặc hơn. 3.2 Nguyên liệu: -Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất béo, 10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ 37-59%. -Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%. -Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường nuôi cấy: trấu, mạt cưa… 15 3.3 Sơ đồ công nghệ: NGUYÊN LIỆU XỬ LÝ THANH TRÙNG LÀM NGUỘI GIỐNG VSV PHỐI TRỘN NUÔI CẤY THU NHẬN ENZYME THÔ SẤY NGHIỀN MỊN TRÍCH LY THÀNH PHẨM LỌC BAO GÓI KẾT TỦA ENZYME SẤY THU NHẬN ENZYME THÔ SẮC KÝ 16 3.4 Thuyết minh quy trình: -Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mạt cưa được xử lý để loại bỏ các tạp chất. Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám gạo. -Thanh trùng: Nhiệt độ thanh trùng là 95 oC trong 60 phút. Đồng thời phải thanh trùng khay lên men. -Rải nguyên liệu lên khay có kích thước 2x3 m, độ dày 2-3 cm, dùng 3kg môi trường/khay. -Sau khi làm nguội, tiến hành cấy mốc giống với nồng độ 5-10% so với khối lượng của môi trường ở mỗi khay. -Đưa khay lên các giá đỡ -Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30oC, độ ẩm 60-65%, đồng thời phải thoáng khí. -Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô. Cần thu nhận enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm sinh bào tử là lúc quá trình tổng hợp enzyme đa yếu đi. Do đó cần một bước nuôi cấy thử nghiệm để xác định thời điểm thu nhận enzyme thô. Chế phẩm enzyme thô thu được chứa tế bào nấm, cơ chất, nước và enzyme -Để giữ hoạt tính của enzyme, sấy chế phẩm thô này ở nhiệt độ 30-40oC, độ ẩm sau sấy là 10%. -Nghiền mịn: chế phẩm enzyme thô được nghiền với cát và bột thạch anh. Cát và bột thạch anh được rửa sạch, sấy khô trước. -Trích ly: sau khi nghiền, dùng nước để trích ly. Cứ 1lít enzym thô, cho 4-5lít nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch. -Lọc: dịch sau trích ly lọc bằng lọc tiếp tuyến. -Kết tủa enzyme: kết tủa được thực hiện bằng ethanol phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym.Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Nhiệt độ từ 3-10oC và dùng 2lít ethanol cho 1lít enzyme. -Enzyme thu được là 1 hỗn hợp nhiều enzyme khác nhau như: amylase, proteinase, cellulase… Do đó, phải tiến hành sắc ký lọc gel để thu được enzyme amylase. Gel sử dụng là Sephadex G200. -Sấy: sản phẩm sau sắc ký được sấy ở nhiệt độ 30-40 oC để bảo đảm hoạt tính cho enzyme, độ ẩm sản phẩm là 5%. 3.5 a. Ưu và nhược điểm của phương pháp này: Ưu điểm: 17 Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. - Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. - Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. - Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, rất dễ xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. b. Nhược điểm: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện tích. 3.6 a. Các ảnh hưởng đến chất lượng enzyme: Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng: Nguồn dinh dưỡng Nito hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase. Hàm lượng thường dùng là 0.91% Natri Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu quả hơn so với các muối khác( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat…) Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Bảng ảnh hưởng của nguồn Nito tới sinh tổng hợp các enzyme amylase Nguồn Nito Liều lượng Hoạt động enzyme sau 6 ngày muối, % theo N nuôi đối với 100ml α-amylase Glucomyla se NaNO3 0.3 145 8000 NaNO3 0.15 26 3300 (NH4)2SO2 0.15 - - NH4NO3 0.15 98 4100 18 NH4NO3 0.3 45 4900 NH4H2PO4 0.3 5.5 8000 Ảnh hưởng của amino acid: b. - Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nito vừa là nguồn năng lượng. - Một số amino acid riêng rẻ (glutamic acid, aspatic acid...) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid, cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác trong quá trình chuyển amine hóa. - Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như: pantotenic acid, biotin, folic acid,…các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. Ngoài ra sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi. - Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một số lại có tác dụng ức chế ngược và một số khác thì không có ảnh hưởng gì cả. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: c. 2+ - Mg có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme. Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn. Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp αamylase là 0.05%. - Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzyme, đồng thời đề phosphoryl hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzyme. Các muối phospho thường được dùng với nồng độ cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng cao khi có 0.1% KH2PO4. - Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt độ vì nó là cấu tử không thể thiếu của enzyme này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác dụng của protease. Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng Ca trong môi trường là 0.01-0.05%. - Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml môi trường là sự thích hợp nhất. Ngoài các yếu tố đa lượng cần chú ý tới các yếu tố vi lượng. Chẳng hạn: coban, kẽm…và các yếu tố gây ức chế sự tổng hợp enzyme amylase như: đồng, thủy ngân,… 3.7 a. Các yếu tối ảnh hưởng đến quá trình lên men: Độ ẩm môi trường: 19 Tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển. Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt: Bảng: ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo αamylase của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt 20 giờ Phương án thí Độ ẩm nghiệm % 34 giờ 42 giờ Hoạt độ Độ amylase với ẩm canh trường % khô Hoạt độ Độ amylase với ẩm canh trường % khô Hoạt độ amylase với canh trường khô Khay để 27.8 hở 15.0 23.8 18.0 22.0 20.5 Khay đậy 46.4 nắp 20.4 42.4 32.9 42.4 36.7 Điều này cần sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kì sinh trưởng của nấm mốc và còn phụ thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi. b. Độ ẩm tương đối của không khí: Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hòa tức là 100% W đều thích hợp cho nấm mốc phát triển. trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường khỏi bị khô. c. Ảnh hưởng của không khí: Asp.oryzea phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong không khí đạt 8% d. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzyme amylase. Nhiệt đọ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme là 28-32oC. Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể nóng lên 40oC hoặc hơn. Do vậy cần gữi cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27oC và không cao hơn 36oC. e. Ảnh hưởng thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng nấm mốc Asp.oryzea có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36-42. f. Ảnh hưởng của pH: thích hợp cho Asp.oryzae là môi trường acid yếu khoảng 5,5-6,5. 20